2017, Vol. 38
2. 陕西省宝鸡市辛家山林业局, 宝鸡 721700;
3. 西北农林科技大学林学院, 杨凌 712100
, XU Chen-yang1, WANG Qiang1, ZHANG Fan2, MA Wu-gong2, HE Wen-xiang1, HOU Lin3, GENG Zeng-chao1
2. Forestry Bureau of Xinjiashan, Baoji 721700, China;
3. College of Forestry, Northwest A & F University, Yangling 712100, China
森林生态系统中植被和土壤大约含有1 240 Pg的碳(C)，土壤中的碳约占其中的三分之二，在全球碳循环过程中起着重要的作用[1].土壤中的碳主要来源于根系及枯落物的分解、光合产物经根系在土壤中的分配等[2]，在这些过程中均有微生物的参与，因此土壤微生物是土壤生态系统生物地球化学过程的重要组成部分[3].在土壤微生物中，细菌的种类和数量最多[4]，其在土壤肥力调节、土壤结构形成、植物生长发育等方面起着极其重要的作用[5, 6].因此针对土壤细菌群落多样性的研究具有非常重要的意义.
土壤微生物作为生态系统中养分转化的主要驱动因子，在一定程度上可以反映土壤剖面养分状态. O'Brien等[7]和Lindahl等[8]对寒带和温带森林土壤的研究表明，土壤表层主要以营腐生生长的真菌为主，深层土壤以菌根真菌为主.也有研究发现深层土壤存在着大量微生物，Fierer等[9]的研究表明，即使在深2m的土壤中微生物总生物量也达到了表层土壤(＜25 cm)的35%.尽管对秦岭森林土壤微生物群落的研究已经有许多，但是这些研究多集中在表层土壤(＜25 cm)[10, 11]，针对深层土壤中的微生物群落组成的研究较少，其研究结论并不能系统说明不同土层间微生物群落组成特征[12, 13].因此研究秦岭土壤微生物在土壤剖面上的分布规律，有助于了解土壤剖面养分转化过程.
此外，在过去很长一段时间，对土壤微生物的研究方法多采用传统的平板培养法、Biolog微平板法、磷脂脂肪酸分析(PLFA)技术、限制性片段长度多态性聚合酶链反应(PCR-RFLP)等技术[11, 14, 15].这些方法仅能测定土壤中部分细菌，因此低估了土壤中细菌的数量与种类[16].随着分子生物学的快速发展，高通量测序技术(也被称为第二代测序技术)的发展，为人们认识土壤微生物多样性提供了新的契机.采用Illumina高通量测序仪进行土壤细菌群落的研究，使得简单、快速、准确、全面地获取土壤细菌信息成为可能，目前已经被广泛用于土壤微生物多样性研究.
红桦生长稳定、抗病虫害、枝繁叶茂、根系发达，能在特别瘠薄的土壤上生长，常常被作为荒地造林和森林更新的树种，在维持秦岭辛家山林区生态平衡和生态系统恢复重建中有重要意义[17].关于秦岭红桦林的研究主要集中在群落稳定性、土壤养分等方面[17, 18]，但对红桦林土壤细菌群落组成的研究鲜有报道，因此本文选取秦岭辛家山红桦林的土壤为研究对象，采用MiSeq高通量测序方法，对其土壤剖面细菌群落结构进行分析，通过揭示该区域土壤细菌多样性、群落结构及相对丰度在土壤剖面的变化规律，填补红桦林土壤细菌群落研究的空白，以期为森林生态系统土壤剖面养分循环提供微生物生态学方面的理论依据.
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究区位于陕西省宝鸡市西南部的秦岭辛家山通天河国家森林公园(34°10′~34°20′N，106°28′~106°38′E).辛家山林区位于秦岭西部南坡，秦岭主梁南侧嘉陵江上游，境内属暖温带半湿润山地气候区，由于山地高差悬殊，气候垂直变化明显，小气候差异大，年平均气温7.6℃，年平均降雨量900 mm，多集中于7、8、9这3个月.地势西北高、东南低，最高海拔2 738.7 m，最低海拔1 580 m，土壤类型以暗棕壤为主[19].该区域森林覆盖率96.8%，林区资源丰富，乔木主要有云杉(Picea asperata)、冷杉(Abies fabri)、油松(Pinus tabulaeformis)、红桦(Betula albosinensis Burkill)、锐齿栎(Quercus aliena var. acuteserrata)、辽东桦(Betula schmidtii Regel)、华山松(Pinus armandii Franch)、漆树(Toxicodendron vernicifluum)、山杨(Populus davidiana)、鹅耳栎(Carpinus turczaninowii)等；灌木主要有悬钩子(Rubus corchorifolius)、栓翅卫矛(Euonymus phellomanes Loes)等；草本主要有龙芽草(Agrimonia pilosa Ldb.)、异叶败酱(Patrinia heterophylla Bunge)、艾蒿(Artemisia argyi Levl.)、茜草(Rubia cordifolia Linn.)、披针叶苔草(Carex lanceolata Boott)等[20, 21].
1.2 土壤样品的采集与处理2015年7月在红桦纯林(林下无灌木)进行土壤样品采集，根据样地环境条件，确定3个样地，每个样地大小为20 m×20 m，样地基本情况见表 1.在各个样地内随机设置3个1 m×1 m的采样样方，并用直径5 cm的土钻在每一个样方内四角和中心位置选取5个采样点，除去地表凋落物后，每个采样点按照0~10 cm(BA1)、10~20 cm(BA2)、20~40 cm(BA3) 和40~60 cm(BA4) 分层进行采样，同时采集土样装入铝盒中测定土壤含水量.最后，将每个样方内各采样点的土样去除根和石头后按层混合均匀，作为分析样品带回实验室，共计12份土样.土样带回实验室后分成3份，一份新鲜样, 过2 mm钢筛后立即贮藏于-80℃的冰箱内，用来提取土壤DNA；一份存储于4℃冰箱中，用于测定土壤可溶性碳；另一份置于通风、阴凉、干燥的室内风干，以四分法取样磨细并通过孔径为2 mm、0.25 mm的筛，测定土壤的基本性质(土壤有机碳、全氮、土壤pH).
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表 1 样地基本概况 Table 1 Basic status of sampling plots |
1.3 样品理化指标的测定
土壤各项理化指标的测定均采用常规方法，3个样地土样分别进行指标测定，每个土样3次平行.其中，土壤pH采用电位法(水:土=2.5:1) 测定[22]；土壤水分含量测定采用(105±2)℃烘箱烘干法；土壤有机碳含量采用重铬酸钾氧化外加热法测定[23]；土壤全氮含量采用半微量凯氏法测定[24]；土壤可溶性碳含量测定采用K2SO4浸提法[25].
1.4 DNA提取、PCR扩增和16S rDNA测序本研究对3个样地土壤分别提取DNA进行扩增，再进行高通量测序.土壤细菌DNA提取用的是PowerSoil® DNA Isolation Kit(美国MoBio公司)试剂盒.利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和1%琼脂糖凝胶电泳进行总DNA质检检验合格后存储于-80℃条件下直到使用.扩增细菌16S rRNA基因的V3~V4区，使用的通用引物为正向引物341F(5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)和反向引物806(5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′).在通用引物的5′端和3′端加上适合MiSeq PE300测序的Barcode序列，完成特异性引物的设计.每个样品所采用的Barcode序列见表 2. PCR反应条件如下：预变性95℃ 3 min；98℃ 10 s，72℃ 20 s，94℃ 20 s，65℃ 10 s，72℃ 10 s，12个循环；94℃ 20 s，58℃ 30 s，72℃ 30 s，72℃ 150 s，11个循环. PCR反应体系40 μL：含正向和反向引物各1 μL，10 ng的DNA模板，20 μL的PCR系统酶共混物(Roche Applied Sciences, Indianapolis, IN, USA)，并补充无菌水使最终的反应体积为40 μL.采用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，并用AxyPrep DNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物.回收后，利用Thermo NanoDrop 2000紫外微量分光光度计和2%琼脂糖凝胶电泳进行文库质检. 16S rDNA序列的高通量测序通过上海锐翌生物科技有限公司Illumina MiSeq PE300进行上机测序.
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表 2 Barcode信息表 Table 2 Information table of Barcode |
1.5 生物信息学分析
通过Illumina平台进行Paired-End测序，Paired End Reads通过Reads之间的Overlap关系拼接成长Reads，并对拼接后的Reads进行质控，得到Clean Reads.用Usearch进行OTU聚类的操作，Usearch聚类时，先将singletons过滤掉，将Reads按照丰度从大到小排序，通过97%相似度的标准聚类，对聚类后的序列进行嵌合体过滤后，得到OTU(operational taxonomic units)，每个OTU被认为可代表一个物种[26].对每个样品的Reads进行随机抽平处理，并提取对应的OTU序列.然后使用Qiime软件，做Alpha多样性指数的稀释曲线，根据稀释曲线选择合理的抽平参数，利用Qiime软件对得到的抽平后的OTU进行分析，首先从OTU中分别提取一条Read作为代表序列码，使用RDP方法[27]，将该代表序列与16S数据库比对，从而对每个OTU进行物种分类.归类后，根据每个OTU中序列的条数，从而得到OTU丰度表，最后根据该OTU丰度表进行后续分析.
1.6 数据处理 1.6.1 基本数据处理采用Microsoft Excel 2013和SPSS 20.0进行数据处理，应用单因素方差分析法(One-Way ANOVA)分析不同样地间各指标的差异显著性，各个指标之间采用Pearson相关系数法进行相关性分析.土壤因子与细菌种群分布特征之间的关系利用Canoco 5.0进行冗余分析(RDA)研究土壤性质对细菌分布特征的影响.
1.6.2 多样性指数分析本文采用Alpha多样性指数对细菌群落进行多样性分析.① Chao1：是用Chao1算法估计群落中含OTUs数目的指数，Chao1在生态学中常用来估计物种总数. ② Shannon：用来估算样品中微生物的多样性指数之一.它与Simpson多样性指数均为常用的反映Alpha多样性的指数. Shannon值越大，说明群落多样性越高. ③ Simpson：用来估算样品中微生物的多样性指数之一，在生态学中常用来定量地描述一个区域的生物多样性. Simpson指数值越大，说明群落多样性越低.
2 结果与分析 2.1 土壤剖面理化性质分析由表 3可知，土壤有机碳含量、全氮含量、有机碳/全氮、可溶性有机碳含量均随土层的加深而减小.样地1、3中土壤pH值随土层的加深先升高再降低，在20~40 cm处达到最大值，样地2土壤pH随土层的加深而升高.样地1中土壤含水量随土层的加深先降低再升高，0~10 cm与10~20 cm、20~40 cm及40~60 cm差异显著(P＜0.05)，3个样地土壤含水量均在0~10 cm处为最大值. 3个样地中各土层的平均值存在差异，土壤pH介于6.11~6.42之间，在0~40 cm随土层深度的增加而显著升高(P＜0.05)，而在20~40 cm与40~60 cm差异并不显著(P>0.05).土壤平均含水率介于30.27%~35.90%之间，随土层深度的增加而显著降低(P＜0.05). 0~10 cm土层的有机碳含量为67.44g·kg-1，较10~20 cm、20~40 cm及40~60 cm分别增加15.88%、53.17%及107.38%，土层间差异显著(P＜0.05).土壤全氮含量的变化规律与有机碳一致，0~10 cm土层含量较40~60 cm高2.05g·kg-1，0~10 cm与10~20 cm差异不显著(P>0.05).土壤剖面的C/N在10.26~12.92之间，土层间呈现显著性差异(P＜0.05).土壤可溶性有机碳含量随土层的加深而降低，0~10 cm与20~40 cm、40~60 cm差异显著(P＜0.05)，10~20 cm与40~60 cm差异显著(P＜0.05).
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表 3 土壤剖面的理化性质1) Table 3 Physico-chemical characteristics of the analyzed soil depth samples |
2.2 高通量测序结果和Alpha多样性分析
由表 4可知，红桦林4个土层平均获得58 524条clear reads和1 493个OTUs. OTUs数量的范围为1 668~1 354，土层间差异不显著(P>0.05).土壤细菌物种累积曲线在开始阶段表现为急剧上升趋势，随着样本量的加大曲线很快趋于平缓，说明试验分析土壤细菌样本量充足，可以进行数据分析(图 1).
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表 4 不同处理土壤细菌多样性指数1) Table 4 Soil bacterial diversity indexes in different treatments |
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图 1 土壤细菌物种累积曲线 Fig. 1 Species accumulation curves of soil bacteria |
由表 4可知，在97%分类水平下，不同处理土壤Chao1指数、Shannon指数有所不同，但差异均不显著. 3个样地中，Chao1指数在0~10 cm处达到最大值，在40~60 cm处达到最小值. Shannon指数的最大值均在0~10 cm，样地1的最小值在40~60 cm，而样地2、样地3的最小值在20~40 cm处. Chao指数平均值随着土层深度的增加而减小，在20~40 cm达到最大值. Shannon指数平均值的大小表现为0~10 cm>10~20 cm>20~40 cm>40~60 cm. 4个土层Simpson指数的均值相同.
2.3 Alpha多样性指数与土壤理化性质的相关性分析由表 5可知，Chao1与土壤C/N(R=0.695；P＜0.05)、土壤可溶性有机碳(R=0.598；P＜0.05) 呈显著正相关.与土壤全氮、有机碳、含水量、土壤pH未见显著性相关(P>0.05). Shannon指数与土壤C/N呈显著相关关系(P＜0.05)，相关系数为0.692. Simpson指数与土壤理化性质各项指标均未呈现显著相关关系(P>0.05).
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表 5 Alpha多样性指数与pH值、含水率、有机碳、全氮、C/N、可溶性有机碳分析1) Table 5 Correlation coefficient between Alpha diversity and pH, soil water content(SWC), soil organic carbon(SOC) content total nitrogen(TN), C/N, dissolved organic carbon(DOC) in different soil layers |
2.4 不同土层土壤微生物群落结构特征
由图 2(a)可知，在门分类水平上，相对丰度最大的3个门所占比例总和达到70%以上，分别是酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria).酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度在40~60 cm达到最大值62.88%，较0~10 cm、10~20 cm和20~40 cm土层分别增加32.49%，21.39%和37.26%.而变形菌门(Proteobacteria)的相对丰度则随着土层深度的增加而减少，0~10 cm较40~60 cm高79.08%.放线菌门(Actinobacteria)变化范围为7.86%~12.58%.其次是拟杆菌门(Bacteroidetes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、Latescibacteria、硝化螺旋菌门(Nitrospirae)，其变化范围分别为2.01%~5.08%、2.62%~6.95%、2.91%~6.07%、1.89~2.64%.
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图中SBA1、BA2、 BA3、BA4分别代表0~10、10~20、20~40、 40~60 cm 土壤层，每个土层3个重复 图 2 门和属分类水平下的细菌群落相对丰度 Fig. 2 Relative abundance of bacterial communities at phylum level and genus level |
由图 2(b)可知，在属分类水平上，在4个土层中Gp4、Gp6、Gp16均为主导细菌属，相对丰度总和达到40%以上. Gp4平均值的变化范围为21.26%~25.44%，在10~20 cm达到最大值，40~60 cm处达到最小值.Gp6的变化范围为14.13%(20~40 cm)~15.81%(10~20 cm). Gp16相对丰度的大小顺序为：40~60 cm>0~10 cm>10~20 cm>20~40 cm.相对丰度较小的细菌属为Latescibacteria_genera_incertae_sedis、 Gp3、Gp7，变化范围分别为4.30%~7.45%、1.53%~4.34、2.20%~3.73%，以及Nitrospira(硝化螺旋属)、Gp17、Gp2、Gp7、Gp1等.
2.5 土壤理化性质对细菌群落的影响为了解环境因子与细菌群落的关系，对细菌属和每个样地环境因子进行相关分析(表 6).结果表明：酸杆菌门(Acidobacteria)的相对丰度与全氮呈显著负相关(P＜0.05)，与土壤有机碳、C/N、可溶性有机碳呈极显著负相关(P＜0.01).变形菌门(Proteobacteria)与土壤含水量呈显著相关(P＜0.05)，与土壤有机碳、可溶性有机碳呈极显著相关(P＜0.01).放线菌门(Actinobacteria)与土壤有机碳、可溶性有机碳呈极显著正相关(P＜0.01).拟杆菌门(Bacteroidetes)与土壤含水量呈显著正相关(P＜0.05).绿弯菌门(Chloroflexi)与土壤有机碳、可溶性有机碳呈显著正相关(P＜0.05).硝化螺旋菌门(Nitrospirae)与土壤pH呈显著正相关(P＜0.05) 与全氮呈显著负相关(P＜0.05)，与土壤含水量、土壤有机碳、可溶性有机碳呈极显著负相关(P＜0.01).
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表 6 土壤基本性质与土壤细菌相对丰度的相关性1) Table 6 Correlation between soil properties and the relative abundance of soil bacteria at the phylum level |
为了解环境因子造成的样品的聚类和分离情况，在属水平上对细菌群落进行冗余分析(RDA)(图 3).从图中可以看出，4个土壤层细菌群落分布存在差异，0~10 cm和10~20 cm土层主要位于第一、二象限，20~40 cm和40~60 cm土层主要位于三、四象限.土壤pH与0~10 cm和10~20 cm土层细菌群落呈负相关，但和20~40 cm、40~60 cm土壤层细菌群落正相关.而土壤含水量、有机碳、全氮、C/N、可溶性有机碳与0~10 cm和10~20 cm土层呈正相关，但和20~40 cm、40~60 cm土壤层细菌群落负相关.土壤可溶性碳含量(F=4.4, P=0.003) 是影响细菌群落组成的主要因素，解释率为30.5%，其次是C/N(F=4.2, P=0.012)、土壤pH(F=3.0, P=0.023)，解释率分别为22.2%、13.0%(表 7).土壤pH、含水量、有机碳含量、全氮、C/N比、可溶性有机碳共同解释了76%的细菌群落组成变化.土壤因素的影响顺序为：可溶性碳>C/N>pH>土壤全氮>有机碳>土壤含水量.
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图中SOC、TN、SWC和DOC分别代表土壤有机碳、土壤全氮、土壤含水量和可溶性有机碳；BA1、BA2、BA3、BA4分别代表 0~10、10~20、20~40、40~60 cm 土壤层，每个土层3个重复 图 3 基于土壤细菌群落分布和土壤环境因子的冗余分析 Fig. 3 Redundancy analysis(RDA) used to explore the relationships between bacterial communities at the phylum level and selected soil properties |
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表 7 土壤细菌与土壤理化性质的相互关系1) Table 7 Interactions between soil properties and soil bacteria |
3 讨论 3.1 土壤细菌多样性在土壤剖面的分布特征
土壤微生物群落是土壤生态功能的基础，它通过参与土壤有机质分解和矿化等过程影响土壤养分循环，调节和指示土壤功能[28].例如：酸杆菌门(Acidobacteria)能够降解复杂的木质素[29]与纤维素[30]为土壤提供养分.在森林生态系统中，由于凋落物的分解，养分转化及在土壤中的迁移，导致了土壤养分在土壤剖面上存在差异，造成土壤细菌多样性也存在某种程度上的差别.本研究中0~10 cm土层土壤有机碳含量、全氮含量、可溶性碳含量显著高于其他3个土层，而细菌多样性也高于其他3个土层，这与Voříšková等[31]的研究结果一致.一方面，土壤表层养分来源广泛，这是导致其具有较高微生物多样性先决条件；另一方面，表层土壤养分含量高，为微生物提供了充足的能源[32].
本研究中红桦林土壤剖面上细菌多样性没有随土层的加深而显著性减少，这与Agnelli等[33]研究结果不同.导致这一结果的原因可能有以下两点：一方面，红桦林根系发达，深层土壤中根际为细菌提供了良好的生存环境，根系分泌物和根系凋落物为细菌生长提供了碳源[34]，从而丰富了深层土壤细菌群落[35]；另一方面，红桦林土壤剖面具有较高的可溶性有机碳含量.由表 3可知，40~60 cm土层可溶性有机碳含量为179.38 mg·kg-1，这与黄土高原森林土壤及三江平原湿地0~10 cm土层相近[36, 37].可溶性有机碳是土壤有机物中较为活跃的组分，容易被土壤微生物氧化分解，对微生物有较高活性的碳素，是土壤微生物活动的能源.
3.2 土壤细菌群落结构及相对丰度本研究中酸杆菌门是优势菌门，所占比例范围为45.80%~62.88%，与柳春林等[38]和Peralta等[39]研究结果一致. Lauber等[40]的研究发现在酸性土壤中，酸杆菌门(Acidobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)等是主要细菌类群. Rousk等[41]证明土壤pH是影响土壤细菌群落组成的主要影响因素.据以上分析，本研究揭示的秦岭红桦林土壤中酸杆菌门(Acidobacteria)占绝对优势的现象与土壤pH值呈酸性(6.1~6.42) 有关.本研究中，0~10 cm土层变形菌门(Proteobacteria)相对丰度高于40~60 cm土层，酸杆菌(Acidobacteria)相对丰度低于40~60 cm土层，导致这种变化的原因是不同土层养分含量的差异[42~44].变形菌门(Proteobacteri)相对丰度与土壤有机碳含量、可溶性有机碳呈正相关，说明变形菌门(Proteobacteri)具有嗜营养的特点，这与McCaig等[45]和Fazi等[46]研究一致. López-Mondéjar等[32]对温带落叶林土壤细菌的研究发现，在有机碳含量较高的土层，变形菌门(Proteobacteria)具有较高的相对丰度.本研究证明酸杆菌门(Acidobacteria)具有寡营养的特点.苏婷婷等[47]研究生物有机肥与磷肥配施对细菌群落的影响，结果表明增加土壤养分酸杆菌门(Acidobacteria)相对丰度并没有显著性改变. Dion[48]证明酸杆菌门(Acidobacteria)可以生长在土壤养分贫瘠的环境中.经RDA分析证明了秦岭红桦林土壤剖面上可溶性有机碳含量是影响细菌群落分布的主要因素.在属分类水平上，大多数的细菌属与其他学者的研究结果一致[49].
土壤环境、植物多样性是形成森林土壤微生物群落结构的主要因素[50]. Nacke等[51]在德国的研究表明, 土壤细菌群落的结构在很大程度上是受树种的影响.因此林分类型也可能是影响森林土壤微生物群落组成的因素之一.本研究仅选取红桦纯林土壤进行细菌群落分析，不同林型中细菌群落结构组成是否相同?影响因素是否一致?土壤细菌多样性与植物多样性的关系怎样?这些问题有待于进一步地研究.
4 结论(1) 高通量测序技术测序结果能够更加全面地反映土壤样品细菌群落的组成及结构，细菌多样性的大小顺序为：0~10 cm>10~20 cm>20~40 cm>40~60 cm.细菌多样性与可溶性有机碳呈显著正相关.
(2)4个土壤层中的优势细菌门为酸杆菌门(Acidobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)，主要的优势细菌属为Gp4、Gp6、Gp16.其相对丰度在土壤层之间具有差别.
(3) 细菌群落受多种土壤环境因子的影响，本研究中可溶性有机碳是影响秦岭红桦林土壤剖面细菌分布的主要因素.
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