随着工业化和经济的不断发展，化石燃料的燃烧所排放的温室气体正引起人类的广泛关注^[1].国际上提出了许多应对全球气候变化的新方法和新技术，其中，二氧化碳捕获与封存技术(carbon capture and storage，CCS)是目前国际社会公认的应对气候变化的重要对策和显著减少温室气体排放量的有效技术手段之一^{[2, 3]}.目前，一些国家(如美国、加拿大、挪威等)相继开展了CCS的技术研究和工程实践^{[4, 5]}，而我国仍处于起步阶段.

深部咸水层因分布广泛和储存容量大而被认为是CO₂地质储存的理想储层^{[6, 7]}，而在咸水层中，微生物是不可缺少的生命群落，且数量巨大，种类繁多^[8].微生物的参与对于CO₂-水-岩相互作用过程的演化起着非常重要的作用，特别是其动力学过程.它可以作为反应酶加快反应速率，或者以反应物的身份参与到反应中从而改变矿物溶解/沉淀的速率^{[9, 10]}.因此，微生物群落的结构、功能及其多样性会随着CO₂溶解-沉淀捕获过程做出动态的响应变化^[11~13].研究初期发现，CO₂-水-岩作用过程中矿物溶解或沉淀过程可以导致离子强度或终端电子受体分布(如三价铁离子)发生变化，进而影响微生物新陈代谢^[14~16].随后，Fierer等^[17]发现CO₂注入后由于碳酸的形成导致pH降低，从而对微生物多样性产生显著影响.随后，学者们发现了这些变化对CO₂地质储存过程中的地球化学及矿物学均会产生重要的影响作用^{[18, 19]}.然而，目前关于“微生物群落对CO₂-水-岩作用过程中地球化学变化的响应”的认知较少，且国内尚未见报道.

因此，基于我国某CO₂储层场地情况，本文开展了微生物介导的CO₂-咸水-砂岩作用的模拟实验研究.本文采用MiSeq高通量测序技术^{[20, 21]}，深入探究CO₂捕获过程中微生物群落结构的动态变化特征，以期为揭示CO₂地质储存过程的微生物学响应机制提供科学的理论依据.

实验菌种通过对某灌注场地深度600 m地下咸水层水样进行离心获得.气体选用纯度为99.5%的CO₂气体.所用样品为某场地砂岩岩心，实验前，将岩心样品加工成10 mm×10 mm×1 mm的试件.本实验温度设定为50℃，pH值为5^[22].咸水成分组成，Na⁺：7 667 mg·L^-1，Ca²⁺：2 955mg·L^-1，K⁺：197mg·L^-1，Mg²⁺：37 mg·L^-1，NO₃^-：0.197 6g·L^-1，Cl^-：13 731mg·L^-1，SO₄^2-: 1 000mg·L^-1，酵母膏：0.02 g·L^-1[20].

Qubit2.0 DNA检测试剂盒(上海生工生物工程有限公司)，生工琼脂糖回收试剂盒(cat:SK8131)，PBS缓冲溶液(pH7.0)，无水乙醇，氯仿，10×TE Buffer，1%的琼脂糖凝胶，Trans15k Marker，DL2000 DNA Marker，2×PCR Mix Buffer，RNasefree-ddH₂O，移液枪，1.5 mL离心管，50 mL离心管，天平，烧杯，涡旋振荡器，水浴锅，制冰机，TGL-16M微量高速离心机，PCR仪，凝胶成像仪，电泳槽.

实验设备为容积200 mL的高温高压反应釜，置于可恒温控制的加热装置内，反应釜最高工作压力为25 MPa，加热装置最高工作温度为120℃.取样装置采用自行设计的取样管，连接反应釜体进行取样操作，反应釜与取样装置如图 1所示.

图 1

Fig. 1

图 1 实验装置设计示意 Fig. 1 Design of experimental device

在厌氧培养箱中，取离心后的菌样加入到已灭菌的MSM培养基中，在MSM培养基中通入CO₂气体，并将培养瓶的顶空部分充满CO₂气体，用锡箔纸密封瓶口.于55℃、110 r·min^-1的恒温振荡培养箱中连续培养至浑浊.

将培养瓶中的菌样离心(10 mL离心管)，去上清液，倒入配置好的地层水漩涡振荡混匀，在厌氧培养箱中向反应釜中投加离心后的菌样，岩样17 g，地层水样170 mL，即固液比为1:10.并充入CO₂气体至压力为3 MPa，在55℃条件下连续运行，每60 d进行一次取样，样品按取样周期编号，分别为0 M：初始样品；2 M：反应进行到2个月时的样品；4 M：反应进行到4个月时的样品；6 M：反应进行到6个月时的样品.通过分析细菌16S rRNA基因高通量测序结果，研究CO₂-咸水-砂岩作用过程中微生物群落变化特征.

参照OMEGA土壤提取试剂盒说明书进行提取.此具体步骤如下：称取500 mg玻璃珠于10 mL离心管中，并加入1 mL SLX MLUS缓冲液，混匀3~5 min；加入100 μL DS缓冲液并混匀；70℃水浴10 min，持续振荡(为使菌类裂解完全可以提高温度至90℃)；3 000 r·min^-1室温离心3 min，取800 μL上清液至干净2 mL离心管中，加入270 μL SP2缓冲液，振荡混匀；冰浴5 min，11 000 r·min^-14℃离心5 min；取上清到新2 mL离心管中，并加入0.7倍体积的异丙醇(预冷处理)，倒转离心管混匀，在-20℃放置1 h；11 000 r·min^-1，4℃离心10 min，收集DNA；小心除去上清，倒置管于吸水纸上1 min；加入70℃预热Elution 200 μL振荡，65℃水浴约15 min溶解DNA，并重复两次.将抽取的基因组DNA用0.8%的琼脂糖凝胶电泳检测, 以检测其完整性.

针对细菌16S rRNA基因V3+V4区设计含barcode的特异引物341F/805R^[23]，引物序列如下.

341F引物：CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG(barcode) CCTACGGGNGGCWGCAG

805R引物：GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAG AATTCCAGACTACHVGGGTATCTAATCC

PCR扩增采用20 μL反应体系: 5× FastPfu Buffer 4 μL，2.5 mmol·L^-1 dNTPs 2 μL，引物338F/806R各0.4 μL，Taq酶0.4 μL，模板1.0 μL，ddH₂O 12.2 μL. PCR条件: 95℃变性120 s; 95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，30个循环; 最后72℃ 5 min延伸. PCR产物经过2%琼脂糖凝胶电泳检测，条带清晰，片段大小合适(430bp左右)，使用生工琼脂糖回收试剂盒(cat:SK8131) 切胶回收PCR产物，以Tris-HCl洗脱后连接“Y”接头，使用磁珠筛选去除接头自连片段，按照每个样品测一万条序列加入1 ng PCR产物的标准富集PCR产物，然后用0.1 mol·L^-1的NaOH溶液变性，获得单链DNA片段，构建测序文库后在16S-338F-806R MiSeq平台进行高通量测序[生工生物工程(上海)股份有限公司].

数据分析流程如下.

(1) 数据预处理采用Flash软件融合双末端序列，而后通过各样品barcode使数据回归样品，并对各样本序列做QC.

(2) 去除非靶区域序列及嵌合体.

(3) 物种分类采用RDP classifier将序列进行物种分类，对每个样本和每个物种单元分类进行序列丰度计算，构建样本和物种分类单元序列丰度矩阵.

(4) OTU聚类将多条序列根据其序列之间的距离来对它们进行聚类，后根据序列之间的相似性作为阈值分成操作分类单元(OTU).

(5) Alpha多样性分析计算各种物种多样性指数(香农指数、辛普森指数、ACE指数、Chao1指数等)，衡量样本物种多样性.

(6) Beta多样性分析Beta多样性指标用来比较多组样本之间的差别度量，将代表性序列比对参考核心16S rDNA序列，根据多序列队列构建代表性序列为节点的进化树，利用Unifrac算法计算得出样本距离、样本聚类、样本PCOA.

在门和属的分类水平上分别对微生物介导的CO₂-咸水-岩反应实验菌群组成进行鉴定，结果表明CO₂注入后不同时期的优势菌种类不同，且各时期优势菌的数量分布存在较大差异.基于0 M、2 M、4 M和6 M样品中全部OTU做Venn图，比较4个样品间的差异.不同时期样品有效OTU总数为7 607个，各个时期下共有OTU数为649个(图 2)，占OTU总数的8.53%.其中0M特有的OTU数为5 376个，对应的细菌主要是杆菌属(Lysinibacillus)、气单胞菌属(Aeromonas)、寡养单胞菌属(Stenotrophomonas)、琥珀酸弧菌属(Succinivibrio)和高温脱硫杆菌属(Thermodesulfobacterium)等，占OTU总数的70.67%；2M特有的OTU数为762个，对应的细菌主要是金黄杆菌属(Chryseobacterium)、嗜氢菌属(Hydrogenophaga)等，占OTU总数的10.02%；4M特有的OTU数为194个，对应的细菌主要是罗尔斯通菌属(Ralstonia)等，占OTU总数的8.23%；6 M特有的OTU数为626个，对应的细菌主要是支原体属(Mycoplasma)、嗜二氧化碳嗜细胞菌属(Capnocytophaga)、苯基杆菌属(Phenylobacterium)等，占OTU总数的2.55%.由此可知，微生物介导的CO₂-咸水-砂岩反应实验不同时期均具有一定比例的特有菌属，在初始水样相同的前提下，CO₂-咸水-砂岩相互作用所引起的pH降低、水化学组分变化、离子强度或终端电子接受过程的变化均可能是造成体系菌群结构差异的因素^{[24, 25]}.

图 2

Fig. 2

图 2 微生物介导的CO2-咸水-砂岩反应实验不同时期样品间共有OTU分析 Fig. 2 Shared OTU analysis of the samples collected in different stages of CO2-water-rock interaction mediated by microorganisms

对全部样品的有效序列进行归类操作分析，统计不同分类单元所对应的细菌门类及相对丰度，见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 各样品优势细菌门类及相对丰度/% Table 1 Advantageous bacterial phyla and the relative abundance of each sample/%

表 1 各样品优势细菌门类及相对丰度/% Table 1 Advantageous bacterial phyla and the relative abundance of each sample/%

有研究结果表明，不同时期下不同样品间的菌群结构存在较大差异.变形菌门在各样品中相对丰度均最大，且随时间推移逐步增大，在0M、2M、4M、6M中分别占47.29%、79.13%、92.27%、99.77%；2M中厚壁菌门占3.46%，拟杆菌门占14.12%，放线菌门占1.11%；4M中厚壁菌门占4.90%，拟杆菌门占0.66%，放线菌门占0.91%；6M中厚壁菌门占0.03%，拟杆菌门占0.03%，放线菌门占0.01%.

通过RDP分析，每个样品相对丰度最高的前10个菌属，在属水平上对每个样品的菌群结构及分布进行统计分析(图 3).结果表明，0M中可分类的细菌主要是假单胞菌科(Pseudomonadales)的假单胞菌属(16.77%)，其他按丰度由高到低依次为杆菌属(Lysinibacillus)、气单胞菌属(Aeromona)、寡养单胞菌(Stenotrophomonas)、普氏菌属(Prevotella)和颤杆菌科(Oscillibacter)；2M中主要是假单胞菌科(Pseudomonadales)的假单胞菌属(24.18%)，柠檬酸杆菌属(12.35%)、甲基杆菌属(11.8%)和金黄杆菌属(10.99%)；4M中主要是柠檬酸杆菌属(41.34%)、甲基杆菌属(25.57%)、肠杆菌属(5.76%)；6M中主要是柄杆菌科(Caulobacteraceae)的Brevundimonas属(83.97%)，根瘤菌科(Rhizobiaceae)的Rhizobium属(12.48%)，鞘脂单胞菌科(Sphingomonadaceae)的Sphingomonas属(2.43%)等，相对丰度差异较显著.由数据可知，实验前4个月时的优势菌属为假单胞菌属和柠檬酸杆菌属，这两类优势菌属中均存在硝酸盐还原菌种^{[26, 27]}.随着CO₂注入时间的推移，酵母膏作为氮源消耗明显，假单胞菌属与柠檬酸杆菌属已无法适应高温，酸性的咸水环境，进一步表明硝酸根浓度及终端电子接受过程的改变均会对CO₂捕获过程造成影响.当CO₂注入6个月时刻，随着假单胞菌属与柠檬酸杆菌属数量明显下降，短波单胞菌属开始展现对环境的高适应性并且数量显著上升，成为优势菌属.根据16S rDNA测序结果得知，在微生物介导的CO₂-咸水-砂岩反应实验过程中，存在着能够在高温，酸性咸水环境中存活的微生物(表 2)，且具有某种特定的功能，如铁还原作用，反硝化作用等^[28~32]，这些作用的发生，同样可以证明在微生物群落结构发生变化的同时，对CO₂捕获过程也造成了潜在的影响.

图 3

Fig. 3

图 3 样品中属水平细菌种群结构及分布 Fig. 3 Bacterial communities and distribution of the samples at the genus level

表 2 (Table 2)

表 2 细菌功能 Table 2 Function of the bacteria

表 2 细菌功能 Table 2 Function of the bacteria

以97%相似性水平为标准划分可操作分类单元(OTU)，0M、2M、4M和6M样品数据分别可划分为1 494、1 470、1 237及296个OTU，主要代表变形菌门(Proteobacteria)、厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Actinobacteria)4个优势菌门.基于随机选取一定数量的测序序列及其对应的OTU种类得到的稀释性曲线如图 4所示.

图 4

Fig. 4

图 4 稀疏性曲线 Fig. 4 Rarefaction curves

通过样品测序序列计算各样品中细菌多样性指数(表 3)，其中0M样品的香农指数最大为5.330 2，辛普森指数最小为0.032 8，即微生物介导的CO₂-咸水-砂岩反应实验初始时刻的细菌多样性最高；6M样品的香农指数最小为1.946 5，辛普森指数最大为0.375 5，表明CO₂注入6个月时的细菌多样性最低.综合分析各个时期各样品的细菌多样性，发现随着微生物介导的CO₂-咸水-砂岩反应时间的延长，实验菌群多样性逐渐降低，表明在高温、酸性的咸水条件下微生物多样性随着CO₂注入时间的延长，对于环境的适应性逐渐降低，CO₂注入6个月时菌群单一性明显.

表 3 (Table 3)

表 3 基于16Sr DNA基因序列的细菌多样性指数 Table 3 Bacterial diversity index based on16S rDNA gene sequences

表 3 基于16Sr DNA基因序列的细菌多样性指数 Table 3 Bacterial diversity index based on16S rDNA gene sequences

为了解微生物介导的CO₂-咸水-砂岩反应不同时期实验菌群结构的相似性，构建了样品聚类关系树的热图(图 5). 图 5的不同颜色代表不同的相对丰度，图顶端为样品间聚类关系树.结果显示，2M与4M相对丰度分布较为类似，然后依次为0M和6M，结合各样品间菌群的进化关系，本次研究发现实验菌群的进化关系与CO₂-咸水-砂岩相互作用时间有一定关系，CO₂注入6个月时的菌群(6M)与初始时刻的菌群(0M)的进化关系差异十分明显.不同样品主成分分析图分析结果显示，2M和4M聚集明显，说明CO₂注入两个月时刻与4个月时刻的菌群结构相似度高; 0M与6M空间距离较远，说明随着反应时间的延长，6个月时与初始菌群相比相似度差异较大(图 6).

图 5

Fig. 5

图 5 聚类热图 Fig. 5 Clustered heatmap

图 6

Fig. 6

图 6 不同样品主成分分析 Fig. 6 Principal component analysis of samples

本文中发现的几种微生物菌属及其主要代谢产物如表 4所示，其主要代谢产物有小分子有机酸和CH₄、H₂等气体，根据表 5可知，产生低分子量的短链有机脂肪酸如甲酸、乙酸、丙酸等，可以有效地促进储层沉积的碳酸盐的溶蚀，产生的CH₄、H₂等气体能够提高渗透率并溶蚀碳酸盐，这些微生物菌属及主要代谢产物对矿物的溶解捕获存在积极的作用.这也可以证明在微生物群落结构发生变化的同时，对CO₂捕获过程也造成了潜在的影响.

表 4 (Table 4)

表 4 微生物在CO2-水-岩相互作用过程中的作用 Table 4 Function of bacteria in the CO2-brine-sandstone interaction process

表 4 微生物在CO2-水-岩相互作用过程中的作用 Table 4 Function of bacteria in the CO2-brine-sandstone interaction process

表 5 (Table 5)

表 5 微生物主要菌群及其特征 Table 5 Main microbial groups and their characteristics

表 5 微生物主要菌群及其特征 Table 5 Main microbial groups and their characteristics

根据图 7水化学组分变化情况可知，CO₂-咸水-砂岩的相互作用进行到6个月时，Na⁺、K⁺、Mg²⁺离子溶出量均有所上升.

图 7

Fig. 7

图 7 原生矿物溶蚀 Fig. 7 Erosion of primary minerals

结合图 8及图 9电镜照片及能谱图片可知长石与绿泥石发生溶蚀现象.这主要是由于各时期特有的菌属如气单胞菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属等，以及CO₂-咸水-砂岩的相互作用过程进行到2个月及4个月时的优势菌属柠檬酸杆菌属，均具有代谢小分子有机酸的特征，使微生物所在岩石表面局部pH降低，从而促进长石的溶蚀.这说明，在微生物的参与下，微生物的生命代谢活动可以促进长石及绿泥石更为剧烈的溶蚀，进而促进二氧化碳的矿物捕获.反之其对微生物群落结构及多样性也存在着影响作用.

图 8

Fig. 8

(a1) 原始岩样表面；(b1) 6个月后岩石表面；长石的溶蚀EDS图谱：(a2) 原始岩样；(b2) 6个月后岩样 图 8 长石的溶蚀SEM图 Fig. 8 SEM images of feldspars erosion

图 9

Fig. 9

(a1) 原始岩样表面；(b1) 6个月后岩石表面；长石的溶蚀EDS图谱：(a2) 原始岩样；(b2) 6个月后岩 图 9 绿泥石的溶蚀SEM图 Fig. 9 SEM images of chlorite erosion

韩金鑫等^[33]发现，假单胞菌属所产生的代谢产物碳酸酐酶能够促进CO₂的水合作用，诱导钙离子与碳酸根结合生成为碳酸钙.

微生物介导的CO₂-咸水-砂岩相互作用过程中新矿物的生成情况如图 10所示.从电镜结果可以看出，微生物介导的CO₂-咸水-砂岩相互作用实验进行到6个月时，发现了晶相较好的方解石.这说明在微生物(假单胞菌属)的参与下，促进了含钙碳酸盐矿物的沉淀捕获.

图 10

Fig. 10

(a1) 原始岩样表面；(b1) 6个月后岩石表面；方解石的生成EDS图谱：(a2) 原始岩样；(b2) 6个月后岩样 图 10 方解石的生成SEM图 Fig. 10 SEM images of calcite formation

图 11

Fig. 11

(a1) 原始岩样表面；(b1) 6个月后岩石表面；菱铁矿的生成EDS图谱：(a2) 原始岩样；(b2) 6个月后岩样 图 11 菱铁矿的生成SEM图 Fig. 11 SEM images of siderite formation

微生物介导的CO₂-咸水-砂岩相互作用进行到6个月时，有含铁碳酸盐的生成.结合微生物群落结构数据可知，本实验存在微生物介导的CO₂-咸水-砂岩相互作用初始时刻及2个月时的优势菌属假单胞菌属，某时期特定菌属芽孢杆菌属等微生物菌属，这两个微生物菌属具有铁还原作用(表 2)，这些菌属能够利用Fe³⁺、Mg²⁺厌氧生长并将Fe³⁺还原为Fe²⁺，从而伴随更多的新矿物沉淀，这表明这类具有铁还原作用的菌属可以将菱铁矿形成的动力学屏障降低，促进更多Fe²⁺的溶出，从而说明微生物的参与促进了菱铁矿的生成.微生物介导的CO₂-咸水-砂岩相互作用过程中，由于微生物的加入，进一步促进了菱铁矿的沉淀捕获.反之由于亚铁离子浓度的变化，也会影响微生物群落结构及多样性.

(1) CO₂注入咸水层后，造成了不利于微生物生长的极端环境(高温，酸性的咸水环境)，但本实验研究表明，部分微生物(如短波单胞菌、假单胞菌及柠檬酸杆菌)可在极端条件下生长，进而导致群落结构、功能及多样性发生变化，并对CO₂捕获过程造成潜在的影响作用.

(2) 随着CO₂的注入，微生物相对丰度趋于单一，变形菌门相对丰度最终达到99.77%.优势菌属在群落结构变化过程依次为假单胞菌属，柠檬酸杆菌属及短波单胞菌属.同时，CO₂注入后还存在着芽孢杆菌属，嗜氢菌属，根瘤菌属等各个时期特有的微生物菌群.并且具有铁还原作用，反硝化作用等功能，从而对CO₂的捕获与封存存在着潜在的影响作用.另外，随着CO₂注入时间的延长，香农指数逐渐变小，辛普森指数逐渐变大，表明土著微生物群落结构变化过程中，细菌多样性逐渐降低.

(3) 本研究中发现各时期特有的菌属如气单胞菌属、肠杆菌属、芽孢杆菌属等，以及CO₂-咸水-砂岩的相互作用过程进行到2个月及4个月时的优势菌属柠檬酸杆菌属，均具有产酸或产气的特征，从而促进了长石、绿泥石及含钙碳酸盐的溶蚀. CO₂-咸水-砂岩的相互作用过程前2个月的优势菌属假单胞菌属，其代谢产物碳酸酐酶，能够促进CO₂的水合作用，诱导钙离子与碳酸根结合生成为碳酸钙，即生成方解石.在微生物介导的CO₂-咸水-砂岩相互作用过程中还发现了具有铁还原作用的菌属，如在微生物介导的CO₂-咸水-砂岩相互作用初始时刻及2个月时的优势菌属假单胞菌属，某时期特定菌属芽孢杆菌属等，这些菌属能够利用Fe³⁺、Mg²⁺厌氧生长并将Fe³⁺还原为Fe²⁺，从而伴随更多的新矿物沉淀，这表明这类具有铁还原作用的菌属可以促进菱铁矿的生成.