2017, Vol. 38
流化床生物滤器是近年来研发出的一种极具开发潜力和竞争力的生物过滤器, 因其具有高效, 可控, 占地面积小等优点, 已逐渐应用于循环水养殖领域(recirculating aquaculture systems, RAS)中[1].流化床生物滤器一般采用直径0.2~0.4 mm的玻璃微珠或石英砂作为滤料, 该滤料比表面积高达4 000~20 000 m2·m-3, 可显著提升基质和氧及营养盐的传递效率, 其硝化性能显著优于传统生物滤器[2].
目前, 国内外学者对流化床生物滤器从装置本身的结构[3]、滤器内部的流态[4]、运行时水力特性[5, 6]及同步硝化反硝化[7]等方面进行了大量的研究, 优化了该滤器的工艺参数, 显著提升了该滤器的稳定性及处理效果, 降低了装置的能耗.然而, 流化床生物滤器在运行过程中, 会出现明显的分层现象, 即滤器表层的颜色较下层区域更深, 并且底部区域和表层区域的滤料互不交换, 这可能会导致不同区域细菌群落会有所差别, 而滤器中细菌群落的变化情况与滤器的水处理性能密切相关[8].目前, 对于流化床生物滤器内部的细菌群落结构研究还鲜有报道, 滤器的净水机制也尚未摸清.高通量测序技术作为新一代测序技术, 较T-RFLP[9]、PCR-DGGE[10]和16S rRNA[11, 12]克隆文库测序手段更为先进, 能够一次同时对几十万到几百万条核酸分子进行序列测定, 可全面精准地分析不同领域中的细菌[13~16], 运用该技术可为揭示生物滤器这个“黑匣子”提供可能.
本文选用玻璃微珠为流化床生物滤器的填料, 分析了滤器内部不同床层营养盐的变化, 探讨了滤器的水处理效率, 并采用高通量测序方法, 研究了滤器挂膜期, 稳定运行期(关闭及开启自清洗装置)时滤器表层及底层填料的细菌群落, 旨在摸清流化床不同区域载体表面细菌群落的结构变化、种类及作用, 以期为了解流化床生物滤器的净水机制, 优化该滤器的运行参数提供基础数据, 并为其在循环水养殖系统中的高效运作提供一定的技术支持.
1 材料与方法 1.1 斑石鲷循环水养殖系统在中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所如东中试基地构建一套RAS, 如图 1所示, 系统主要由养殖池, 调节池, 气浮机, 流化床生物滤器及斜管沉淀池5大部分组成.试验养殖对象为斑石鲷, 初始均重为(0.43±0.11) kg, 投放密度为13·m-3. RAS总水体为8 m3, RAS每天的换水量为总水体的5%.
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1.排水口; 2.沉淀区; 3.排污口; 4.膨胀区; 5.进水口1; 6.排砂口; 7.增压泵; 8.进水口2; 9.“米”字形吸料管 图 1 斑石鲷循环水养殖系统示意 Fig. 1 Schematic diagram of spotted parrotfish recirculatingaquaculture systems |
本试验期间, 养殖水温控制于24℃, 盐度15‰, 溶解氧>5.5 mg·L-1.初始氨氮(NH4+-N)浓度 < 0.2 mg·L-1, 初始悬浮物(SS)浓度 < 5 mg·L-1, 初始生化需氧量(BOD5) < 1 mg·L-1.
1.2 流化床生物滤器流化床生物滤器装置结构如图 2所示, 布水方式采用底部双切向进水方式, 两路进水成180°, 优化了滤器内部的流态, 形成的漩涡流推动床层均匀向上膨胀.滤器由床层膨胀区和悬浮物沉淀区两部分组成.其中, 床层膨胀区直径0.5 m, 高1.2 m, 上部设有自清洗组件, 由一“米”字形吸料管及增压泵组成, 主要对表层滤料进行清洗.悬浮物沉淀区位于滤器上部分, 直径0.8 m, 高0.4 m, 主要起物理沉淀作用, 沉淀养殖水体中的颗粒物及部分滤料.
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图 2 流化床生物滤器装置结构示意 Fig. 2 Structure diagramof fluidized-sand biofilter |
选择粒径为0.4~0.6 mm的玻璃微珠作为流化床生物滤器的填料, 该填料的主要成分为SiO2, 密度2.5 kg·m-3, 比表面积高达10 000~20 000 m2·m-3.此填料均一性好, 且耐磨, 利于形成固液相的高湍流现象, 促进填料表面细菌的生长, 进而提升了固液相之间的传质.
1.4 试验设计采用直接挂膜法启动流化床生物滤器, 生物膜成熟后, 设定床层膨胀率150%, 滤器的进水流量(7±0.2) m3·h-1, 将流化床生物滤器运行半个月, 监测滤器进出水营养盐的变化情况.待滤器对营养盐的去除率稳定后, 设计2组NH4+-N和亚硝氮浓度(NO2--N), 监测滤器不同沿程NH4+-N和NO2--N变化情况, 连续监测半个月.而后, 在流化床生物滤器运行至70 d时, 连续采集滤器进出口的水样1个月, 分析流化床生物滤器对NH4+-N、氨氮去除负荷、硝氮(NO3--N)、BOD5、总氮(TN)和SS的去除效果.
生物膜样品共采集4次, 取样8个, 采样点分别为滤器表层区域和底层区域, 取样时间分别为滤器挂膜期1次(滤器运行时间10 d), 滤器稳定运行期3次, 其中, 关闭自清洗装置时1次, 开启自清洗装置时2次(滤器运行时间分别为40、70、100 d).表层区域不同时间段的样品编号分别记为B1、B2、B3、B4, 统称为组1(group 1), 底层区域不同时间段的样品编号分别记为D1、D2、D3、D4, 统称为组2(group 2).
试验在中国水产科学研究院渔业机械仪器研究所如东中试基地开展, 试验时间为2015年7月15日至2016年4月30日.
1.5 样品预处理及总DNA提取8个样品采集完毕后, 将样品放置冰上进行融化, 而后取50 g样品置于50 mL离心管, 并注入PBS缓冲液, 高速涡旋振荡5 min, 反复操作10次.然后收集水样, 将水样在15 000 r·min-1下离心15 min, 取沉淀物用于总DNA提取.总DNA采用E. Z. N. A. Soil DNA试剂盒(美国Omega Bio-tek公司)按照试剂盒上的说明书进行提取.提取的DNA用1%琼脂凝胶电泳进行检测.
1.6 样品测序采用细菌通用引物338F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和806R(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)对样品16S rRNA的V3~V4区域进行PCR扩增. PCR反应体系为20 μL, 反应条件为95℃预变性3 min, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s, 28个循环, 72℃延伸10 min.而后, 将扩增产物使用2%琼脂糖进行凝胶电泳分析, 若PCR产物目的条带大小正确, 浓度合适, 则将扩增产物在Illumina-MiSeq平台上进行高通量测序.样品由上海美吉生物医药科技有限公司进行测序分析.
1.7 水质测定方法温度和溶解氧采用美国YSI多参数水质分析仪测定. NO2--N采用萘乙二胺分光光度法, NO3--N、NH4+-N和TN采用哈希试剂盒测试. BOD5采用稀释与接种法, SS采用重量法, 氨氮的去除负荷[volumetric TAN removal rate, VTR, g·(m3·d)-1]的计算公式[17]分别为：
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式中, cin为进水氨氮浓度, mg·L-1; cout为出水氨氮浓度, mg·L-1; Q为进水流量, m3·h-1; V为不同床层膨胀率下填料的膨胀体积, m3.
水质试验数据采用SPSS 10.0软件进行方差分析, 用Origin 8.0软件作图.
1.8 生物信息学分析根据Index序列区分各个样本的数据, 将其以fastq格式保存, 利用Qiime (version 1.9.1) 对数据进行检测并去除嵌合体序列.利用Uparse (version 7.1) 对样品的有效序列进行聚类, 默认将97%相似水平的序列类聚成操作分类单元(operational taxonomic unit, OTU).采用RDP classifier贝叶斯算法对OTU进行分类学分析, 并将OTU选取的代表性序列与silva(SSU123) 库进行对比[18].
利用Mothur软件构建稀释性曲线(rarefaction curve)[19], 并计算Shannon指数及Chao1指数[20].利用Qiime计算样品β多样性距离矩阵, 用R语言vegan软件包, 基于Bray-Curtis算法计算距离矩阵, 分析主坐标分析[21](principal co-ordinates analysis, Pcoa), 并采用非加权组平均法(unweighted pair group method with arithmetic mean, UPGMA)构建多样本相似度树状图.
2 结果与分析 2.1 生物滤器挂膜情况流化床生物滤器采用自然流水法进行生物挂膜, 养殖水体中初始NH4+-N浓度低于0.2 mg·L-1.生物滤器挂膜期间NH4+-N和NO2--N的变化情况如图 3所示, 随着挂膜天数的增加, 出水NH4+-N浓度及NO2--N浓度低于进水, 表明硝化细菌群正逐步形成, NH4+-N和NO2--N逐渐被转化.滤器挂膜1个月后, 滤料的颜色自下而上变成深灰色, 此时经该生物滤器处理后的NH4+-N浓度低于0.26 mg·L-1, NO2--N浓度低于0.03 mg·L-1, 说明生物膜已开始成熟[22].
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图 3 新型流化床生物滤器挂膜期间NH4+-N和NO2--N的变化情况 Fig. 3 Changes in NH4+-N and NO2--N during cultivation with new style of fluidized-sand biofilter |
图 4显示了流化床不同床层高度下NH4+-N和NO2--N的浓度变化情况.在2组初始NH4+-N浓度工况下, 养殖水体中的NH4+-N浓度在床层底部至30 cm处下降最快, 而后趋于平缓. NO2--N浓度变化也显出相同的趋势, 说明滤器的硝化作用主要发生于滤器的底部区域, 表层区域对其的贡献率不显著.对溶解氧的监测表明, 溶解氧浓度从底部区域向表层区域逐渐降低, 说明溶解氧浓度影响滤器的硝化作用.
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图 4 流化床生物滤器不同床层高度下NH4+-N和NO2--N浓度变化情况 Fig. 4 Changes in NH4+-N and NO2--N at different depths of the fluidized-sand biofilter |
表 1显示了流化床生物滤器在稳定运行工况下的水处理性能, 结果表明, 滤器对NH4+-N、TN、BOD5和SS的去除率达到了(68.3±2.24)%、(49.54±3.56)%、(60.35±4.98)%和(45.21±2.11)%, 对TAN的去除负荷达到了(343.28±75.5) g·(m3·d)-1.该水质可满足斑石鲷的生长, 由于滤器上部悬浮物沉淀区的存在, 本装置对SS的去除率显著高于传统生物滤器, 有效减轻了系统对悬浮物的去除压力, 并且有助于提升滤器的硝化作用[23].
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表 1 流化床生物滤器的水处理性能 Table 1 Performance of purifying effluent of fluidized-sand biofilter |
2.4 流化床生物滤器中细菌群落的多样性
对各样品所测结果整理分析, 发现样品的有效序列超过20 000条, 有效OTU在234~473之间.由表 2可知, 挂膜期样品(B1和D1) 的OTU数量显著少于生物膜成熟期, 底层区域样品(D1) 的OTU数量多于表层区域样品(B1), 说明挂膜阶段细菌先附着于底层区域的填料. Chao1指数和Shannon指数表明B1和D1样品的物种丰富度和多样性均低于其他样品, 说明挂膜期载体表面的细菌较少.当开启自清洗装置后, 表层区域样品(B3和B4) 的物种丰富度和多样性多于B1及B2, 说明在该开启自清洗装置有助于增加表层填料细菌的附着量, 而底层区域的Chao1指数和Shannon指数在启停自清洗装置工况时变化不明显.各样品的覆盖率都超过0.99, 说明样品中序列没有被测出的概率极低, 即本次测序结果代表了样品中细菌的真实情况.
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表 2 不同样品细菌群落的多样性 Table 2 Microbial community diversity of the different samples |
2.5 流化床生物滤器群落结构分析
表 3显示了不同样品载体表面细菌群落门水平的变化, 从中可知, 在流化床生物滤器挂膜期, 表层区域的优势细菌为绿弯菌门(Chloroflexi, 29.31%)和酸杆菌门(Actinobacteria, 29.65%), 而底层区域的优势细菌为拟杆菌门(Bacteroidetes, 54.03%).生物膜成熟后滤器稳定运行工况下, 载体表面门水平的细菌种类分布更加丰富与均衡, 共筛选出31个门, 其中各工况下所占比例超过5%的细菌共筛选出6个门, 分别为变形菌门(Proteobacteria, 29.2%~38.05%), 拟杆菌门(Bacteroidetes, 16.81%~33.76%), 绿弯菌门(Chloroflexi, 6.2%~24.18%), 酸杆菌门(Actinobacteria, 3.37%~12.66%), 硝化螺旋菌门(Nitrospirae, 0.89%~14.36%), 疣微菌门(Verrucomicrobia, 0.05%~5.88%).生物滤器在运行过程中, 各个时期的细菌种群有一定的变化, 如绿弯菌门(Chloroflexi)在挂膜初期是表层区域的优势种群, 在其他时期所占比例显著减少, 而硝化螺菌门(Nitrospirae)呈现逐渐增加的趋势.表层区域与底部区域的细菌种群所占比例也有所区别, 如硝化螺菌门(Nitrospirae), 底部区域所占比例显著高于表层.
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表 3 不同样品细菌群落结构组成所占比例/% Table 3 Microbial community composition ratios at the phylum level of the different samples/% |
将样品中的细菌继续细分至细菌属可以更深入了解细菌的种群分布及功能, 通过与silva(SSU123) 数据库进行比对, 共鉴定出490个细菌属, 图 5显示了不同工况下载体表面物种百分比大于1%的属水平分析.从中可知, 挂膜期表层区域(B1) 丰度最高的细菌为厌氧绳菌科(Anaerolineaceae_uncultured, 9.84%), 底层区域(D1) 丰度最高的细菌为黄杆菌科(Flavobacteriaceae_ unclassified, 44.68%).在滤器稳定运行时, 表层区域的优势细菌基本维持不变, 主要包括厌氧绳菌科(Anaerolineaceae_uncultured, 8.4%~28%)、黄杆菌科(Flavobacteriaceae_ unclassified, 1.1%~32%)、红杆菌科(Rhodobacteraceae_ uncultured, 2.3%~17%)、硝化螺菌属(Nitrospira, 1%~7%)、暖绳菌科(Caldilineaceae_uncultured, 1%~6%).而底层区域的优势细菌随着时间的推移有所变化, 主要包括硝化螺菌属(Nitrospira, 12.45%~17.06%), 微丝菌属(Candidatus_microthrix, 2.6%~8.8%)、Muricauda(4.8%~6.3%)、Defluviimonas(6%~7%)、红杆菌科(Rhodobacteraceae_uncultured, 2%~6.2%).开启或关闭自清洗装置对不同滤器中的不同区域载体表面细菌的多样性没有影响, 对各样品的优势菌群略有影响.另外, 筛选出一批丰度不高, 但在水处理中起重要作用的功能性细菌, 如亚硝化单胞菌(Nitrosomonas, 0.04%~3.3%), 芽胞杆菌属(Bacillus, 0.1%~2%)等.
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图 5 不同样品细菌属水平分析(>1%) Fig. 5 Microbial community composition at the genus level for the different samples |
PCoA分析是一种非约束性的数据降维分析方法, 可用来研究样本群落组成的相似性或差异性.由图 6(a)可知, B1样品与其他样品相似性最低, 说明表层滤料载体表面的细菌群落随着时间的推移, 物种进行了一定的更替.当滤器稳定运行期间, 在不开启自清洗装置工况下, 表层滤料和底部滤料的相似性较高(B2和D2), 在定期开启自清洗装置工况下, 滤器中细菌种群与之前工况相比差异性较高(B2和B3及B4; D2和D3及D4), 而在该工况下运行一段时间发现, 滤器中各样品的相似性较高(B3、B4、D3和D4), 并且由聚类分析图可知, 随着滤器的运行, 表层滤料及底层滤料表面的细菌未发生显著的变化, 即样品间的相似性较高(B3和B4；D3和D4), 说明定期开启自清洗不影响滤料表面细菌的生长及繁殖.
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图 6 不同样品PCoA分析和聚类分析 Fig. 6 PCoA and hierarchical cluster analysis plots of the different samples |
在海水工况下, 养殖水体中的营养盐负荷较低, 常规生物滤器存在挂膜时间长和运行性能不稳定等问题.本试验装置经过1个月的自然挂膜, 即可实现成功启动, 挂膜时间显著短于其他学者研究[22, 24].一方面可能是选择的填料比表面积较高, 为细菌生长与繁殖提供了足够的场所, 另一方面可能是合理的布水结构为滤器创造一个良好的流态, 并且定期开启自清洗装置, 提升了基质和氧及营养盐的传递效率, 进而提高了滤器的水处理性能.
3.2 流化床生物滤器净水机制分析通过水化学检测分析, NH4+-N和NO2--N浓度在床层底部至30 cm处下降最快, 而后趋于平缓, 说明滤器的底部区域对NH4+-N和NO2--N的去除效果明显, 表层对其的贡献率不显著.通过高通量测序分析, 滤器中主要的功能性细菌, 如硝化螺菌属和亚硝化单胞菌等, 主要集中于滤器的底部区域, 表层所占的比例相对较少, 说明滤器的硝化作用主要在底部区域.原因可能是由于表层的滤料附着了过量的悬浮物, 导致生物膜过厚, 不利于功能性细菌的附着与生长, 进而影响了基质与营养盐的传递效率.另一方面, 溶解氧浓度从底部到表层是逐渐降低的, 故在底部区域好氧细菌更易随着与生长, 特别是硝化螺菌属等功能性细菌.罗荣强等[25]对海水生物滤器氨氮沿程转化规律模型研究表明, 生物滤器中氨氮的去除主要发生在填料高度0~10 cm处, 10~70 cm处氨氮去除量很少, 本试验结果与其相似.
开启自清洗装置可增加底部区域和表层区域滤料的相互接触, 在碰撞的过程中, 滤料表面的微生物可能会发生变化.通过高通量测序发现, 自清洗装置的启停对滤器内部不同区域载体表面细菌的多样性没有显著影响, 对各样品的优势菌群略有影响.在开启自清洗装置情况下, 表层区域的Anaerolineaceae_uncultured和Nitrospira显著增加, 而Flavobacteriaceae_ unclassified和Defluviimonas显著减少.在定期开启自清洗装置工况下, 表层区域和底部区域的细菌种类的相似性显著提高, 随着时间的推移, 表层区域和底部区域载体表面的细菌末发生显著改变, 种群结构较为稳定, 说明开启自清洗装置有助于提升装置的性能.
在稳定工况下, 流化床生物滤器对氨氮的去除负荷达到了(343.28±75.5) g·(m3·d)-1, 对NH4+-N、TN、BOD5和SS也保持了较高的去除率. Liu等[26]研究了微珠生物滤器, 以直径2~3 mm微珠为滤料, 当氨氮浓度为3 mg·L-1时, 滤器对氨氮的平均去除负荷172 g·(m3·d)-1.本试验结果显著优于前人研究.通过高通量测序, 本试验共筛选31个门, 490个细菌属, 其生物多样性显著高于常规生物滤器[27], 说明选用该填料有助于微生物的附着与生长.其中, 筛选出的Nitrospira所占比例显著高于其他学者的研究结果[28, 29], 证实了该生物滤器可实现较高的硝化性能, 特别是在海水养殖等寡营养条件下, 能显示出其性能的优越性.国外学者[30]对海水循环水养殖系统中生物滤器的细菌种类研究表明, 主要氨氮化细菌为Nitrosomonas和Nitrosocossus, 主要亚硝酸盐氧化细菌为Nitrospira, 本试验结果与其相似.另外, 筛选出了一批丰度不高, 但对养殖水体中营养盐的去除起关键作用的功能性细菌.黄杆菌属(Flavobacterium)是一类兼性厌氧细菌, 能在低氧情况下将硝酸盐转化成各种还原性产物, 进而降低养殖水体中的氮含量.占α-Proteobacteria纲一定比例的Rhodobacter菌属是一种紫色非硫细菌(purple nonsulfur bacteria), 能利用多种有机物作为碳源进行异养的光合代谢反应, 降低水体中BOD5浓度[27].
4 结论(1) 在海水养殖工况下, 流化床生物滤器经过1个月的自然挂膜, 即可成功启动.稳定运行期, 滤器对NH4+-N、TN、BOD5和SS的去除率达到了(68.3±2.24)%、(49.54±3.56)%、(60.35±4.98)%和(45.21±2.11)%, 对氨氮的去除负荷达到了(343.28±75.5) g·(m3·d)-1, 其硝化性能优于常规生物滤器.
(2) 流化床生物滤器的硝化作用主要发生于床层下部, 表层对其的贡献率不显著.自清洗装置的启停对不同滤器中的不同区域载体表面细菌的多样性没有影响, 对各样品的优势菌群略有影响.在定期开启自清洗装置工况下, 表层区域和底部区域的细菌种类的相似性显著提高, 随着时间的推移, 表层区域和底部区域载体表面的细菌未发生显著改变, 种群结构较为稳定.
(3) 本试验共筛选31个门, 490个细菌属, 在挂膜期, 细菌群落的多样性显著少于生物膜成熟期.在滤器稳定运行时, 表层区域的优势细菌基本维持不变, 主要包括厌氧绳菌科、黄杆菌科、红杆菌科、硝化螺菌属、暖绳菌科.而底层区域的优势细菌随着时间的推移有所变化, 主要包括硝化螺菌属, 微丝菌属、Muricauda、Defluviimonas和红杆菌科.
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