2017, Vol. 38
在全球范围内，抗生素的广泛使用和过度使用导致环境中出现抗性细菌和抗性基因[1].近年来，抗生素被定义为一种新型环境污染物[2].污水处理厂(sewage treatment plant，STP)是抗生素和抗性基因进入环境的主要途径之一.目前，关于STP中抗生素的研究主要集中在它们的出现和去除等方面.有研究表明，珠江三角洲地区4个STPs出水中罗红霉素(roxithromycin，ROX)的浓度为(35±8)~(278±46) ng·L-1，磺胺类抗生素的浓度为(9±4)~(346±54) ng·L-1，喹诺酮类抗生素的浓度为(27±6)~(165±15) ng·L-1[3]. Gao等[4]研究的北京8个STPs中的抗生素的情况发现，出水中ROX的浓度在0.054~0.36 ng·L-1之间，而磺胺类和喹诺酮类抗生素的浓度也都在μg·L-1级别.此外，STP中左氧氟沙星、环丙沙星和恩氟沙星的去除率分别为40%~90%、60%~83%和38%~74%，大环内酯类的克拉霉素(50%~88%)和阿奇霉素(34%~86%)的去除率比ROX(59%)的去除率高[5].然而，STP的生物处理过程主要依赖微生物的丰度和多样性，所以有必要研究抗生素对活性污泥中微生物的影响.
本试验研究的抗生素为ROX，ROX属于大环内酯类抗生素，它能够抑制细菌蛋白质合成.有研究表明红霉素和泰乐菌素的半衰期分别为20 d和8 d，而ROX在土壤中存在120 d未降解[6]；因而ROX在环境中可以保持更长时间的活性.氨氧化作用是STP生物脱氮作用的限速步骤，主要由氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea，AOA)和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria，AOB)承担.两者虽然利用相同的底物进行能量代谢，但是在细胞结构和代谢途径上存在差异，这在一定程度上导致了AOA和AOB对抗生素的敏感度不同[7]. Shen等[7]的研究表明，磺胺噻唑能够抑制AOB Nitrosospira multiformis的生长，但是对AOA Candidatus Nitrososphaera viennensis未产生影响.不同浓度的磺胺嘧啶均降低了土壤中AOA和AOB丰度[8, 9]. Yu等[10]的研究发现，ROX导致土壤中AOB的丰度下降.但是，关于ROX对活性污泥中AOA和AOB丰度和多样性的影响少有报道.
目前，基于amoA基因研究STP中AOA和AOB多样性的方法主要集中于PCR-克隆和PCR-DGGE等技术[11, 12].传统的测序技术通量低，很难检测到丰度较低的物种，不能准确描述活性污泥中微生物群落的复杂性；同时，传统的测序技术随机性较大，对物种相对丰度的定量容易产生偏差.而高通量测序技术则克服了传统测序的缺点，它具有足够的测序深度可以更准确反映微生物群落的多样性[13].然而，还未有研究利用高通量测序基于amoA基因考察AOA和AOB的多样性.
本试验基于amoA基因，结合实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)和Illumina高通量测序技术研究ROX短期冲击对活性污泥氨氧化作用以及AOA和AOB丰度和多样性的影响，并进一步考察了环境因素与AOA和AOB群落结构之间的相关性.
1 材料与方法 1.1 反应器运行本试验所用的活性污泥取自于某市政STP的曝气池.种泥(seed sludge，SD)取回后空曝24 h去除其中的残余污染物质.本试验的ROX购自Sigma公司，纯度大于98%.试验共设置10种不同的ROX浓度(共分为4组)：0 μg·L-1(对照)；0.3、3和30 μg·L-1(环境浓度)；300 μg·L-1和3 000 μg·L-1(中等浓度)；5 000、7 000、9 000和12 000 μg·L-1(较高浓度).
采取小型批处理反应器进行本研究，反应器的有效体积为0.2 L，排水比为50%.每个反应器中污泥浓度维持在3 000mg·L-1，运行方式为：进水、曝气、沉淀、排水和闲置，曝气时间依据出水NH4+-N而定.反应器进水采用人工配水，其组份包括蔗糖(折合成COD为220mg·L-1)NH4Cl(0.16g·L-1)、NaHCO3(0.50g·L-1)、KH2PO4(0.05g·L-1)、NaCl(0.59g·L-1)、KCl(0.08g·L-1)、CaCl2·2H2O(0.15g·L-1)、MgSO4·7H2O(0.05g·L-1)、微量元素(1mL·L-1)和ROX.微量元素的组成为：1 L水含4.29 g Na2EDTA、1.99 g FeCl2·4H2O、0.08 g MnCl2·2H2O、0.02 g NiCl2·6H2O、0.02 g CoCl2·6H2O、0.02 g CuCl2·2H2O、0.07 g ZnCl2、0.02 g Na2MoO4·2H2O、0.03 g Na2WoO4·2H2O和0.06 g H3BO3.曝气阶段维持溶解氧(dissolved oxygen，DO)在2~4mg·L-1，温度控制在(25±1)℃.试验共运行3个周期，前2个周期只监测进出水的NH4+-N、NO2--N、NO3--N和COD，第3周期时监测过程中三氮和COD的变化.
1.2 检测分析项目NH4+-N、NO2--N、NO3--N和COD采用分光光度法进行检验分析；具体的分析方法如下：NH4+-N采用纳氏试剂显色法进行分析；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺显色法进行分析；NO3--N采用麝香草酚显色法进行分析；COD采用重铬酸钾法进行分析.
1.3 样品收集和DNA提取在第3周期运行结束后分别收集每种处理下的活性污泥样品，冻干后于-20℃下保存.采用Fast-DNA® Spin kit for soil(QIAGEN，CA，USA)DNA提取试剂盒，按照操作说明提取活性污泥样品的基因组DNA.通过Nanodrop Spectrophotometer ND-1000(Thermo Fisher Scientific，USA)测定DNA浓度和纯度.提取的DNA保存于-20℃以待后续分析.
1.4 qPCR本试验对AOA和AOB的amoA基因进行qPCR分析，所用仪器为Stratagene MX3005p thermocycler(Agilent Technologies, USA). AOA和AOB所用的引物分别为Arch-amoAF(5′-STAATGGTCTGGCTTA GACG-3′)/Arch-amoAR(5′-GCGGCCATCCATCT GTATGT-3′)和amoA-1F(5′-GGGGTTTCTACTGGT GGT-3′)/amoA-2R(5′-CCCCTCKGSAAAGCCTTC TTC-3′)，扩增的目的片段长度分别是416bp和491bp.将含有AOA和AOB amoA基因的质粒作为qPCR分析的标准品，质粒提取方法参见文献[14].测定质粒浓度换算成拷贝数，将质粒按10倍梯度稀释得到一系列已知拷贝数的标准品.把标准品和待测样品作为DNA模板，每个样品重复3次.阴性对照样品以无菌水代替. qPCR的扩增体系按照GoTaq Green Master Mix qPCR(Promega, Madison, USA)说明书配制. qPCR程序参见文献[12]. AOA和AOB的扩增效率分别为111.70%和102.80%.
1.5 AOA和AOB amoA基因的Illumina高通量测序本试验选取SD、30 μg·L-1(C1) 和7 000 μg·L-1(C2) ROX处理的样品进行AOA和AOB amoA基因的Illumina高通量测序.首先对AOA和AOB的amoA基因进行PCR扩增(引物同qPCR分析). AOA的PCR扩增体系为15 μL TransStart Fastpfu DNA Polymerase；3 μL前向引物和3 μL反向引物；20 ng DNA；不足部分用灭菌水补足至30 μL.扩增程序为：95℃预变性2 min；95℃变性20 s，53℃退火30 s，72℃延伸30 s，共35个循环；72℃最后延伸10 min. AOB的扩增体系为：0.3 μL Pyrobest DNA Polymerase；5 μL 10×Pyrobest Buffer；4 μL dNTPs(2.5 mmol·L-1)；2 μL前向引物和2 μL反向引物；30 ng DNA；灭菌水补足至50 μL.扩增程序为：95℃预变性5 min，95℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s，共25个循环；72℃最后延伸10 min.将PCR产物纯化后用于克隆构建文库. AOA和AOB的测序平台分别为Illumina HiSeq 2500和MiSeq PE300，双端的读长分别为250bp和300bp.得到的原始序列去除引物和barcodes后，将双端测序的序列进行合并[15]，再去除嵌合体和低质量序列后得到的有效序列，利用Quantitative Insights into Microbial Ecology(QIIME)进行分析，根据序列97%的相似度划分操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU).根据产生的OTU分类计算样品α多样性和β多样性.
1.6 序列登录号本研究获得的所有amoA基因的数据上传至NCBI Sequence Read Archive(SRA)数据库.序列登录号为：SRP095228.
1.7 数据分析本研究采用R语言(3.2.2) 进行Venn分析、Heatmap分析以及冗余分析(redundancy analysis，RDA).
2 结果与分析 2.1 ROX短期冲击对氨氧化作用的影响本试验每种处理分别运行3个周期，周期时间以NH4+-N完全去除的时间而定，即每个周期结束后，不同处理的反应器中出水NH4+-N均降为0mg·L-1.本试验的前2个周期内，不同反应器的运行时间均为6 h(数据未显示).在第3周期时，分别对每种处理的反应器监测周期内三氮和COD的变化规律(每0.5 h取一次水样)，结果如图 1所示：与对照(0 μg·L-1)相比，环境浓度(0.3、3和30 μg·L-1)和中等浓度(300 μg·L-1和3 000 μg·L-1)的ROX未对NH4+-N去除造成明显的影响.在第3周期时，这几种浓度ROX处理的反应器中NH4+-N的去除时间均为6 h；而较高浓度(5 000、7 000、9 000和12 000 μg·L-1)ROX处理的反应器中NH4+-N的去除时间分别延长至16、28、34和32 h，分别是对照组的2.7、4.7、5.7和5.3倍，表明较高浓度的ROX对氨氧化产生明显的抑制作用.有趣的是，ROX的抑制效果并未随着浓度的增加而明显增强，在浓度为7 000 μg·L-1时，ROX对氨氧化的抑制效果最显著.不同浓度ROX处理的反应器中NO2--N、NO3--N和COD的变化规律与对照处理基本一致.综上所述，本研究结果表明不同浓度的ROX对氨氧化作用的影响差异显著：环境浓度与中等浓度的ROX并未对氨氧化作用产生影响，而较高浓度的ROX对氨氧化作用产生明显的抑制作用.
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图 1 不同ROX浓度的反应器中三氮和COD在周期内的变化规律 Fig. 1 Concentrations variations of inorganic nitrogen and COD during one operation cycle under different ROX levels |
qPCR的结果(以干泥计)如图 2所示，SD中AOA和AOB的amoA基因拷贝数分别为1.02×109 copies·g-1和6.14×108 copies·g-1，不同浓度ROX处理的AOA的拷贝数在9.39×108~2.01×109 copies·g-1范围内.与SD和对照反应器(1.27×109 copies·g-1)相比，环境浓度(0.3、3和30 μg·L-1)和中等浓度(300 μg·L-1和3 000 μg·L-1)的反应器中AOA拷贝数呈略微增长的趋势，其中0.3 μg·L-1 ROX处理的AOA拷贝数(2.01×109 copies·g-1)最高；较高浓度(5 000、7 000、9 000和12 000 μg·L-1)ROX处理的反应器中AOA拷贝数明显低于其它处理，当ROX浓度为9 000 μg·L-1时，AOA拷贝数最低为9.39×108 copies·g-1，说明较高浓度(5 000~12 000 μg·L-1)的ROX抑制了AOA增长. AOA拷贝数的变化规律与全周期NH4+-N变化规律一致，即较高浓度的ROX抑制NH4+-N去除的同时也抑制了AOA的增长，意味着AOA可能在氨氧化过程中起一定作用.
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图 2 不同ROX浓度的反应器中AOA和AOB amoA基因定量结果 Fig. 2 Quantitative analysis of AOA and AOB amoAgenes under different ROX levels |
AOB的拷贝数随着ROX浓度的增加呈下降趋势，不同处理的AOB拷贝数范围在8.42×107~7.10×108 copies·g-1之间；其中，与SD和对照相比，0.3 μg·L-1 ROX处理的AOB拷贝数最高，为8.24×108 copies·g-1.这与AOA的定量结果一致，表明环境中的痕量ROX浓度刺激了AOA和AOB的增长. ROX为12000 μg·L-1的反应器中AOB的拷贝数最低，为8.42×107 copies·g-1，是对照处理的AOB拷贝数的1/10.不同浓度ROX处理的AOA的丰度均显著高于AOB的丰度，AOA与AOB的比例在1.66~11.91之间，且AOA/AOB的数值随着ROX浓度增加而增加.综上所述，环境浓度和中等浓度的ROX刺激了AOA增长，较高浓度的ROX对AOA产生抑制作用；而除了0.3 μg·L-1的ROX，其余浓度的ROX均对AOB产生抑制作用，且随着ROX浓度增加抑制作用越显著；这说明AOA对ROX的耐受性高于AOB.
2.3 ROX短期冲击对AOA和AOB amoA基因多样性的影响选取SD、C1和C2这3个样品进行AOA和AOB amoA基因的Illumina高通量测序. 3个样品分别得到50 819~66 095条AOA和45 693~76 716条AOB高质量序列.以最小的序列数为基础，将样品进行均一化后，每个样品分别得到50 819条AOA和45 693条AOB序列.以3%的阈值计算每个样品中AOA和AOB的α多样性(OTUs、Chao1、Shannon、PD_whole_tree和观察到的物种)，具体信息如表 1所示. AOA的稀缺性曲线如图 3(a)所示，3个样品的稀缺性曲线都达到了平台期，说明测序深度可以覆盖样品的多样性. SD共得到76个OTUs，C1得到68个OTUs，C2仅得到38个OTUs. SD中的OTU数明显高于C1和C2.由Venn图可知[图 3(c)]，C2中的OTUs被C1和SD共有，同时C1中的OTUs又被样品SD共有，这说明ROX降低了AOA的多样性. 图 4(a)为序列丰度大于0.05%的AOA OTUs的heatmap图，由该图可知，在3个样品中，OTU73是最主要的OTU，其它相对丰度较高的OTUs还有OTU71、OTU158和OTU169. OTU33、OTU104、OTU121、OTU17、OTU290和OTU41分别是SD或C1中丰度较高的OTUs，但是它们在C2中相对丰度极低.这进一步说明ROX的短期冲击影响降低了AOA的多样性. Shannon指数一方面可以表示样品中含有物种的数目，即丰富度；另一方面可以表示样品中物种的均匀度.物种的数目丰富可以增加Shannon指数值，同时物种之间的均匀度增加也会使Shannon指数提高.本研究中SD的Shannon指数最高为1.60，C1的Shannon指数最低为0.91，C2的Shannon指数最高为1.42；C1的Shannon指数低于C2，说明低浓度的ROX降低了C1中敏感菌属的数量，导致样品C1中物种的均匀度降低，从而Shannon指数较低.
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表 1 3个活性污泥样品的测序信息及多样性指数统计 Table 1 Raw and effective sequences, numbers of OTUs, Chao1, Shannon, PD_whole_tree and Observed-species of three activated sludge samples |
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图 3 3个样品的AOA和AOB的稀缺性分析和维恩分析 Fig. 3 Rarefaction curves and Venn analysis of AOA and AOB in three activated sludge samples |
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图 4 3个样品OTUs(＞0.05%)分布的heatmap分析 Fig. 4 Heatmap analysis of OTUs(>0.05%) in three activated sludge samples |
本研究中3个样品的AOA序列可以分为6个属[图 5(a)]：Nitrosopumilus maritimus(相对丰度为0.17%~5.79%)、Candidatus Nitrososphaera gargensis(57.61%~90.57%)、Candidatus Nitrosoarchaeum koreensis(0.06%~7.25%)、Candidatus Nitrosopumilus sp. AR2(0.13%~34.8%)、Candidatus Nitrosopumilus koreensis(0.01%~0.02%)和Candidatus Nitrososphaera evergladensis(0.01%~0.02%).其中Ca. Nitrososphaera gargensis是3个样品中最重要的AOA.在C2中，Ca. Nitrososphaera gargensis的相对丰度最高，高达90.57%.而在SD中，Ca. Nitrososphaera gargensis的相对丰度最低为57.61%，说明ROX刺激了Ca. Nitrososphaera gargensis增长(相对丰度增加了32.96%)，在SD中，其它优势的AOA为Ca. Nitrosopumilus sp. AR2(34.80%)和Nitrosopumilus maritimus(5.79%).然而在ROX短期冲击影响下，Ca. Nitrosopumilus sp. AR2在C1和C2中的相对丰度明显减少至4.47%和0.13%. Nitrosopumilus maritimus的相对丰度由SD中的5.79%减少至C1中的4.53%，甚至在C2中完全消失.这说明Ca. Nitrosopumilus sp. AR2和Nitrosopumilus maritimus对ROX的选择压较敏感.相反Ca. Nitrosoarchaeum koreensis在SD和C1中的相对丰度仅占0.09%和0.06%，然而，在C2中的相对丰度增加至7.25%，说明Ca. Nitrosoarchaeum koreensis是对ROX耐受性较强的AOA.本研究在SD和C2中检测到Ca. Nitrosopumilus koreensis(0.02%和0.01%)，仅在C2中检测到Ca. Nitrososphaera evergladensis(0.01%).
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图 5 AOA和AOB在种水平的相对丰度 Fig. 5 Relative abundance of AOA and AOB at genus level |
对于AOB而言，3个样品共得到291~799个OTUs，其中C2的OTUs最高为799个，SD的OTUs最低为291个；C2和C1的OTUs(表 1所示)明显高于SD，说明环境浓度和较高浓度的ROX都不同程度地增加了AOB的多样性. AOB稀缺性曲线如图 3(b)所示，3个样品的稀缺性曲线都达到了平台期，说明AOB的测序深度可以代表样品中AOB的多样性.由Venn分析[图 3(d)]可知，有100个OTUs同时被3个样品共有；SD与C1和C2共有的OTUs分别是32个和52个，而C1和C2之间共有的OTUs达230个.如图 4(b)所示，3个样品中丰度最高的OTU是OTU17，其次是OTU1168、OTU1228、OTU128和OTU605. OTU674为样品SD和样品C1共有，但在SD中的相对丰度较高.此外，OTU1041、OTU357、OTU483、OTU516、OTU532、OTU804、OTU610和OTU1050仅出现在SD中；而OTU92、OTU886、OTU833、OTU501、OTU428、OTU218、OTU108和OTU1032仅分布在C1中；C2中相对丰度较高的专有OTUs只有OTU92和OTU915.本研究中，虽然C2得到的OTU数最多，但由图 4(b)可知，C2中相对丰度大于0.05%的OTUs明显少于C1和SD.这说明，ROX处理虽然增加了AOB的OTUs的多样性，但是并未增加主要OTUs的丰度. 3个样品的Shannon指数分别为1.77(SD)、3.25(C1) 和2.84(C2).
本研究中共检测到10种AOB[图 5(b)]，Nitrosomonas eutropha是3个样品中最主要的AOB；ROX选择压使N. eutropha的相对丰度由SD中的76.71%分别下降至54.22%(C1) 和57.87%(C2).此外，其它重要的AOB有Nitrosomonas ureae(7.58%~14.17%)和Nitrosomonas aestuarii(1.84%~2.72%)；在ROX的选择压下，二者的相对丰度均有所下降；这说明，Nitrosomonas属中的N. eutropha、N. ureae和N. aestuarii是对ROX敏感的AOB.本研究中其它对ROX敏感的AOB为：Nitrosomonas europaea(0.00%~0.56%)、Nitrosomonas stercoris(0.02%~0.10%)和Nitrosomonas nitrosa(0.01%~0.10%)，它们的相对丰度随着ROX浓度的增加而下降.除此之外，在ROX的选择压下，反应器中也存在对ROX耐受性较强的AOB，例如：Nitrosomonas oligotropha(0.33%~4.15%)、Nitrosococcus halophilus(0.37%~0.52%)、Nitrosococcus watsonii(0.06%~0.43%)和N. multiformis(0.00%~0.08%).其中，N. oligotropha由SD中的0.33%增加至4.15%(C1) 和2.58%(C2).综上所述，在本研究中除了N. oligotropha，Nitrosomonas属的AOB都属于对ROX敏感的AOB；而N. oligotropha、N. halophilus、N. watsonii和N. multiformis则对ROX不敏感.
2.4 AOA和AOB的群落结构与环境参数的相关性RDA分析结果如图 6所示，对于AOA而言，由于Ca. Nitrosopumilus koreensis和Ca. Nitrososphaera evergladensis的相对丰度很低(0.01%~0.02%)，因此数据分析中未把其计算在内.如图 6(a)所示，主坐标轴1和主坐标轴2对于AOA群落结构变化的解释量为99.10%和0.90%. SD、C1和C2之间的距离较远，说明3个样品的AOA群落结构差异显著. Nitrosopumilus maritimus与进出水的NO2--N、进水COD和AOA amoA基因的丰度呈正相关. Ca. Nitrosopumilus sp. AR2与进出水的NO2--N、进水COD、进水NH4+-N和AOA amoA基因的丰度呈正相关. Ca. Nitrososphaera gargensis与出水NH4+-N、出水COD、进出水NO3--N、ROX浓度、周期时间和AOA amoA基因的丰度呈正相关.然而，Ca. Nitrosoarchaeum koreensis与出水NH4+-N、ROX浓度和周期时间几乎在同一个轴线上，说明Ca. Nitrosoarchaeum koreensis与出水NH4+-N、ROX浓度和周期时间显著正相关.此外，Ca. Nitrosoarchaeum koreensis还与进出水NO3--N、出水COD和进水NH4+-N呈正相关. 4种不同的AOA都与进水或出水的COD呈正相关. RDA的分析结果表明，Ca. Nitrososphaera gargensis和Ca. Nitrosoarchaeum koreensis都与ROX呈正相关，进一步说明了Ca. Nitrososphaera gargensis和Ca. Nitrosoarchaeum koreensis对ROX的耐受性较强.
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图 6 AOA和AOB与环境变量之间的RDA分析 Fig. 6 Redundancy analysis triplot to investigate the ecological correlation between abundance of ammonia-oxidizing microorganisms and environmental factors |
对于AOB而言，同样地，由于N. multiformis、N. nitrosa和N. stercoris的相对丰度较低，因此RDA分析中未把它们计算在内.如图 6(b)所示，主坐标轴1和主坐标轴2对于AOB群落结构变化的解释量为98.64%和1.36%. N. oligotropha、N. watsonii和N. halophilus与进出水NO2--N、进出水NO3--N、出水NH4+-N、进水COD、周期时间和ROX浓度呈正相关. N. aestuarii和N. ureae与AOB amoA基因丰度、进出水NO2--N、进水COD和NH4+-N正相关.而N. eutropha和N. europaea与进水NH4+-N、AOB amoA基因丰度和出水NO2--N呈正相关.
3 讨论抗生素由于其特有的杀菌抑菌能力而被广泛应用甚至滥用，传统污水处理工艺不仅不能将ROX等抗生素完全去除，甚至抗生素还可能会对生物处理过程产生影响.本研究结果表明环境浓度(0.3、3和30 μg·L-1)和中等浓度(300 μg·L-1和3000 μg·L-1)的ROX处理虽未对氨氧化作用表现出抑制作用，但较高浓度(5 000、7 000、9 000和12 000 μg·L-1)的ROX对氨氧化作用均表现明显的抑制作用，且当ROX浓度为7000 μg·L-1时抑制作用最强；这说明不同浓度的ROX对氨氧化作用的影响差异明显.以前的研究表明，0.01 μg·kg-1和0.1μg·kg-1的恩诺沙星能够刺激土壤的硝化作用，1 μg·kg-1的恩诺沙星对土壤硝化作用产生抑制，而10 μg·kg-1恩诺沙星则强烈抑制土壤硝化过程[16].
本研究的SD中，AOA的amoA基因丰度比AOB的丰度高1个数量级，这与以前的研究结果相同，Bai等[17]的研究发现3个STPs中AOA的丰度都高于AOB.在低浓度(0.3、30、300和3 000 μg·L-1)的ROX短期冲击后，AOA的丰度与SD和对照相比略微增加1~2倍；而当ROX浓度(5 000、7 000、9 000和12 000 μg·L-1)增加后，AOA的增长受到抑制.此外，除了环境中的痕量浓度0.3 μg·L-1，其余浓度的ROX处理均明显降低了AOB的丰度，且随着浓度的增加抑制作用增强.类似的研究表明，不同浓度(0.2~10 mg·kg-1)的ROX均抑制了小麦根际土壤中AOB增长[10].也有研究发现，施用含有磺胺嘧啶的猪粪肥后导致玉米根际土壤中AOA和AOB的丰度下降，但是AOA的下降程度不如AOB显著[8, 9].对池塘底泥中氨氧化微生物的研究结果表明，磺胺嘧啶对AOA的生长没有显著的影响，但是100~500 mg·kg-1的磺胺嘧啶对AOB的生长有显著抑制作用[18].这些研究结果表明，AOA对磺胺嘧啶的耐受性高于AOB，这与本文的研究结果相似，即AOA对ROX的耐受性也高于AOB；AOA和AOB对抗生素的敏感度的差异性说明不同浓度的抗生素对古菌和细菌的作用不同.此外，有研究表明，AOA利用3-hydroxypropionate/4-hydroxybutryrate途径进行无机碳代谢，同时也具有同化有机碳的能力[19].本研究的结果发现低浓度的ROX甚至使AOA的丰度增加，说明AOA可能利用低浓度的ROX作为碳源进行代谢，进而刺激了AOA增长；相似的研究表明Ca. Nitrososphaera gargensis具有生物转化药物的能力[20].
本研究应用高通量测序技术基于amoA基因研究AOA和AOB的多样性，结果表明：3个样品分别得到38~76个AOA OTUs和291~799个AOB OTUs，Gao等[12]研究的10个STPs中AOA和AOB的多样性结果表明，基于amoA基因的PCR-克隆测序只得到17个AOA OTUs和38个AOB OTUs.此外，在本研究中即便是相对丰度为0.01%的OTUs，高通量测序也能成功定量，因此相比于传统的测序方法，基于amoA基因的高通量测序能够更准确定量样品中耐受性较强和敏感的菌种的相对丰度，从而可以更全面地分析ROX对氨氧化微生物的影响.当环境中存在ROX选择压时，微生物能够通过改变群落结构以适应压力和维持自身功能，由图 5(a)可知，在ROX的短期冲击后，AOA的群落结构发生了明显的转变，而AOB的群落结构变化不大；这与Tourna的研究相似，在不同的温度影响下土壤中AOA的群落结构发生明显的变化，而AOB未变化[21]，说明AOA可能是ROX选择压下的活性氨氧化者.
本研究中，属于groupI.1b的Ca. Nitrososphaera gargensis和Ca. Nitrosoarchaeum koreensis是对ROX耐受性较强的AOA，而属于groupI.1a的Ca. Nitrosopumilus sp. AR2和Nitrosopumilus maritimus是对ROX敏感的AOA.类似的研究发现，在施用含磺胺嘧啶猪粪肥处理的土壤样品中，85%的序列都属于Nitrososphaera subclusters[8, 9]. AOA具有编码氨单加氧酶(AMO)各亚基的基因(amoA、amoB和amoC基因).有研究表明，在具有压力的环境中，amoC基因具有稳定AMO的能力；而且，groupI.1b的amoC基因的拷贝数比groupI.1a和AOB的拷贝数多[19].因此，属于groupI.1b的AOA要比groupI.1a和AOB适应环境压力的能力强.也有研究直接表明，Ca. Nitrosoarchaeum koreensis可以适应抗生素的抗性压力[22].
N. eutropha是3个样品中占主导地位的AOB；以前的研究表明N. eutropha经常在污水处理设施和施用猪粪肥的土壤中被检测到[23~25]；还有研究表明仅在N. eutropha的基因组中发现了多药抗性基因和重金属抗性基因，因而可能使N. eutropha在高污染的环境中生存力更强[26].大部分Nitrosomonas属(除了N. oligotropha)都属于对ROX敏感的AOB.而在ROX的选择压下，N. oligotropha由SD中的0.33%分别增加至4.15%(C1) 和2.58%(C2)，对ROX的耐受性较强.此外，对ROX不敏感的AOB还有：N. multiformis、N. watsonii和N. halophilus.而Shen等[7]的研究表明，磺胺噻唑抑制了N. multiformis的生长.因此，N. multiformis对抗生素的敏感性还有待研究.
4 结论(1) 较高浓度的ROX短期冲击使氨氧化作用明显受到抑制.环境浓度和中等浓度的ROX刺激了AOA增长，而较高浓度的ROX导致AOA的丰度下降；此外，除了环境中的痕量浓度(0.3 μg·L-1)，其余浓度的ROX短期冲击均导致AOB丰度下降，且下降趋势比AOA显著.
(2)Ca. Nitrososphaera gargensis和Ca. Nitrosoarchaeum koreensis为对ROX耐受性较强的AOA；而对ROX耐受性较强的AOB有：N. oligotropha、N. multiformis、N. watsonii和N. halophilus.
(3) RDA分析结果表明：AOA Ca. Nitrososphaera gargensis和Ca. Nitrosoarchaeum koreensis与ROX浓度呈正相关. AOB N. oligotropha、N. watsonii和N. halophilus与ROX浓度呈正相关.
(4) AOA对ROX的耐受性高于AOB.
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