环境科学  2017, Vol. 38 Issue (8): 3347-3353   PDF    
引用本文
韩松芳, 金文标, 涂仁杰, 陈洪一. 基于城市污水资源化的微藻筛选与污水预处理[J]. 环境科学, 2017, 38(8): 3347-3353.
HAN Song-fang, JIN Wen-biao, TU Ren-jie, CHEN Hong-yi. Selection of Microalgae for Biofuel Using Municipal Wastewater as a Resource[J]. Environmental Science, 2017, 38(8): 3347-3353.
基于城市污水资源化的微藻筛选与污水预处理
韩松芳 , 金文标 , 涂仁杰 , 陈洪一     
哈尔滨工业大学深圳研究生院, 土木与环境工程学院, 深圳 518055
收稿日期: 2017-01-13; 修订日期: 2017-03-05
基金项目: 深圳市科技创新委员会项目（JCYJ20140417172417125）
作者简介: 韩松芳(1989~), 女, 博士研究生, 主要研究方向为微藻生物能源, E-mail:hansongfang@stmail.hitsz.edu.cn
通信作者: 金文标, E-mail:jinwb@hit.edu.cn
摘要: 利用城市污水培养微藻，可在实现污水无害化处理的同时，培养微藻回收生物质能源.污水为微藻的培养提供氮、磷等营养组分和所需水源.由于城市污水含有大量的微生物，成分复杂，且不同藻种对污水的适应性与耐受性不同，因此，需要筛选出适宜于城市污水培养和高效产脂的藻种，并研究城市污水预处理方式，以使预处理后的城市污水更适于微藻的生长与产脂.本文根据课题组前期获得的藻种在城市污水中的生长与产脂情况以及对污水的净化能力筛选出适宜于城市污水培养的藻种.其中斜生栅藻（Scenedesmus obliquus）原始株与蛋白核小球藻（Chlorella pyrenoidosa）离子诱变藻株生物质与油脂产量较高，经污水培养后油脂产量分别可达0.43 g·L-1、0.33 g·L-1，且含有较多的C16~C18脂肪酸，适宜于生物柴油的制备，同时可使培养后污水中COD、NH4+-N、TN、TP的去除率分别达到86.4%、100%、94.3%、93.4%和81.8%、100%、94.9%、94.2%.对可规模化扩大的污水预处理方式进行研究，发现不同藻种所最适的污水预处理方式不同.对于耐污性能较强的斜生栅藻原始株，除去粗大悬浮物后的城市污水即可用于其培养.对于蛋白核小球藻诱变株，城市污水经沉淀、过滤联合预处理后适宜于其培养.
关键词: 微藻      城市污水      油脂      培养      预处理     
Selection of Microalgae for Biofuel Using Municipal Wastewater as a Resource
HAN Song-fang , JIN Wen-biao , TU Ren-jie , CHEN Hong-yi     
School of Civil and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology Shenzhen Graduate School, Shenzhen 518055, China
Abstract: Cultivating microalgae using municipal wastewater can achieve not only treatment of the wastewater but also recovery of algae for use as a biofuel energy source. Wastewater provides necessary nutrients, such as nitrogen and phosphorus, and water for microalgal growth. Because of the complexity of components of municipal wastewater, variety of adaptability, and tolerance to wastewater of different microalgal species, it is necessary to select a suitable microalgal species with high performance in lipid production and identify proper pretreatment of the wastewater to achieve high lipid production using municipal wastewater for algal biofuel production. Based on microalgal growth, lipid production, and clean-up performance of wastewater, we selected Scenedesmus obliquus wild strain and Chlorella pyrenoidosa mutant by ion beam implantation from a test group for the biofuel production. Laboratory test results showed that S. obliquus wild strain and C. pyrenoidosa mutant had respective lipid productions of 0.43 g·L-1 and 0.33 g·L-1, with more C16-C18 fatty acids, which were suitable for biodiesel production. The pollutant removals from the wastewater by S. obliquus wild strain and C. pyrenoidosa mutant were COD, 86.4% vs. 81.8%; NH4+-N, 100.0% vs. 100.0%; TN, 94.3% vs. 94.9%; and TP, 93.4% vs. 94.2% respectively. The two different microalgal strains required different pretreatments. After removal of large particles, the raw wastewater could be directly used for the cultivation of S. obliquus wild strain. To grow C. pyrenoidosa mutant with municipal wastewater, pretreatment procedures including precipitation followed by filtration should be employed.
Key words: microalgae      municipal wastewater      lipids      cultivation      pretreatment     

随着能源危机与环境污染的加剧, 微藻生物柴油越来越受到各国研究者的关注[1~3].就整体工艺而言, 微藻生物柴油的生产包括藻种选育、微藻培养、微藻收获、油脂提取与转脂.微藻培养是其中一个重要环节, 在微藻培养过程中, 利用淡水培养微藻需消耗大量淡水资源, 有悖于当前淡水资源紧缺的背景.同时, 营养物质的投加进一步提高了微藻的培养成本[4, 5].

城市污水中含有大量的氮、磷营养物质, 利用城市污水培养微藻, 可在水质净化的同时, 为微藻的生长提供丰富的氮、磷, 同时污水中的细菌可分解污水中的有机物产生CO2, 为微藻提供生长所需碳源.相比于利用人工配制的培养基并外加纯CO2气体进行微藻的培养, 利用城市污水培养微藻可一定程度降低微藻培养的成本, 又可依托现有污水处理厂规模化培养, 是当前解决水环境污染和能源危机的一个有效途径.目前, 此领域的大多数研究集中在利用微藻改善污水水质或者利用人工污水培养基及灭菌污水培养微藻方面, 而将实际城市污水处理与微藻培养制备生物柴油相耦合的研究报道较少[6, 7]. Mahapatra等[8]利用灭菌的城市污水培养混合藻类, 培养12 d, 微藻产率为122 mg·(L·d)-1. Ryu等[7]研究表明, 相较于灭菌的初沉池污水, 小球藻在未灭菌的城市污水中生长得更好, 微藻产率为126 mg·(L·d)-1, 油脂含量达到20.59%.

由于城市污水成分复杂, 固体颗粒含量高时, 相应的营养物质含量较高, 有利于微藻生长, 但也会增加污水浊度, 影响微藻对光的有效吸收.同时, 污水中含有大量的微生物, 微藻与细菌之间存在着互生、拮抗等复杂的相互关系[9].且不同藻种对环境需求不同, 对污水的耐受性也不同[10, 11].因此, 需要筛选出适宜于城市污水培养和高效产脂的藻种, 并对城市污水预处理方式进行研究, 以使预处理后的城市污水更适于微藻的生长与产脂.因此本研究将从课题组前期获得的斜生栅藻与蛋白核小球藻原始株及其离子注入诱变株[12]中根据其在实际城市污水中的生长与产脂情况以及对污水的净化能力筛选出适宜于城市污水培养的藻种, 并根据藻种性能研究适于微藻生长与产脂的可规模化扩大的污水预处理方式, 以期为城市污水处理与微藻生物能源耦合工艺的建立奠定基础.

1 材料与方法 1.1 藻种与培养基

试验所用微藻为购买于中科院(武汉)水生生物研究所淡水藻种库的斜生栅藻原始株(SC-W)与蛋白核小球藻原始株(CH-W)以及课题组前期经离子注入法诱变筛选的斜生栅藻诱变株(SC-M)与蛋白核小球藻诱变株(CH-M)[12], 藻种采用BG-11培养基[13]进行传代培养保藏.

试验所用城市污水取自深圳大学城市政污水井, 经潜污泵抽取后使用.污水水质见表 1.

表 1 大学城城市污水水质 Table 1 Municipal wastewater quality of Shenzhen University Town

1.2 试验方法 1.2.1 微藻培养

以BG11培养基培养处于对数生长期的微藻为种子液, 接种于600 mL城市污水, 于气泡柱式光生物反应器(直径为5 cm、长度为50 cm、容积大小约为1 L)中培养, 以相应的不加微藻的城市污水为空白对照, 使扣除空白后藻液初始吸光度D680=0.1, 于培养温度(25±1)℃, 光照强度100 μmol·(m2·s)-1, 光暗比(L:D)为12 h:12 h条件下, 连续通气培养(空气流速为120 mL·min-1, 由底部通入).每天取样测定扣除空白后藻液的D680以监测藻细胞生长情况.取培养达到稳定期的藻液测定扣除空白后藻细胞的干重、油脂产量.每组试验设3个平行对照.

1.2.2 污水预处理方法

城市污水采用以下5种预处理方式.原污水：经潜污泵除去粗大悬浮物后的原污水直接使用; 沉淀污水：原污水沉淀2 h后取上清液使用; 过滤污水：原污水用定性滤纸过滤后使用; 沉淀+过滤污水：原污水先沉淀2 h处理后, 上清液用定性滤纸过滤后使用; 灭菌污水：原污水经高压蒸汽灭菌后使用.

1.3 分析方法 1.3.1 微藻生长与干重的测定

通过测定D680来监测微藻的生长情况.微藻的干重采用重量法测定, 10 mL藻液经预称重(W1) 的微孔滤膜(Φ0.45 μm)过滤、洗涤, 于105℃下烘至恒重(W2), 不加微藻的空白对照组干重为W0, 微藻干重DW (g·L-1)的计算公式如下：

 1.3.2 微藻油脂产量与脂肪酸组成的测定

微藻油脂提取采用氯仿甲醇共溶剂提取法[14].待提取结束后, 收集氯仿相, 转移至预称重的锡纸盘中, 待有机溶剂挥发完全后, 于80℃烘箱中烘至恒重, 得到微藻油脂产量, 微藻细胞油脂含量为微藻油脂产量与微藻干重的百分比.

微藻脂肪酸分析, 首先对提取的油脂进行甲酯化[15], 将5 mL藻液中脂肪酸转化成相对应的脂肪酸甲酯.采用赛里安456-GC气相色谱仪进行分析, 色谱柱为BR-2560柱, 100 m×0.25 mm(内径)×0.20 μm(膜厚), FID检测器, 分流方式进样, 分流比为30:1, 进样量为1 μL.

1.3.3 常规水质指标测定

污水水质采用国标法[16]测定.其中微藻培养结束后出水水质, 将微藻藻液于8 000 r·min-1离心10 min后, 收集上清液测定. TP、TN、NH4+-N、COD的测定分别参照GB 11893-89、GB 11894-89、GB 7479-87、GB 11914-89.

1.3.4 数据分析方法

数据采用统计软件SPSS 21.0进行单因素方差分析(one-way ANOVA), 采用LSD法进行统计检验(P＜0.05).

2 结果与讨论 2.1 适于城市污水培养的藻种筛选 2.1.1 城市污水中不同藻种的生长情况

将4种微藻CH-W、CH-M、SC-W、SC-M按照初始浓度D680=0.1分别接种到城市污水原污水中.每天测一次D680值监测其生长情况(图 1).由图 1可知, CH-M、CH-W、SC-W藻种在污水中生长情况良好, 具有较强耐污性能, D680最高可达1.5以上, 其中CH-M藻种D680最高.而SC-M藻种虽能保持持续生长, 但生长速率较低.后期的观察发现, CH-W与CH-M分别于第9d进入快速衰亡期, 而SC-W、SC-M均可以长时间保持在生长稳定期.从稳定性培养的角度看SC-W、SC-M更具有优势.

图 1 微藻在城市污水中的生长情况 Fig. 1 Growth of microalgae in the municipal wastewater

2.1.2 城市污水中不同藻种的产脂情况

取达到稳定期(第8 d)的微藻测其干重与油脂产量, 并计算其油脂含量, 结果如图 2所示.对4种微藻的油脂进行甲酯化反应, 通过对生成的脂肪酸甲酯进行气相色谱分析, 考察4种微藻脂肪酸组成的差异, 结果如表 2所示.

图 2 微藻在城市污水中的产脂情况 Fig. 2 Lipid production of microalgae in the municipal wastewater

表 2 藻株脂肪酸分析1)/% Table 2 Fatty acid profiles of the microalgal strains/%

由图 2可知, 利用城市污水培养微藻, 微藻干重由大到小依次为SC-W、CH-M、SC-M、CH-W, 且彼此有显著性差异(P < 0.05).该排序与D680值排序不同, 主要由于藻种差异, 小球藻个体较小, 单个藻体质量较小, 斜生栅藻个体较大, 单个藻体质量大, 所以虽然D680值CH-M大于SC-W, 但微藻干重SC-W藻种大于CH-M藻种.微藻油脂含量由多到少依次为：CH-W、SC-W、CH-M、SC-M, 前三者无显著性差异, 但明显高于SC-M的油脂含量.两者综合而言, 所得微藻油脂产量大小依次为：SC-W、CH-M、CH-W、SC-M, 分别为0.43、0.33、0.27、0.17 g·L-1, 且彼此有显著性差异(P < 0.05).因此SC-W藻种在4种微藻中油脂产量最高, 是其他3种微藻油脂产量的1.3、1.6、2.5倍.从该试验结果也可以看出, 经离子注入诱变后的小球藻能较好地保持其优良性能, 而经离子注入诱变后的斜生栅藻随着时间推移, 藻种性能发生了退化.

由表 2可知, 4种微藻在脂肪酸组成上均以C16、C18为主, 为绿藻中常见脂肪酸[17, 18]. Song等[19]和Ma等[20]的研究表明, 适合制备生物柴油的原料应含有较多的C16~C18脂肪酸, 主要包括十六烷酸(C16:0)、十八烷酸(C18:0)、十八烯酸(C18:1)、十八碳二烯酸(C18:2)、十八碳三烯酸(C18:3). 4种微藻中该5种脂肪酸在总脂肪酸中的含量占比分别可达89.34%、90.55%、97.46%、94.81%, 适宜于作为制备生物柴油的原料.同时, 脂肪酸甲酯的结构会对生物柴油的性能(十六烷值、低温流动性、氧化安定性等)产生影响[21].有研究表明, 生物柴油的十六烷值随着饱和脂肪酸甲酯含量的增加而增加, 多不饱和脂肪酸甲酯含量的增加而降低[22].生物柴油低温流动性随着饱和脂肪酸甲酯尤其是长碳链质量分数增高而变差.生物柴油的氧化安定性随着不饱和脂肪酸不饱和度增高而变差.高品位的生物柴油应尽量少地含有多不饱和脂肪酸甲酯和饱和脂肪酸甲酯, 尽量多地含有单不饱和脂肪酸, 以改善其十六烷值、低温流动性、氧化安定性、运动黏度等性能[23].根据欧盟对生产生物柴油原料的严格要求(EN 14214), 亚麻酸甲酯(C18:3) 含量需不超过12%, 多不饱和甲基酯(≥4个双键)含量需不超过1%, 以改善生物柴油的氧化安定性.从表 1中可以看出, 除了SC-M的C18:3含量略大于12%, 其它均小于12%. 4种微藻聚不饱和甲酯(≥4个双键)含量均不超过1%.值得一提的是, 微藻油脂的脂肪酸组成并非是固定不变的, 脂肪酸组成会随着培养条件以及油脂提取条件的变化而变化[24].因此, 可以通过培养条件优化来改善微藻油脂的脂肪酸组成, 提高其中单不饱和脂肪酸甲酯的含量, 以制备更高品位的生物柴油.

2.1.3 城市污水培养微藻后污染物去除情况

城市污水培养微藻后, 污水中的COD、NH4+-N、TN、TP去除情况如表 3所示.从中可知, 微藻可以起到很好的水质净化作用, 尤其以CH-M藻种与SC-W藻种污水处理能力最佳, 可使污水中COD去除率达到80%以上, TN、TP去除率达到93%以上.由于微藻培养过程保持碱性环境, 氨氮部分变成氨气, 在吹脱作用下从水中去除, 因此NH4+-N的去除效果最好, 微藻培养结束后污水中已检测不到[25, 26].

表 3 城市污水培养微藻后污染物的去除情况/% Table 3 Pollutant removal rates from the municipal wastewater after microalgal cultivation/%

综合而言, SC-W与CH-M藻种在城市污水中具有较好的生长与产脂性能, 同时对污水有较好的净化效果, 为适宜于城市污水培养的高效藻种.

2.2 城市污水培养微藻污水预处理 2.2.1 沉淀、过滤预处理

城市污水采用原污水、沉淀污水、过滤污水、沉淀+过滤污水这4种预处理方式, 预处理后的污水水质情况如表 4所示.将SC-W、CH-M按照初始浓度D680=0.1分别接种到不同预处理方式处理后的城市污水中, 取稳定期的藻液测其微藻干重, 油脂产量并计算其油脂含量.所得结果如图 3、图 4所示.

图 3 SC-W在不同预处理方式城市污水中产脂情况 Fig. 3 Lipid production of SC-W in the municipal wastewater with different pretreatments

图 4 CH-M在不同预处理方式城市污水中产脂情况 Fig. 4 Lipid production of CH-M in the municipal wastewater with different pretreatments

表 4 城市污水预处理后水质/mg·L-1 Table 4 Water quality of the wastewater after pretreatment/mg·L-1

由表 4可知, 城市污水中COD含量经沉淀处理后变化不大, 经过滤、沉淀与过滤联合处理后降低.城市污水中NH4+-N、TN、TP含量经沉淀、过滤处理后有所降低, 经沉淀与过滤联合处理后进一步降低.总体而言, 原污水中氮、磷等营养物质较为丰富, 但悬浮物也较多, 随着处理程度的加深, 悬浮物减少, 但污水中的营养物质损耗也会相应增加.

由图 3、图 4可知, 不同的微藻具有不同的耐污性能, 对污水预处理程度的要求也不同. SC-W在原污水中生物质产量最高, 当使用沉淀、过滤单种预处理方式处理污水后, 会造成微藻干重的降低, 当使用沉淀与过滤联合预处理方式处理污水后, 会造成微藻干重的进一步降低.由此可以看出斜生栅藻具有较强的耐污性能, 当污水中营养物质越丰富时, 生长越好.微藻油脂产量由微藻生物质产量和微藻油脂含量共同决定, 四种预处理方式中, 原污水预处理方式微藻生物质产量最高, 微藻油脂含量较高, 所以总的微藻油脂产量最高, 为0.19 g·L-1.因此, 城市污水可不经沉淀、过滤处理, 直接除去粗大悬浮物后作为培养基用于SC-W的培养.而CH-M在原污水中的干重最低, 当经沉淀、过滤单种预处理方式处理污水后, 干重有所提高, 当使用沉淀与过滤联合预处理方式处理污水后干重最高. 4种预处理方式中, 沉淀与过滤联合处理方式, CH-M油脂产量显著高于其它3组(P < 0.05), 为0.16 g·L-1.由此可以看出, 小球藻比较喜欢相对洁净的环境, 当污水中浊度越低时, 生长越好.试验中发现污水浊度较高试验组, CH-M更易于沉淀, 因此不利于其与营养物充分接触, 会对其生长产生影响.因此, 城市污水经沉淀+过滤预处理后更适合作为培养基用于CH-M的培养.

2.2.2 灭菌预处理

微藻与细菌之间存在互生、拮抗等复杂的相互关系.菌藻的互生关系表现在微藻通过光合作用释放出氧气供给细菌进行代谢活动, 而细菌将水中有机污染物降解转化为二氧化碳、无机氮、磷化合物等, 为微藻提供光合作用所需的碳源和营养, 如此循环, 形成藻菌之间互生的关系.菌藻拮抗关系表现在, 微藻能够产生抑制细菌生长的抗生素类物质, 且微藻生长会导致pH与溶解氧的升高, 从而抑制某些细菌的生长等, 而细菌也可能通过释放可溶解纤维素的酶等胞外物抑制甚至裂解藻细胞, 或在生长过程中, 附着于反应器内壁, 阻碍光线的透射, 从而影响微藻的光合生长.为消除细菌对微藻的影响, 文献中常对污水采取灭菌预处理.但灭菌预处理也存在着成本高、难以扩大的问题.

对城市污水进行灭菌预处理, 以原污水作为对照.将SC-W、CH-M按照初始浓度D680=0.1分别接种到不同预处理方式处理后的城市污水中, 取稳定期的藻液测其微藻干重, 油脂产量并计算其油脂含量.所得结果如图 5、图 6所示.

图 5 SC-W在不同预处理方式城市污水中产脂情况 Fig. 5 Lipid production of SC-W in the municipal wastewater with different pretreatments

图 6 CH-M在不同预处理方式城市污水中产脂情况 Fig. 6 Lipid production of CH-M in the municipal wastewater with different pretreatments

由图 5、图 6可知, 与不同的微藻具有不同的耐污性能相似, 灭菌对不同微藻的生长与产脂的影响也不同.耐污性能较强的SC-W在原污水中生物质与油脂产量高于灭菌污水中的生物质与油脂产量, 油脂含量两者相差不大, 灭菌组略高.故SC-W在原污水中油脂产量较高主要归因于其生物质产量较高, 说明城市污水中的细菌对SC-W的生长有促进作用, 该结论与Ryu等[7]所得结论一致.而CH-M在灭菌污水中生物质产量较高, 说明城市污水中的细菌对CH-M的生长有一定的抑制作用.灭菌组与原污水组的油脂产量无显著性差异.

综合考虑微藻在不同污水预处理方式下的生物质与油脂产量及污水预处理的成本与可操作性.对于SC-W, 除去粗大悬浮物后的原污水可以不经过任何处理, 直接用于SC-W的培养, 该结果对于低成本的微藻培养十分有利.对于CH-M, 沉淀+过滤预处理、灭菌预处理方式下, CH-M的生物质产量较高, 且沉淀+过滤预处理方式下, CH-M油脂产量略高于灭菌预处理(P < 0.05).同时考虑到污水灭菌处理的高成本、难以扩大, 原污水可经沉淀+过滤预处理后用于CH-M的培养.

3 结论

(1) 斜生栅藻、蛋白核小球藻原始株及经离子注入诱变的诱变株均可在实际城市污水中生长.其中斜生栅藻原始株、蛋白核小球藻原始与诱变株生长情况较好, D680可达1.5以上, 斜生栅藻原始与诱变株生长稳定性较好, 可较长时间保持在稳定期.

(2) 斜生栅藻原始株与蛋白核小球藻诱变株生物质与油脂产量较高, 且含有较多的C16-C18脂肪酸, 适宜于生物柴油的制备.经离子诱变后的蛋白核小球藻能较好地保持其优良性能, 而经离子诱变后的斜生栅藻随着时间推移, 藻种性能发生了退化.

(3) 微藻可以起到很好的水质净化作用.尤其以蛋白核小球藻诱变株与斜生栅藻原始株的污水处理能力最佳, 可使污水中COD去除率达到80%以上, TN、TP去除率达到93%以上.其中NH4+-N的去除效果最好, 微藻培养结束后污水中已检测不到.

(4) 不同藻种所最适的污水预处理方式不同.综合考虑微藻在不同污水预处理方式下的生物质与油脂产量及污水预处理的成本与可操作性, 对于耐污性能较强的斜生栅藻原始株, 除去粗大悬浮物后的原污水可直接用于其培养.对于蛋白核小球藻诱变株, 经沉淀+过滤预处理后的城市污水适宜于其培养.

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