汞(Hg)的毒性与危害取决于其结构与形态，与无机汞相比甲基汞(MeHg)具有更强的生物富集与生物放大作用，也具有更大的环境风险与健康危害.土壤是Hg重要的源和汇^[1].在我国汞矿区水稻、玉米、蔬菜等农作物中含有较高浓度的MeHg^[2~4]，蔬菜与稻米的摄入是矿区群众甲基汞的主要暴露途径，而土壤则是农作物中甲基汞的主要来源^[5].土壤中汞的甲基化机制研究对评估MeHg的环境健康风险以及抑制土壤MeHg形成技术的开发至关重要，一直是研究的热点和重点.

土壤汞甲基化包括非微生物作用和微生物作用.非微生物作用主要是土壤腐殖质中的甲基基团(CH^3-)在与土壤中二价汞[Hg(Ⅱ)]的结合生成MeHg^[6].微生物作用是通过微生物细胞内酶催化细胞内甲基供体将甲基基团(CH^3-)转移给Hg(Ⅱ)，进而形成MeHg^[7]. Parks等^[8]在微生物体内分离出两组基因hgcA和hgcB，由其编码形成的类咕啉蛋白酶机制被认为是汞甲基化微生物主要的MeHg生成机制.硫酸盐还原菌(SRB)被认为是主要的汞甲基化细菌^[9]，少部分铁还原菌(FeRB)和产甲烷菌也具有甲基化能力^[10]. SRB是一类异养型厌氧微生物，并以硫酸盐等氧化态硫为电子受体而获得能量供给. FeRB与SRB同属δ-变形菌纲(δ-Proteobacteria)，以Fe(Ⅲ)为电子受体进行能量代谢.

相比于旱田土壤，稻田土壤由于其周期性淹水形成的厌氧条件更有利于MeHg的生成.本文主要对汞矿区农田土壤中汞甲基化的影响因素与作用机制进行研究，重点对不同处理条件下硫酸盐还原菌及铁还原菌对土壤汞甲基化的影响进行研究，同时研究了两种土壤不同培养方式(淹水和湿润)引起的土壤理化性质以及微生物丰度的变化.

供试土壤是2014年7月采自陕西旬阳汞矿区(北纬33°05′50″~33°06′30″，东经109°24′40″~109°26′50″)的旱田土壤和稻田土壤，用不锈钢铲采集旱田(种植农作物为玉米)和稻田表层耕作土(0~20 cm)，土壤类型为黄棕壤.土壤样品采集后放入自封袋，冷冻避光保存.

实验所用高压灭菌锅是日本Tomy Digital Biology公司生产的SS-325型高压灭菌锅.本实验所使用的Na₂SO₄(1 mol·L^-1), Na₂MoO₄(1 mol·L^-1)均为优级纯，储备液由超纯水配制. Fe(OH)₃通过氢氧化钠(NaOH)和氯化铁(FeCl₃)共沉淀生成；所得沉淀用pH=3.5的柠檬酸溶液溶解沉淀，无沉淀生成即证明该氢氧化铁为无定形氢氧化铁^[11].

供试的土壤样品在自然风干后混匀，研磨过2 mm筛.取50 g土壤放入250 mL血清瓶中，按照模拟的旱田和稻田水分条件(旱田含水率30%，稻田水淹2 cm)加入去离子水在避光条件下预培养7 d.

对预培养后的旱田土壤和稻田土壤，为最大程度模拟采集地土壤汞甲基化作用，本实验以土壤中原有汞为汞源，不添加新鲜汞.实验分别设4个处理和1个对照，处理1为灭菌处理(Ab)：将预培养后的土壤放入高压灭菌锅内，120℃下灭菌30 min；处理2为SRB活性促进处理(SS)：添加SRB活性促进剂硫酸钠(Na₂SO₄)，添加量为50 mg·kg^-1；处理3为SRB活性抑制处理(IS)：添加SRB活性抑制剂钼酸钠(Na₂MoO₄)，添加量为100 mg·kg^-1；处理4为FeRB活性促进同时抑制SRB活性处理(SF)：添加FeRB活性促进剂无定形氢氧化铁[Fe(OH)₃]，同时添加SRB抑制剂Na₂MoO₄，其中Fe(OH)₃添加量为50 mg·kg^-1, Na₂MoO₄添加量为100 mg·kg^-1.每个处理设3个平行，在25℃下避光培养30 d.

土壤微生物DNA采用天根土壤DNA提取试剂盒提取(TIANamp Soil DNA Kit).

异化亚硫酸盐还原酶(DSR)是SRB异化硫酸盐还原过程中的一个关键酶，只存在于异化硫酸盐还原原核生物中. DSR被发现存在于所有已知的SRB细胞内，并且具有高度保守的序列，因此这种酶被广泛的应用于分析环境中SRB的丰度和群落多样性.功能基因dsrAB是编码DSR酶的关键基因，被用以分析土壤和沉积物SRB的丰度和群落结构^[12].本实验以dsrAB基因作为靶基因，利用实时荧光定量PCR对SRB的丰度进行检测.探针和引物由上海生物工程公司完成，引物序列为DSRp2060F(5′-CAACATCGTYCAYACCCAGGG-3′)和DSR4R(5′-GTGTAGCAGTTACCGCA-3′)^[13].具体反应体系和反应程序如表 1所示.

表 1 (Table 1)

表 1 实时荧光定量PCR的引物、反应体系和反应程序 Table 1 Probes, primers, PCR mixtures and conditions used for the Quantitative Real-time PCR

表 1 实时荧光定量PCR的引物、反应体系和反应程序 Table 1 Probes, primers, PCR mixtures and conditions used for the Quantitative Real-time PCR

土壤样品中的总汞(T-Hg)采用HydraⅡ直接测汞仪(美国利曼公司生产)直接测定.土壤中MeHg用硫酸铜(CuSO₄)和溴化钾/硫酸(KBr/H₂SO₄)溶液提取2.5 h，然后向提取液中加入二氯甲烷(CH₂Cl₂)进行萃取.吸取5 mL二氯甲烷萃取液到40 mL高纯水中，通过氮吹将二氯甲烷去除.取5 mL所得溶液，加入0.5 mL醋酸钠缓冲液，30 μL衍生化试剂四乙基硼酸钠(NaBEt₄)，静置30 min后通过Tekran2700甲基汞分析仪(美国安普公司生产)测定.实验采用土壤标准品对T-Hg和MeHg测定结果进行质量控制.土壤标准品(GSBZ50013-88) 的T-Hg浓度为0.25mg·kg^-1，实验测得T-Hg浓度为(0.23±0.05) mg·kg^-1(n=3)，回收率为92%. MeHg的土壤标准品(EMC-580) 中MeHg浓度为75 μg·kg^-1，实验室测得MeHg浓度为(68.5±3.0) μg·kg^-1(n=3)，回收率为91%.

土壤氧化还原电势(Eh)采用铂电极直接测定.土壤pH值采用HQ30d(美国哈希公司生产)测定.土壤总有机碳(TOC)采用重铬酸钾氧化-分光光度法测定(HJ 615-2011).土壤可溶性有机碳(DOC)测定用Torch总有机碳分析仪(美国利曼公司生产)测定.土壤可溶性硫化物采用亚甲基蓝-分光光度法测定(GB/T 16489-1996).

供试土壤基本理化性质分析结果列于表 2.受汞矿开采和冶炼活动的影响，采集的农田土壤具有较高的T-Hg浓度，旱田土壤和稻田土壤T-Hg浓度分别为11.2 mg·kg^-1和12.6 mg·kg^-1.由于Hg的输入，农田土壤中部分无机汞转化为MeHg，并且稻田土壤的MeHg浓度(22.3μg·kg^-1)高于旱田土壤的MeHg浓度(7.8 μg·kg^-1).受耕作方式的影响，稻田土壤含水率(80%)高于旱田土壤的含水率(30%).此外，稻田土壤的TOC(5.4%)高于旱田土壤的TOC(4.8%)，这可能是由于稻田周期性淹水造成的厌氧环境减缓了土壤有机质的矿化作用，使更多的有机质赋存于土壤中.

表 2 (Table 2)

表 2 汞供试土壤基本理化性质 Table 2 Basic physiochemical properties of tested soil

表 2 汞供试土壤基本理化性质 Table 2 Basic physiochemical properties of tested soil

由于实验使用的汞矿区旱田土壤和稻田土壤中已经含有一定量的MeHg，为了更准确表示培养方法对土壤MeHg形成的影响，本研究以培养过程中MeHg的浓度增量来表示不同处理条件下的汞甲基化能力.

MeHg浓度增量=培养后土壤MeHg浓度-土壤MeHg背景浓度

培养过程中，不同处理方式对旱田土壤和稻田土壤的MeHg浓度都有不同程度的影响. 图 1和图 2分别为不同处理方式对旱田和稻田土壤MeHg的增量.

图 1

Fig. 1

图 1 不同处理方式对旱田土壤MeHg增量 Fig. 1 Increments of MeHg concentrations in dry land soils with different treatments

图 2

Fig. 2

图 2 不同处理方式对稻田土壤MeHg增量的影响 Fig. 2 Increments of MeHg concentrations in paddy field soils with different treatments

Ab处理的旱田和稻田土壤中MeHg增量出现负值.这可能是由于高温高压的灭菌方式使土壤中原有的MeHg发生分解而培养过程中没有新的MeHg生成，造成土壤中原有的MeHg浓度降低使MeHg增量出现负值.其余的处理方式都不同程度地促进土壤MeHg的形成，并且不同处理方式对旱田土壤和稻田土壤中MeHg增量的影响具有相同的规律.旱田土壤和稻田土壤MeHg的增量大小顺序为：SS处理>对照>SF处理>IS处理.在培养的30 d内，对于旱田土壤，SS处理和对照土壤中的MeHg增量都随培养时间的延长而增加，SS处理土壤中的MeHg增量从0.15 μg·kg^-1增加到0.38 μg·kg^-1，对照土壤中的MeHg增量从0.06 μg·kg^-1增加到0.25 μg·kg^-1.对于稻田土壤，对照土壤中的MeHg增量随着培养时间的延长持续增加，从0.06 μg·kg^-1增加到1.35 μg·kg^-1，而SS处理的MeHg增量在整个培养期内经历了先增长后降低的变化，在3~15 d内，MeHg增量从1 μg·kg^-1增长到2 μg·kg^-1，随后在剩余的15 d内，MeHg浓度降低到1.8 μg·kg^-1.旱田土壤和稻田土壤中IS处理的MeHg浓度只有极小量的增加，与对照样相比，旱田土壤MeHg增量仅为其1/8，稻田土壤MeHg增量为1/17.此外，SF处理的MeHg增量也较小，旱田和稻田最大增量分别为0.018 μg·kg^-1和0.025 μg·kg^-1，远低于相同培养条件下的SS处理和对照样.该结果与St. Pierre等^[14]的研究结果相符，其对北极地区沉积物汞甲基化速率研究发现，在14℃温度条件下，对照处理和促进SRB活性的处理汞甲基化速率分别是0.4pmol·(g·h)^-1和1.1pmol·(g·h)^-1，均高于促进FeRB活性处理的0.02 pmol·(g·h)^-1.

上述研究结果表明，汞矿区农田土壤中汞甲基化起主导作用的是微生物作用，这与大多数研究^{[15, 16]}结果一致.已有研究表明，土壤非生物甲基化速率仅为纯培养条件下微生物甲基化作用的1/10⁴，且生成的MeHg极不稳定易于分解，因此在实际条件下评估土壤中的汞甲基化需要优先考虑微生物作用.此外，实验中SF处理并没有较强的汞甲基化作用，说明本实验中SRB是主要的汞甲基化细菌.这可能是由于FeRB的汞甲基化能力远远低于SRB，Gilmour等^[17]也在相同纯培养条件下研究发现FeRB的汞甲基化率低于SRB.因此，在本研究中，在所研究的汞矿区土壤中SRB是控制MeHg形成的关键微生物.

在相同的培养条件下，旱地土壤和稻田土壤表现出不同汞甲基化能力.在实验培养的30 d内，对照和促进SRB活性处理的稻田土壤中MeHg增量均显著高于相同处理的旱田土壤中MeHg增量(P＜0.05).其中对照土壤的MeHg增量，稻田土壤是旱田土壤的4~6倍；促进SRB活性的SS处理的MeHg增量，稻田土壤是旱田土壤的7~9倍.该结果进一步表明，相比于旱田土壤，稻田土壤具有更高的汞甲基化能力.

实时定量PCR结果显示，不同的处理方式对土壤SRB丰度的影响并不显著(P>0.1). 图 3和图 4分别为不同处理方式对旱田和稻田土壤中SRB丰度的影响.从中可知，对照和SS处理的土壤dsrAB基因拷贝数略高于IS处理和SF处理.

图 3

Fig. 3

图 3 旱田土壤dsrAB基因的拷贝数 Fig. 3 The dsrAB gene numbers in dry land soil

图 4

Fig. 4

图 4 稻田土壤dsrAB基因的拷贝数 Fig. 4 The dsrAB gene numbers in paddy field soil

但是进一步对比旱田土壤和稻田土壤中的dsrAB基因拷贝数可知，稻田土壤的dsrAB基因拷贝数显著高于旱田土壤.对照样中，稻田土壤dsrAB基因拷贝数为1.8×10⁸~3×10⁸ copies·g^-1，该数值与文献中报道的稻田土壤以及沉积物中dsrAB基因拷贝数值相近，例如，Wang等^[18]和Liu等^[19]检测到贵州万山地区稻田土dsrAB基因拷贝数为0.6×10⁸~3.5×10⁸copies·g^-1，Kondo等^[20]发现淡水河的沉积物中dsrAB基因拷贝数为0.2×10⁸~5.7×10⁸copies·g^-1.同期对照处理的旱田土壤中dsrAB基因拷贝数为1×10⁸~1.25×10⁸copies·g^-1，为稻田土壤的1/3，可能是由于稻田土壤在淹水的培养而形成厌氧氛围，而旱地土壤处于好氧氛围的原因.已有研究表明^[21]，SRB属于厌氧菌适于在厌氧条件下生存，环境氧浓度升高会导致参与SRB硫酸盐代谢的焦磷酸酶迅速失活，使SRB无法完成正常的能量代谢而失去活性，因此，处于厌氧状态的稻田土壤更易于SRB的生存，这也可能是造成稻田土壤MeHg生成量明显高于旱地土壤MeHg的主要原因.进一步分析土壤MeHg增量和dsrAB基因拷贝数的关系发现，对照样和SS处理的旱田土壤和稻田土壤中MeHg增量和dsrAB基因拷贝数有显著的正相关性(R²=0.57，P＜0.01)，见图 5.因此，SRB是土壤中主导汞甲基化的微生物，且其丰度对MeHg的形成具有显著的影响.

图 5

Fig. 5

图 5 MeHg增量与dsrAB基因拷贝数的相关关系 Fig. 5 Relationships between dsrAB gene numbers and increments of MeHg concentrations in soils

土壤汞甲基化作用不仅受汞甲基化微生物的影响，一些环境因素，包括：氧化还原电势(Eh)、pH、有机质以及硫化物对MeHg的生成也起到促进或抑制的作用^{[22, 23]}.实验培养期内，旱田土壤Eh没有发生明显变化[图 6(a)], 但稻田土壤的Eh出现显著的下降[图 6(b)].在培养的前5 d除Ab处理外，其他处理的Eh迅速从120 mV下降到-75~-80 mV.说明稻田土壤的水淹条件明显降低了土壤Eh值，这种厌氧氛围促进了稻田土中SRB的生长进而促进了MeHg的形成.旱田土壤的pH值没有发生规律性变化[图 7(a)].受稻田土壤Eh下降的影响，除Ab处理外，稻田土壤pH在培养的前5 d从6.5上升到7.1，并保持在7.1左右[图 7(b)].

图 6

Fig. 6

图 6 实验培养期内土壤Eh Fig. 6 Values of Eh in soil samples during the incubation period

图 7

Fig. 7

图 7 实验培养期内土壤pH Fig. 7 Values of pH in soil samples during the incubation period

此外，通过对土壤可溶性有机质(DOC)的分析发现(图 8)，Ab处理的旱田土壤和稻田土壤的DOC出现了明显的下降，这可能是由于高温高压条件使土壤中的小分子糖、可溶性有机酸等DOC发生分解从而降低了DOC的浓度，而其余处理方式对土壤DOC浓度并没有显著的影响.对对照样和SS处理的土壤中MeHg增量与pH和DOC的相关性进行分析(表 3)，结果表明pH和DOC与土壤MeHg的增量没有显著的相关性.这与王欣悦等^[24]和仇广乐等^[25]通过大范围野外调查的结果不同，本实验条件下样品pH和DOC浓度变化较小(如图 8)，该变化范围对MeHg生成影响不构成显著影响.

表 3 (Table 3)

表 3 旱田土壤和稻田土壤MeHg增量与pH值, DOC的相关性 Table 3 Correlation between increments of MeHg concentrations and pH and DOC in soils of dry land and paddy field

表 3 旱田土壤和稻田土壤MeHg增量与pH值, DOC的相关性 Table 3 Correlation between increments of MeHg concentrations and pH and DOC in soils of dry land and paddy field

图 8

Fig. 8

图 8 实验培养期内土壤DOC浓度 Fig. 8 Values of DOC in soil samples during the incubation period

已有研究表明^{[25, 26]}, 土壤可溶性硫化物对土壤MeHg浓度具有显著影响(图 9)，硫化物可以抑制土壤MeHg的形成，其原因主要是可溶性硫化物可以与土壤中的Hg(Ⅱ)结合形成难溶的汞的硫化物，难以被汞甲基化微生物利用，进而降低了MeHg的形成.本实验中，旱田土壤对照样和SS处理的样品可溶性硫化物与MeHg增量并没有显著地相关性(P>0.05).但是，稻田土壤SS处理样品在培养的第15 d MeHg增量开始降低，同时上覆水中不断出现红褐色沉淀，对其进行元素分析发现其主要成分为：S=58%，C=22%，土壤孔隙水中的硫化物也在培养过程从0增长到2 mmol·L^-1(如图 9).硫化物的增加可能是由于SRB的呼吸作用使土壤中的硫酸盐转化为硫化物^[27]，而这些硫化物降低了土壤中可利用态汞，进而抑制了土壤MeHg的形成.

图 9

Fig. 9

图 9 稻田促进SRB活性处理(SS)土壤MeHg增量和孔隙水硫化物浓度 Fig. 9 Values of increments of MeHg concentrations in soils and sulfide concentrations in pore water in SRB stimulated(SS) treatment

(1) 本文通过实验室模拟培养实验对旱田土壤和稻田土壤汞甲基化作用进行研究.结果表明，不同处理方法对土壤甲基汞生成具有显著影响，其中以促进SRB处理的土壤MeHg生成量最大，而抑制SRB处理的MeHg生成量最低.此外，灭菌处理的土壤甲基汞增量为负. dsrAB基因拷贝数结果显示，土壤dsrAB基因拷贝数与土壤MeHg增量呈显著正相关性.表明该汞矿区农田土壤的汞甲基化过程主要是SRB主导的微生物甲基化过程.

(2) 相比于旱田土壤，稻田土壤由于淹水形成的厌氧环境更有利于SRB的生存，具有更高的汞甲基化能力.

(3) 此外，本实验中环境因素pH值，DOC与土壤MeHg增量没有明显的相关性，但是对于SS处理的稻田土，由于SRB的代谢作用，培养过程中土壤溶液中的硫化物不断增加，在一定程度上抑制了MeHg的生成.