有色金属矿产资源开采冶炼形成的废渣、废石场、尾矿库不仅占用大量土地，也给矿山及周边区域带来生态破坏和环境污染.近年来，植物修复技术作为一项绿色、低成本和潜在经济效益的治理措施，主要是利用对重金属具有特殊耐性和富集能力的植物来修复重金属污染土壤，具有十分广阔的应用前景^[1~3].而植物材料的筛选在矿业废弃地的植被恢复和重金属污染土壤的植物修复中是非常重要的关键环节^[4].在重金属污染区的自然植被中，由于长期自然选择的作用，某些特殊植物能够适应这种极端的生境，对本地逆境条件具有很强的耐性、适应性，甚或偏好性，这些植物在重金属污染的植物修复中起到决定性的作用^{[5, 6]}.

为适应环境中的重金属胁迫，植物形成了特定的耐性机制，如结合到细胞壁或液泡区隔化，与有机酸或蛋白质等络合形成活性较低的解毒形态^{[7, 8]}.植物吸收转运重金属后，会以不同的化学结合形态将重金属贮存于植物的各个器官组织中，限制其在植物体内的移动，从而减轻对植物的毒害.植物中重金属的亚细胞分布及化学形态与其毒性、迁移能力及生物有效性密切相关^[9~11].因此，对耐性植物体内重金属的化学形态、亚细胞分布特征进行探讨, 将有利于认识耐性植物的耐性及解毒机理, 对重金属污染土壤的植物修复具有重要意义.

由于生长周期短、生物量较大且积累迅速、繁殖能力强，对异质环境具有较强的适应能力，相对比较容易形成重金属耐性，菊科植物对于植物修复来说可能是一类较理想的植物资源^{[12, 13]}.本研究以某铅锌尾矿污染区自然生长的3种优势菊科植物为试验材料，采用差速离心技术分离植物各组织的亚细胞组分，并运用化学试剂逐步提取法对重金属在植物各组织细胞内的亚细胞分布特征和化学形态进行了研究，试图从重金属在3种菊科植物根、茎、叶组织中的亚细胞分布特征和形态差异来揭示重金属的积累机制，以期为进一步探索这些植物对重金属的耐受和富集机制提供参考.

研究区域位于广西阳朔县兴坪镇思的村，地处中亚热带季风性气候区，受季风影响，一年的旱、涝、冷、热变化大，年平均温度19.5℃，年均降雨量1 700 mm以上.坐落于思的村东北方向的老厂铅锌矿，自20世纪50年代进行开采，并于1958年在采矿坑口建立小型浮选厂进行选矿生产^[14]. 20世纪70年代的一次强降雨导致尾矿砂坝坍塌，大量尾砂沿河谷冲入思的村，造成大范围的土壤重金属污染，部分沿河谷农田因污染严重而废弃.

试验植物样品为思的村荒废农田上生长旺盛且优势度高的3种菊科植物，包括胜红蓟(Ageratum conyzoides L.)、野茼蒿(Crassocephalum crepidioides)和野艾蒿(Artemisia lavandulaefolia).将该种植物3~5株混合成一个样品，植物的茎叶和根部分开装袋，并按多点混合采集土壤样品(0~20 cm).将采集回的植物样品用自来水冲洗尘土和夹渣物，再用去离子水漂洗干净，再分成两部分，一部分保存于液氮中备用，用于测定植株亚细胞组分和不同化学形态的重金属含量.另一部分晾干后于105℃下杀青30 min，然后60℃烘干至恒重，不锈钢粉碎机粉碎，放入干燥箱备用.土壤样品经自然风干后磨细，过100目尼龙筛，以备测定分析.

过筛后的植物样品采用HNO₃-HClO₄法、土壤样品采用HNO₃-HF-HClO₄法消化测定重金属含量^[15]，土壤重金属元素的有效态采用0.1 mol·L^-1的HCl浸提制备待测液^[16].土壤pH值采用精密pH计(PHS-3B，中国雷磁公司)测定.参照李红婷等的方法^[17]，采用差速离心法分离得到植物样品的细胞壁、细胞器和液泡组分；采用化学试剂逐步提取法进行植物样品的重金属化学形态分析，包括乙醇提取态、去离子水提取态、NaCl提取态、HAc提取态、HCl提取态和残渣态.待测液中重金属浓度利用电感耦合等离子体质谱仪(ELAN-DRC-e，美国PerkinElmer公司)测定.通过设置空白样、平行样和标准物质控制数据准确度.

采集到的土壤样品的pH值为5.48，主要重金属总量及有效态含量的测定结果表明(表 1):参照国家土壤环境质量二级标准(GB 15618-1995)，研究区土壤中Cd、Pb和Zn含量均超标，这3种元素的含量分别为二级标准的38.7、6.7和9.9倍，Cd超标最严重. Cd、Pb和Zn具有较高的生物有效性系数(有效态含量占重金属总量的比值)，分别为59.5%、67.5%和45.4%，可见Cd、Pb、Zn是该区土壤的主要重金属胁迫因子.

表 1 (Table 1)

表 1 研究区土壤重金属含量/mg·kg-1 Table 1 Concentrations of heavy metals in soil of the study area/mg·kg-1

表 1 研究区土壤重金属含量/mg·kg-1 Table 1 Concentrations of heavy metals in soil of the study area/mg·kg-1

富集系数常用来衡量植物重金属积累能力和修复潜力大小的重要指标，是指植物地上部与土壤中相应有效态重金属含量的比值，富集系数越大，植物富集能力越强^{[13, 18]}.胜红蓟、野茼蒿和野艾蒿根、茎和叶中的Cd、Pb、Zn含量的测定结果和富集系数见表 2.可以看到，重金属在3种菊科植物中的分布不均匀，不同种类植物对同种重金属的吸收量也不同. Cd、Pb和Zn在各菊科植物组织中的含量范围为：Cd 5.9~219.5 mg·kg^-1；Pb 45.1~411.3 mg·kg^-1；Zn 945.3~2 216.5 mg·kg^-1，均超过一般植物的正常重金属含量值^[19]，3种植物对污染土壤重金属胁迫均表现出很好的适应性和耐性. 3种植物体内的Zn含量均较高，根、茎、叶对Zn的富集系数均>1，以野茼蒿和野艾蒿叶片中Zn含量最高，分别为2196.9 mg·kg^-1和2 216.5 mg·kg^-1，但没有达到Zn超富集植物的临界含量标准(10 000 mg·kg^-1)^[20]. Pb在3种植物中含量较低，富集系数均＜1, 最高均出现在各自的根部，地上部分对Pb的富集系数≤0.1，表明这些植物会通过自身的排斥机制来阻止从地下部分吸收的Pb向地上转运，以减少对植物生理系统的伤害.野茼蒿的地上部对Cd具有很强的富集能力，富集系数最小为23.14，叶片和茎的Cd含量分别高达219.5 mg·kg^-1和159.6 mg·kg^-1，超过100 mg·kg^-1这一Cd超富集植物应达到的临界含量标准^[20]；同时，野茼蒿茎和叶对Cd的转运系数(地上部与根部含量比值)分别为2.00和2.75.由此可见，在本研究区，野茼蒿对Cd的富集特征已完全具有Cd超富集植物的4个主要特征：即耐性特征、临界含量特征、强富集特征和向上转移特征，基本可以认定野茼蒿是Cd的超富集植物^{[20, 21]}.胜红蓟表现出较强的Cd富集能力和向地上运输能力，也可作为Cd富集植物，用于Cd污染土壤的修复.

表 2 (Table 2)

表 2 植物体内Cd、Pb、Zn含量及富集系数 Table 2 Concentrations and enrichment coefficients of Cd, Pb and Zn in plants

表 2 植物体内Cd、Pb、Zn含量及富集系数 Table 2 Concentrations and enrichment coefficients of Cd, Pb and Zn in plants

野艾蒿、胜红蓟和野茼蒿根、茎、叶亚细胞组分中Cd、Pb和Zn的分布情况见图 1.从图 1可知，3种植物叶、茎和根中的重金属主要蓄积在细胞壁(31.2%~71.7%)和液泡的可溶性组分中(17.7%~54.7%)，少量存在于细胞器组分中(3.4%~22.1%)，表明细胞壁和液泡的可溶组分是3种供试菊科植物储存重金属的两个最重要位点.在野艾蒿的各组织中，Cd、Pb和Zn主要分布在细胞壁，占总量的50.9%~71.1%，其次为液泡部分，而在细胞器中的平均含量分数分别仅为18.0%、9.1%和9.2%. 3种重金属在胜红蓟叶片的亚细胞组分中的含量高低顺序为：液泡>细胞壁>细胞器，而在野茼蒿的叶片中则表现为细胞壁>液泡>细胞器.在胜红蓟和野茼蒿的茎中，Cd和Zn在液泡组分中所占比例分别约为60%和50%；Pb在胜红蓟的茎中主要分布在细胞壁，占总量的49.6%，野茼蒿茎中的细胞壁和液泡中的Pb含量相当，分别为47.2%和48.9%.各金属在野茼蒿的根细胞壁中的分配比例以绝对优势占据总量的57.8%~63.6%，液泡次之.在胜红蓟的根细胞中，Cd大部分存在于细胞壁，而Pb和Zn主要分布在液泡的可溶性组分中.

图 1

Fig. 1

图 1 Cd、Pb、Zn在3种菊科植物亚细胞组分中的分布 Fig. 1 Subcellular distribution of Cd, Pb and Zn in three types of Compositae plants

采用提取剂分级提取测定6种不同化学形态的重金属，3种菊科植物各组织Cd、Pb和Zn所占比例如图 2所示.可以看出，在3种植物的各部位，乙醇提取态Cd、Pb和Zn的分配比例均很低，最高仅为5.8%. Cd在3种植物中以NaCl提取态为主，这部分形态所占比例为37.0%~61.9%，去离子水提取态的分配比例较少，平均仅为4.3%. Pb在植物组织中以NaCl提取态(20.6%~42.1%)和HCl提取态(32.9%~58.4%)占多数，其次为残渣态，乙醇提取态、去离子水提取态和HAc提取态合计仅占总量的3.9%~13.2%. Zn在植物茎叶的形态主要是NaCl提取态，HAc提取态和去离子水提取态次之；在植物根细胞中，Zn以NaCl提取态和HAc提取态为主导形态，其次为HCl提取态.

图 2

Fig. 2

F1为乙醇提取态;F2 为去离子水提取态;F3为氯化钠提取态;F4 为醋酸提取态;F5 为盐酸提取态;F6 为残渣态 图 2 Cd、Pb、Zn在3种菊科植物中的化学形态分布 Fig. 2 Chemical forms of Cd, Pb and Zn in three types of Compositae plants

重金属在细胞壁的沉淀及细胞内的区隔化分布是植物内部解毒的两个重要途径^[22].植物细胞壁含有蛋白质、多糖、果胶酸以及大量的羟基、羧基、醛基、氨基或磷酸基等亲金属的配位基团，容易固定重金属离子^{[23, 24]}.因此，细胞壁是重金属进入细胞内部的第一道屏障，对于维持细胞正常生理代谢、保护植物正常生长起到关键作用.在本研究中，野艾蒿各组织细胞中细胞壁组分的重金属含量均占有最高分配比，可见细胞壁的固持作用是野艾蒿对重金属忍耐与解毒的主要机制.此外，在野茼蒿体内积累的Pb和Zn主要与细胞壁结合，从而降低对其他细胞结构的伤害.当重金属离子在细胞壁上的结合达到饱和，大部分进入到细胞的重金属会被转运至液泡中，与液泡中含有的糖类、有机酸、氨基酸、无机盐等多种物质络合，实现区隔化^[25].长柔毛委陵菜细胞内的Cd主要分布在细胞壁和可溶组分中，且叶片中90%以上原生质体中的Cd富集在液泡中^[26].美洲商陆中53.7%~68.3%的Cd蓄积在细胞可溶组分中，其次是细胞壁^[27].周守标等^[28]的研究结果表明，皖景天的细胞内的Cd主要储存在可溶部分，在叶中可溶部分Cd占93%以上.本试验发现，Cd在胜红蓟和野茼蒿茎叶细胞液泡中占有相当高的分布比例(42.3%~61.9%)，显著高于液泡的Cd在野艾蒿茎和叶细胞的分配比(分别为17.7%和29.7%)，因此，液泡区隔化作用可能是胜红蓟和野茼蒿能够强富集Cd的关键因素.胜红蓟各组织细胞液泡中较高的Pb、Zn含量也说明了液泡中的可溶部分在胜红蓟耐受Pb和Zn胁迫中发挥主要作用.

由于重金属在不同极性提取剂中的溶解度有很大差别，不同提取剂的提取量可以反映重金属存在的化学形态差异^[9].乙醇主要提取无机盐、氨基酸盐等物质；去离子水主要提取水溶性有机酸盐等；氯化钠主要提取与蛋白质结合或吸附态以及果胶酸盐等；醋酸主要提取难溶于水的重金属磷酸盐；盐酸提取草酸盐等.乙醇和去离子水提取态生物毒性和迁移活性最强，最容易使植物受到毒害，氯化钠提取态次之，醋酸与盐酸提取态生物毒性与迁移活性最弱^{[29, 30]}.本研究结果发现，Cd、Pb和Zn在3种植物体内主要以蛋白质结合或吸附态及果胶酸盐的形式存在，结合分析3种重金属元素在植物中亚细胞分布特征，这部分形态的重金属可能与细胞壁和细胞膜中果胶酸和蛋白质等的固定作用有关；其次是以磷酸盐和草酸盐的形式存在，而这部分移动性较差形态的重金属可能与液泡中的有机酸的络合作用有关.

吴朝波等^[30]和钟海涛^[31]等发现在海雀稗和小飞扬草中Cd主要以NaCl提取态和HAc提取态为主.超积累东南景天^[32]植物体内Cd形态以NaCl提取态、HAc提取态和水提取态占优势.然而在三色堇^[33]和萱草^[34]中却发现Cd主要以活性较强的乙醇提取态为优势形态.本试验中，3种菊科植物根和茎叶的Cd形态都是以NaCl提取态最多，但3种植物间的Cd化学形态分布特征存在一定的差异.在野艾蒿中，活性较弱、毒性较低的Cd形态(HAc提取态+HCl提取态+残渣态)分别占叶和茎中Cd总量的46.3%和32.6%，低于胜红蓟的54.2%和53.7%以及野茼蒿的61.7%和47.3%.胜红蓟和野茼蒿茎叶中蓄积更多的Cd以低毒性的形态存在，有利于减弱Cd对植物茎叶的毒害作用，增强植物对Cd的耐性.从植物根系来看，野茼蒿根系中较高的有效态Cd(乙醇提取态+去离子水提取态+NaCl提取态)含量，有助于野茼蒿对Cd的吸收及向地上部的转运和积累.

(1) 野茼蒿、胜红蓟和野茼蒿3种菊科植物对铅锌尾矿污染土壤中的Cd和Zn具有较强的富集能力，其中野艾蒿达到Cd超富集植物的标准.

(2) 细胞壁的固持作用和液泡的区隔化作用以及Cd、Pb、Zn主要以活性较弱的氯化钠提取态、醋酸提取态及盐酸提取态存在是3种菊科植物应对重金属胁迫的重要耐性机制.

(3) 胜红蓟和野茼蒿茎叶细胞液泡可溶组分中Cd含量较高，且茎叶中“活性态”Cd的积累比例低于根系，有助于地上部蓄积更多的Cd，极大地限制了Cd的毒害作用.