环境科学  2017, Vol. 38 Issue (8): 3339-3346   PDF    
引用本文
孟婷, 杨宏. 高效反硝化菌和包埋填料性能及微生物群落分析[J]. 环境科学, 2017, 38(8): 3339-3346.
MENG Ting, YANG Hong. Analysis of High-efficiency Denitrifying Bacteria and Embedding Filler Performance and Microflora[J]. Environmental Science, 2017, 38(8): 3339-3346.
高效反硝化菌和包埋填料性能及微生物群落分析
孟婷 , 杨宏     
北京工业大学建筑工程学院, 北京市水质科学与水环境恢复工程重点实验室, 北京 100124
收稿日期: 2017-01-08; 修订日期: 2017-03-15
作者简介: 孟婷(1992~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为微生物水处理技术, E-mail:mengting2@yeah.net
通信作者: 杨宏, E-mail:yhong@bjut.edu.cn
摘要: 为考察高效反硝化细菌及其包埋填料对低温、低底物浓度的适应性和恢复性，实验采用2个条件（适宜、不利）、3个阶段（D1、D2、D3），探究二者的反硝化能力，即：将初始适宜条件下培养的高效反硝化细菌[300 mg·（L·h）-1]置于不利条件下运行（D1），反硝化性能稳定后将其包埋，仍置于不利条件下运行（D2），90 d后恢复到适宜条件（D3）.结果表明分别经过17 d和16 d的运行，反硝化细菌和包埋填料在D1、D2阶段的速率最终稳定在5.4 mg·（L·h）-1、4.8 mg·（L·h）-1，说明细菌及其包埋填料能够适应低温、低底物的不利条件；在D3阶段发现，经过12 d运行填料的反硝化速率就可达到300 mg·（L·h）-1，表明其具有快速的自我恢复能力.利用扫描电镜分析包埋填料的内外结构，发现其内外结构均利于细菌生长代谢和传质.高通量测序分析结果表明，D2阶段的优势菌属仍为具有反硝化功能的Pseudomonas、Thauera、Gelidibacter，因而证明了细菌在不利条件的适应性；D3阶段包埋填料的优势菌属Thauera、Petrimonas、Pseudomonas，与初始适宜条件下培养的高效反硝化细菌的优势菌属完全相同，这也充分证明了细菌包埋填料具有良好的恢复能力.
关键词: 高效反硝化细菌      包埋填料      性能      群落组成      扫描电镜     
Analysis of High-efficiency Denitrifying Bacteria and Embedding Filler Performance and Microflora
MENG Ting , YANG Hong     
Key Laboratory of Beijing for Water Quality Science and Water Environmental Recovery Engineering, College of Architectural Engineering, Beijing University of Technology, Beijing 100124, China
Abstract: In order to study adaptability and recovery capability of high-efficiency denitrifying bacteria and their embedding filler to low temperature and low substrate concentration, a test was performed under two conditions (favorable and unfavorable) and three stages (D1, D2, and D3) to explore the denitrifying capability of the bacteria. The favorable condition was a reacting temperature of 30℃, a nitrate concentration of 300 mg·L-1, and a C/N ratio of 10; and the unfavorable condition was a reacting temperature of 4℃, a nitrate concentration of 30 mg·L-1, and a C/N ratio of 5. In stage D1, high-efficiency denitrifying bacteria [300 mg·(L·h)-1], which were cultured at favorable condition, were placed under the unfavorable condition. In stage D2, the bacteria were embedded after the denitrifying performance was stable, and then this embedded filler was placed under the unfavorable condition and recovered in the favorable condition (D3) after 90 days. The results show that the denitrification rates of stages D1 and D2 finally stabilized at 5.4 mg·(L·h)-1 and 4.8 mg·(L·h)-1, respectively, after operation for 17 d and 16 d, indicating that the bacteria and their embedding filler adapted to the unfavorable conditions of low temperature and low substrate concentration. In stage D3, the denitrifying rate of the filler reached 300 mg·(L·h)-1 after operation for only 12 d, indicating that the filler had rapid self-recovery capability. Scanning electron microscopy (SEM) was utilized to analyze the internal and external structures of the embedding filler and it was determined that both the internal and external structures were favorable for bacterial growth metabolism and mass transfer. The high-throughput sequencing analysis results show that the dominant genera in stage D2 were still Pseudomonas, Thauera, and Gelidibacter, which have denitrifying functions, thereby indicating adaptability of the bacteria under the unfavorable condition. The dominant genera Thauera, Petrimonas, and Pseudomonas of the embedding filler in stage D3 were identical to the dominant genera of the high-efficiency denitrifying bacteria cultured under the initial favorable condition, which also showed that the bacteria embedding filler had good recovery capability.
Key words: high-efficiency denitrifying bacteria      embedding filler      performance      microflora      scanning electron microscopy (SEM)     

有研究表明, 在适宜的温度、pH、碳源充足等条件下, 反硝化细菌可表现出较好的反硝化性能[1~3]; 而当其处于不利环境中时, 如：低温[4, 5]、低底物浓度(低氮[6, 7]、低碳氮比[8, 9]), 则有可能导致系统的崩溃[10~15].

目前污水厂在实际运行过程中, 尤其是我国北方冬季, 温度是首要影响因素, 研究表明温度对反硝化细菌的影响大于其他细菌[16, 17], 当温度低于15℃时, 反硝化速率明显降低[18], 低于10℃时, 反硝化作用将停止, 因此污水厂为保证冬季反硝化处理效果, 需额外添加低温功能菌, 导致加大了运行成本[19]; 其次, 低底物浓度也会影响污水厂的运行, 一方面由于反硝化反应呈1级反应动力学[5, 6], 氮浓度越高, 反应速率越快, 因此低氮条件会加大处理难度, 另一方面低碳氮比已成为污水厂反硝化处理普遍面临的问题, 特别是南方污水厂, 额外投加碳源同样会加大运行成本[20, 21].因此, 若能驯化培养出适应低温、低氮、低碳氮比的不利环境又能在适宜环境中快速恢复性能的高效反硝化细菌, 将会避免因污水厂季节性反复更换反应池中细菌所带来的高成本, 保证低底物浓度下的反硝化速率, 缩短污水在反应器中的停留时间, 降低运行成本.

包埋固定化是很好的细菌截留方法[22, 23], 在现有的研究中, 有很多针对于包埋方法的改善[24, 25], 其中, 基于网状载体的固定化包埋方法[24]价格低廉, 适合于工程应用, 且传质效果和整体稳定性好, 易于细菌生长繁殖和长期使用.在现有的包埋固定研究中, 大多针对于硝化菌、厌氧氨氧化菌等[26~29], 而针对反硝化细菌的包埋研究鲜见报道; 基于网状载体的固定化包埋方法是较新型的包埋方法, 应用于硝化菌、厌氧氨氧化菌的研究仍较少, 目前尚无人将其应用于异养反硝化细菌.

因此, 若将上述具有高适应性、高恢复性的高效反硝化细菌制作成包埋填料, 将会最大限度截留高效反硝化细菌, 减少基建成本和运行管理成本, 同时, 该包埋方法的稳定性将保证包埋填料的寿命, 从而使其更简便、更持久地发挥反硝化作用, 具有更好的工程应用前景及重复利用性.

本实验采用实验室在适宜条件下培养的稳定、高效的反硝化细菌作为种泥, 以污泥发酵液为碳源, 利用低温、低底物浓度的不利条件, 考察反硝化细菌的调节适应性, 并将其制作成包埋填料再次返回到适宜条件中, 考察它的自我恢复能力, 同时观察包埋填料在运行过程中的稳定性, 利用扫描电镜技术观察分析包埋填料的内部结构和外表面; 并通过高通量测序的方法, 分析细菌数量及种群结构的改变, 以期为污水处理厂实现技术提升提供有力的理论基础和技术支持, 对水资源的再利用有着十分重要的意义.

1 材料与方法 1.1 实验方法 1.1.1 污泥来源

实验的种泥取自实验室稳定、高效的反硝化反应器, 种泥的反硝化速率为300 mg·(L·h)-1.

1.1.2 实验条件设计及分阶段

整个实验采用了2个条件3个阶段.

实验采用的两种不同反应条件分别为适宜条件和不利条件, 详细参数信息见表 1.在适宜条件下, 中高温和充足的底物有利于反硝化细菌生长[1~3].而在不利条件下, 综合了低温和低底物浓度(低氮、低碳氮比)两方面影响, 其中, 实验所用碳源为发酵液, 发酵液中并非全部都是易于吸收利用的有机物[21], 导致实际C/N小于5, 因此反硝化细菌生长环境极为苛刻.

表 1 实验各条件 Table 1 Experimental conditions

实验初始阶段(D0)为实验室在适宜条件下成功培养的稳定、高效的反硝化细菌, 本实验3个阶段为：D1、D2、D3, 具体反应条件如表 2所示.

表 2 实验各阶段 Table 2 Experimental stages

1.1.3 反硝化细菌及包埋填料性能研究实验

实验运行装置采用1只1 L锥形瓶作为反应器, 实验用水采用人工配水, 即在自来水中加入一定量的氮源(NO3--N)和碳源, NO3--N由硝酸钾提供, 碳源由污水厂浓缩池污泥制取的发酵液提供(图 1).

图 1 发酵液制备方法 Fig. 1 Preparation method of fermentation liquor

为保证与原反应器具有相同的悬浮污泥质量浓度(3 426 mg·L-1), 向1L锥形瓶中添加300 mL富集培养的高效反硝化污泥, 再加实验配水至刻线.实验采用序批式运行, 反应周期为1 h.

实验分为4个部分：第一部分为D1阶段, 考察不利条件(低温、低氮、低碳氮比)对高效反硝化细菌的影响; 第二部分为D2阶段, 以由D1阶段的细菌制成的包埋填料为研究对象, 考察在不利环境下包埋对细菌活性的影响以及包埋填料稳定性和传质性等性能; 第三部分为D3阶段, 考察高效反硝化细菌经过不利条件后, 在适宜条件中的恢复情况以及包埋填料的稳定性和传质性等性能; 第四部分采用高通量测序对初始适宜条件(D0)到不利条件(D2)再到适宜条件(D3)这一过程进行微生物群落组成和变化分析.

1.2 分析方法

根据标准分析方法测定pH、NH4+-N、NO3--N、NO2--N、COD、温度, 并且每个样品均一式三份.实验中的pH采用上海三信PHS-3C型pH计测定; NH4+-N采用上海美谱达UV-1600PC紫外可见分光光度计测定; NO3--N和NO2--N采用上海欣茂722可见分光光度计测定; COD采用北京连华科技COD快速测定仪测定; 温度采用温控器探头测定.

1.3 包埋方法

称取20 g聚乙烯醇(PVA)溶于160 mL超纯水中, 在121℃高温下完全溶化, 冷却至室温; 加入60 g经10 000 r·min-1离心5 min后所得的浓缩污泥, 搅拌均匀; 混匀后刷到网格载体上; 随后放置到饱和硼酸溶液中进行第一次交联, 交联时间为2 h; 然后取出包埋填料, 调节饱和硼酸溶液的pH至9, 再将包埋填料放置到饱和硼酸溶液中进行第二次交联, 交联时间仍为2 h; 完成第二次交联固定后, 取出包埋填料, 用超纯水洗净, 即完成全部固定过程[24].

1.4 DNA提取及定性PCR

本实验中样本MT2、MTA、MTD分别取自：初始阶段(D0)、不利条件阶段(D2)、适宜条件阶段(D3). MTA、MTD样本属于包埋填料样本, 需经过液氮碾磨预处理, 随后与MT2样本一起利用土壤DNA快速提取试剂盒(Bio101, Vista, CA)从200~500 mg样本中提取DNA.采用NanoDrop 2000分光光度计测量DNA浓度.

PCR是一种用于放大扩增特定的DNA片段的分子生物学技术, 定性PCR即常规PCR, 循环周数较多, 通过产物条带亮度反映有无或强弱.实验采用Sensoquest LabCycler PCR仪进行PCR扩增. 16S rRNA基因扩增采用引物集340F-805R检测全部细菌, 反应体系及升温程序见文献[30].

1.5 高通量测序过程

针对细菌16S rRNA的V4区扩增及测序的引物为F端：aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacg acgctcttccgatct; R端：测序引物+barcode+测序引物：caagcagaagacggcatacgagatXXXXXXgtgactggagttca gacgtgtgctcttccgatct.采用Illumina HiSeq 2500 PE250进行测序, 针对测序数据使用MEGAN软件进行环境微生物的16S分析, 将得到的序列按照一定的阈值进行归类, 得到多个序列聚类操作分类单元(OTUs), 根据OTUs结果进行多样性的计算分析, 最后对分析结果进行可视化, 使信息更容易解释.

2 结果与讨论 2.1 高效反硝化细菌性能

不同阶段的反硝化细菌的性能如图 2所示.将D0初始阶段下快速培养的高效反硝化细菌, 放置到D1阶段下, 从图 2(b)中可清晰地得到, 起始的反硝化速率基本为零, 说明不利的生长环境给细菌带来了较大的冲击, 严重影响了细菌活性; 直到第8 d, 开始有增长趋势, 说明高效反硝化细菌开始适应不利环境; 在第17 d, 反硝化速率基本稳定, 最终达到5.4 mg·(L·h)-1左右, 体现出较好的反硝化能力, 此时成功验证了高效反硝化细菌可适应低温等不利条件.

图 2 不同阶段的反硝化速率及D2阶段的进出水COD浓度 Fig. 2 Denitrification rates under different conditions and COD concentrations of influent and effluent for stage D2

在D2阶段, 由图 2(b)可看出包埋过程对反硝化细菌活性造成了一定的影响, 经过16 d的培养, 活性恢复并稳定到4.8 mg·(L·h)-1, 很明显, 包埋后活性仅为活性污泥的89%, 究其原因, 由于不利条件下细胞活性低于适宜条件, 因此放大了传质对细菌的影响, 导致包埋后细菌的处理能力难以达到包埋前的效果.但这与现有低温的不利条件下的研究[4, 12, 13]相比仍具有较高的反硝化速率, 对于保证不利条件下的正常运行具有很高的应用价值.另外, 包埋填料相比较活性污泥状态, 具有高效菌保留、建设投资少、运行管理方便等优势.总之, 虽在不利条件下, 包埋填料的反硝化效果略低了0.6 mg·(L·h)-1, 但对实际应用并无影响, 同时包埋对高效菌的实际工程应用提供了更大的可能.此时也成功验证了包埋方法在不利环境中的可行性.

此外, 如图 2(b)所示, “A-B”阶段的反硝化速率变化趋势与出水COD质量浓度的变化趋势[图 2(c)]相一致, 考虑包埋后“A-B”阶段的出现是由于包埋填料PVA的部分溶出, 增大了反应器内的COD质量浓度.从中可得出, 要想在包埋后不影响反硝化效果, 可采取提高COD质量浓度的方式.

由图 2(a)可知, 包埋填料在D2阶段稳定运行90 d后, 放置到D3阶段, 经过12 d的培养, 细菌反硝化速率即可恢复到300 mg·(L·h)-1, 而D0阶段培养高效反硝化细菌也需11 d时间, 说明高效反硝化细菌长期处于不利条件后, 仍具有很高的活性恢复能力.此时成功验证了高效反硝化细菌的自我恢复能力.这对于实际工程应用中的“一条多用”(包埋填料为条状, 如图 3所示)提供了有利条件.

图 3 实验结束后包埋填料实物 Fig. 3 Photograph of the embedding packing after the test

2.2 包埋填料性能

由2.1节分析可知, 在D2阶段, 一方面是较低的底物浓度和温度影响了包埋填料的传质性能, 另一方面是由于在不利条件下细菌本身活性受限, 放大了传质性能的影响, 导致该条件下细菌的反硝化速率相比较D1阶段降低了0.6 mg·(L·h)-1; 在D3阶段, 细菌的反硝化速率达到D0阶段同一水平, 说明了包埋过程对细菌活性的损害已经完全恢复, 同时也说明了包埋填料在适宜条件下反硝化过程不受传质性能的影响, 具有较好的传质性能.

如图 3所示, 包埋填料是包埋液(PVA与浓缩污泥的混合液)与中间的网格材料的铆固结构体, 这种结构具有较高的稳定性, 同时, 实验证明包埋填料在反应器中运行100多天后, 并未出现生物膜脱落的现象, 表明包埋填料具有较高的稳定性, 对于包埋填料的长期使用提供了可能, 增加了实际工程应用价值.

另外, 包埋填料内部与外表面的扫描电镜结果如图 4所示.如图 4(a), 包埋填料内部存在大量的供细菌附着生长的骨架结构以及可用于传质和排气的通道; 如图 4(b), 包埋填料多孔的外表面同样保证了底物和产物输送的畅通.综上可知, 包埋填料为细菌生长代谢提供了良好的环境.这种多孔的结构在一定程度上也验证了包埋填料具有较好的传质性能.

图 4 包埋填料的扫描电镜结果 Fig. 4 Scanning electron micrographs of the embedding packing

2.3 微生物群落丰富度和多样性的影响

利用高通量测序研究不同条件下反硝化菌群的变化.结果表明, 有165 480条有效序列(MT2:55209, MTA:55152, MTD:55119), 以及被分为6997 OTUs (表 3).

表 3 各个样品的多样性统计 Table 3 Diversity statistics for each sample at confidence cutoff level of 0.8

每个样本的α多样性估计函数见表 3, 所有样本覆盖值都超过98%, 表明测序深度已经基本覆盖到样本中所有的物种.随着条件的改变OTUs从1 750升高到2 779, 样本MTD中的OTU数量最大. MTD的Chao1(估计群落中含OTU数目的指数)和ACE指数(菌群丰富度指数, 用来估计群落中含有OTU数目的指数)最大, 表明适宜条件下包埋填料样本具有最大的丰度.而且, Shannon多样性指数和Simpson多样性指数(反映样本中微生物多样性的指数)具有同样的变化趋势, 随着条件的变化, Shannon多样性指数和Simpson多样性指数分别从6.03、0.931升高到7.68、0.979, 表明适宜条件下包埋填料具有最大的细菌多样性.

从初始阶段(D0)到不利条件阶段(D2)的过程, D2的丰度和多样性均大于初始阶段D0, 可能是系统应对低温、低底物浓度等不利条件做出的反应; 从D0~D2再到适宜条件阶段(D3)的过程, D3的丰富度(OTUs, Chao1和ACE)和多样性(Shannon和Simpson)最高, 可能是因为环境适宜的条件下有利于菌群的生长繁殖, 同时也是抵御一系列环境改变所做出的最终反应.

2.4 细菌群落变化

相对丰度的改变表明了微生物种群的不同, 图 5中, 3个样本的有效序列被定义为两个不同的能级分布(门和属).在门级(图 5), 共有6个类群, 其中Proteobacteria、Bacteroidetes和Firmicutes在整个条件变化过程中始终存在, 并且处于优势地位.一般来说, 不同条件下的微生物群落结构差异较大.如图 5所示, 很明显, 随着生存条件的改变, 系统中的微生物群落结构出现了演替.在这个过程中, Proteobacteria逐渐地减少(65.8%~35.5%), 而Bacteroidetes逐渐地增多(19.1%~34.6%); 当从适宜条件变为不利条件时Firmicutes出现了明显的下降(13.4%~5.4%), 而从不利条件重新变为适宜条件时又出现了明显的增长(5.4%~20.0%).这些都说明了环境条件的变化会带来细菌群落结构的差异, 这是微生物对环境适应性的体现.此外, 从图 5还可以看出, 在不利条件下系统中的优势种群仍然是以反硝化功能为主导的细菌, 这充分证明了细菌对环境良好的适应能力.

图 5 细菌群落的phylum能级分布分类 Fig. 5 Taxonomic classification of the bacterial communities at the phylum level

为了深入研究细菌种群的改变, 在属级水平下对每个样本的相对丰富度进行分析, 见表 4.优势菌属是保证反硝化处理能力的根本, 由表 4可见, D0阶段的优势菌种为Thauera、Pseudomonas、Petrimonas, D2阶段的优势菌种为Pseudomonas、Thauera、Gelidibacter, D3阶段的优势菌种为Thauera、Petrimonas、Pseudomonas. D0和D3阶段的优势菌属虽存在数量上的差别, 但种类相同, 由此证明在D3阶段系统中的微生物种群已经得到了恢复, 这也解释了D3阶段反硝化速率得以快速至300 mg·(L·h)-1的原因.此外通过对比还发现, 与D0、D3阶段相比, D2阶段中的Gelidibacter、Flavobacterium和Moheibacter出现了明显的增长, 其中, Gelidibacter是一种寒性细菌, 它在不利条件下的丰富度达到了3.96%.正是由于这些细菌的增长补充了系统的反硝化能力, 也充分展现了种群间的差异性, 体现了细菌应对环境改变的适应性.

表 4 属级的细菌群落分类1)/% Table 4 Taxonomic classification of the bacterial communities at the genus level/%

此外, 微生物群落的Heatmap图用颜色变化来反映数据信息, 它可以直观地将数据值的大小以定义的颜色深浅表示出来, 将高丰度和低丰度的物种分块聚集, 通过颜色梯度及相似程度来反映多个样品在各分类水平上群落组成的相似性和差异性(图 6).在D0阶段, MT2中Thauera(32.94%)是最大种属, Pseudomonas(32.34%)和Petrimonas(9.54%)也是较大种属.然而, 不利条件下, Thauera和Petrimonas相对丰度分别明显减少至5.85%和2.31%, Pseudomonas相对丰度(21.36%)有一个相对较小的下降.这可能由于反应器中Thauera、Pseudomonas和Petrimonas存在相互竞争, Thauera和Petrimonas与Pseudomonas相比没有任何优势.相反, 恢复到适宜条件中, Thauera和Petrimonas相对丰度分别增加至12.47%和10.85%, 并且Thauera重新成为优势菌种, 表明在适宜条件下, Thauera发挥了主要的反硝化作用.有意思的是, 恢复到适宜条件中, Pseudomonas相对丰度明显减少至5.92%, 考虑D0和D3阶段的Pseudomonas是同属不同种, 待进一步深入研究.

图 6 样本在属水平的菌落丰度Heatmap图 Fig. 6 Heatmap of the relative abundance of taxa

3 结论

(1) 适宜条件下培养的高效反硝化细菌[300 mg·(L·h)-1]具有较高的适应性及活性恢复性, 置于不利条件下, 经过17 d反硝化速率为5.4 mg·(L·h)-1, 包埋后经过16 d, 反硝化速率稳定到4.8 mg·(L·h)-1, 高效反硝化细菌包埋填料经过长达90 d的不利条件驯化后, 在适宜条件下利用12 d快速恢复高效性能[300 mg·(L·h)-1].

(2) 高通量测序结果表明, 条件的改变会导致系统内的微生物种群结构随之改变.在适宜条件下, 发挥处理能力的优势菌群均为Thauera、Petrimonas、Pseudomonas, 在不利条件下, 发挥处理能力的优势菌群为Pseudomonas、Thauera、Gelidibacter; 同时在不利条件下一些反硝化细菌的增长如Flavobacterium等在一定程度上补充了系统的反硝化能力, 从而也证明了高效反硝化细菌的适应性.

(3) 包埋填料经历100多天的运行未出现生物膜脱落现象, 表现出较长的寿命; 扫描电镜对包埋填料结构的分析表明其内外结构有利于细菌正常生长代谢.

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