氨氮是水体中主要的污染物之一.硝化反硝化生物脱氮途径的认识，为人类强化水体中氮素转化提供了有效的手段.近年来，人们发现在厌氧的条件下氨氮与亚硝态氮可以进行生化反应，并将其命名为厌氧氨氧化^[1].与传统硝化反硝化反应相比，厌氧氨氧化脱氮过程减少了62.5%的供氧量^[2]，无需有机物参与，并且具有较高的氮素转换速率，为人类氮素转化途径的认识及新型工艺的研发提供了新的理论依据^[3].

随着人们对厌氧氨氧化反应特性及功能微生物富集培养研究的不断深入，研究者发现不仅亚硝酸盐可以作为厌氧条件下氨氮氧化的电子受体，小分子有机酸^[4]、硫酸盐^{[5, 6]}、锰盐^{[7, 8]}、铁盐^[9~11]等均可作为氨氮氧化的电子受体.这为厌氧条件下氮素的转化和其他元素的转化建立了新的联系，为自然界氮素转换的认识打开新的思路.

本课题组在以亚硝酸盐为电子受体的亚硝酸盐型厌氧氨氧化污泥培养过程中也发现体系中存在部分氮素的过量转化^[12]，但是目前鲜有相关文献对此进行描述.为此，本文将利用经过长期驯化培养的厌氧氨氧化污泥进行氨氮过量转化的研究，其目的主要是进一步肯定厌氧氨氧化过程中存在的氨氮过量氧化现象，并对其现象进行深入分析，探讨氨氮可能的过量转化途径和可能存在的电子受体.

实验装置采用内径16 cm、有效体积4 L的细胞培养罐(INFORS Labfors 3)，由圆柱型玻璃制成，如图 1所示.反应器外设有水浴夹套，通过控制循环水的温度将反应控制在(32±1)℃.反应器内设置DO和ORP电极(METTLER 4800) 用于监测反应器内的溶解氧环境；设置pH电极(METTLER 405) 在线实时监测反应过程中pH的变化，在必要的情况下，通过控制系统自动添加稀HCl(1 mol·L^-1)或NaOH溶液(1 mol·L^-1)调节反应器内的pH环境.反应器顶端设有搅拌装置，通过控制搅拌速度使得泥水充分混合，有利于反应完全.

图 1

Fig. 1

图 1 微生物培养装置示意 Fig. 1 Microorganism culturing device

接种污泥为以亚硝酸盐为电子受体并经过10 a培养的厌氧氨氧化污泥^[13]，外观为鲜艳的红色，厌氧氨氧化特征明显.每个实验过程中厌氧氨氧化污泥接种量为120 mL(量筒内10 min沉淀后的体积).厌氧氨氧化污泥接种入反应器前经过超纯水清洗3次，避免残留物对实验的影响.

营养液的主要成分为NH₄⁺-N(由NH₄HCO₃按需配制)、NO₂^--N(由NaNO₂按需配制)、Fe³⁺(FeCl₃按需配制)、SO₄^2--S(由Na₂SO₄按需配制)、KH₂PO₄ 27mg·L^-1、CaCl₂·2H₂O 92mg·L^-1、MgCl₂·7H₂O 16.5mg·L^-1，微量元素浓缩液1.25 mL·L^-1.微量元素浓缩液组分为：EDTA 5 000 mg·L^-1，ZnSO₄·7H₂O 430 mg·L^-1，CoCl₂·6H₂O 240 mg·L^-1，CuSO₄·5H₂O 250 mg·L^-1，NaMoO₄·2H₂O 220 mg·L^-1，NiCl₂·6H₂O 190 mg·L^-1，NaSeO₄·10H₂O 210 mg·L^-1，H₃BO₄ 14 mg·L^-1.

分析方法参见文献[14]. NH₄⁺-N:纳氏试剂分光光度法；NO₂^--N和NO₃^--N：戴安ICS900/AS23离子色谱；pH和ORP由在线监测探头测定；MLSS和MLVSS:重量法；TN：以NH₄⁺-N，NO₂^--N和NO₃^--N三者之和表示TN；Fe²⁺和Fe³⁺：邻菲啰啉分光光度法.

采用基于SYBR Green Ⅱ法的实时荧光定量PCR对反应器启动前后功能微生物群落进行了定量分析，主要功能菌包括AOB、NOB及ANAMMOX菌.定量PCR所采用的引物如表 1所示.采用Eppendorf扩增仪对上述功能菌群进行定量扩增.扩增体系为10 μL，包括5 μL 2xSYBR Green ExTaq Mix，0.25 μL正反向引物(20 mmol·L^-1)、1 μL DNA模板、3.5μL ddH₂O.实验步骤及操作参照文献[16].为了确保数据的可靠性，每个污泥样品设置3组平行.目标菌种的定量标准曲线R²均大于0.99，扩增效率处于90%~110%.

表 1 (Table 1)

表 1 亚硝化菌、硝化菌、厌氧氨氧化菌和全菌PCR扩增中采用的引物[15] Table 1 PCR primers targeting at AOB, NOB, ANAMMOX and the total bacteria

表 1 亚硝化菌、硝化菌、厌氧氨氧化菌和全菌PCR扩增中采用的引物[15] Table 1 PCR primers targeting at AOB, NOB, ANAMMOX and the total bacteria

在反应器1运行初期，进水氨氮浓度120.4mg·L^-1，亚硝态氮浓度62mg·L^-1，恒定pH为7.7，经过144 h培养后，氮素形态及浓度变化如图 2所示.运行4 h后，反应器1内的氨氮浓度降低到73.1mg·L^-1，亚硝酸盐浓度下降到1.4mg·L^-1，硝态氮浓度增加到11.3mg·L^-1，此时亚硝酸盐消耗量与氨氮的消耗比为1.28，硝酸盐的生成量与氨氮的消耗量比值为0.22，表明接种污泥为典型的以亚硝酸盐为电子受体的厌氧氨氧化污泥，有明显的厌氧氨氧化特征^[16].当反应器1运行24 h后，氨氮浓度继续降低到60.03mg·L^-1，亚硝态氮剩余浓度几乎为0mg·L^-1，硝酸盐浓度出现了明显的下降，浓度为3.9 mg·L^-1，硝酸盐与氨氮的消耗量比为0.56.有趣的现象是随着反应器运行到144 h，在无明显电子受体存在且ORP处于-100 mV的条件下，氨氮继续下降，最终氨氮浓度下降到0.67mg·L^-1，转化率达到99.5%，硝态氮浓度为0.55mg·L^-1，在此期间监测到少量亚硝酸盐的生产，浓度处于0~3mg·L^-1之间波动，可能是因为接种污泥为厌氧氨氧化污泥，能够快速利用环境中的氨氮和亚硝酸盐进行厌氧氨氧化反应，导致亚硝酸盐无法累积.因此从反应器1的运行结果可以看出厌氧氨氧化污泥中确实存在着氨氮的过量氧化.

图 2

Fig. 2

图 2 厌氧氨氧化污泥中氨氮的过量转化 Fig. 2 Ammonium excess oxidation in ANAMMOX sludge

近年来一些研究者在不同的厌氧环境中发现不仅亚硝酸盐可以作为氨氮氧化的电子受体，硫酸盐^{[5, 6]}、小分子有机酸^[4]、铁盐^[9~11]均可作为电子受体.在配制模拟废水时加入的微量元素和接种的污泥中也存在这类物质，因此推测这类物质可能参与了氨的过量氧化.同时为了探讨接种污泥中本身存在的物质对氨氮过量氧化的影响，在1 L血清瓶中接种120 mL污泥，通过加纯水定容至1 L，将厌氧氨氧化污泥经过相同环境下126 h饥饿衰减后对液相组分进行测定，液相中存在一定量的有机物、硫酸盐和铁盐(表 2).为了进一步探讨这些物质是否参加氨氮转化的反应，采用反应器2和反应器3进行多种电子受体实验，从氨氮转化量及转化途径探讨其转化的途径.

表 2 (Table 2)

表 2 污泥经饥饿后液相中物质的浓度 Table 2 Concentrations of the substances in liquid phase after sludge starvation

表 2 污泥经饥饿后液相中物质的浓度 Table 2 Concentrations of the substances in liquid phase after sludge starvation

在反应器2的运行初期，进水氨氮浓度95.81mg·L^-1，亚硝氮浓度42.48 mg·L^-1，硫酸盐浓度22.6mg·L^-1，Fe³⁺浓度24.48mg·L^-1，pH为7.3，经过168 h培养后，物质浓度变化如图 3所示.当反应器2运行3 h后，同样出现氨氮和亚硝酸盐浓度快速下降的现象，其浓度分别为63.85mg·L^-1和0.89mg·L^-1，硝酸盐生成浓度为8.1mg·L^-1，其他电子受体浓度未发生明显变化.亚硝氮转化量、硝氮生成量与氨氮消耗量的比为1.30和0.25，出水pH上升至7.58，说明在厌氧氨氧化污泥中亚硝酸盐是最优的电子受体，优先被厌氧氨氧化菌利用.

图 3

Fig. 3

图 3 同时多种电子受体存在时氨氮的转化 Fig. 3 Ammonia conversion with a variety of electron acceptors at the same time

在无亚硝酸盐作为电子受体的条件下，当反应器运行至16 h，硝酸盐的浓度下降到2.34mg·L^-1，此时氨氮浓度为57.06mg·L^-1，未发现亚硝酸盐的累积，硝酸盐与氨氮的消耗量比值为0.85.此时反应器内硫酸盐和Fe³⁺离子浓度出现小幅波动，分别为23.94mg·L^-1和21.28mg·L^-1，未发现S^2-的存在，但是发现少量Fe²⁺的存在.出水pH值下降至7.5.目前的研究结果表明厌氧氨氧化微生物无法直接利用硝酸盐作为电子受体与氨氮反应^[17].但是厌氧氨氧化菌体内含有硝酸盐还原酶^[18]，因此在有一些其他电子供体存在的条件下，可将硝酸盐还原为亚硝酸盐，然后再与氨氮发生厌氧氨氧化反应^{[11, 19]}.目前，氨氮和硝酸盐同步去除方法主要是通过有机物^[20]、Fe^2+[21]和单质硫^[22]等.而反应器2内微生物自身存在部分死亡，会产生一定的有机物，所以此处硝酸盐应还原为亚硝酸盐，然后参与了氨氮的过量氧化.

在无亚硝酸盐和硝酸盐的情况下，随着反应器2的持续运行至168 h后，氨氮浓度下降到6.85mg·L^-1，亚硝酸盐浓度处于1mg·L^-1以内波动，硝酸盐在运行后期累积到12.11mg·L^-1，硫酸盐略有升高至26.64mg·L^-1，但是出现了Fe²⁺的累积，此阶段基本处于5.59~6.3mg·L^-1之间.出水pH值下降到6.85.说明反应器2运行后期还存在着其他的电子受体与氨氮反应导致其过量氧化，并且是一个产酸的过程.从物质的转化看，仅铁离子发生了价态的转化.近年来，Clément等^[23]和Shrestha等^[24]均报道了在厌氧的条件下发生了Fe³⁺还原氨氧化的现象，其产物可能是硝酸盐、亚硝酸盐或者氮气，并且也认为该反应是一个产酸的过程.本实验中的条件与其一致，因此该反应器中应该存在Fe³⁺参与了氨氮的过量氧化.在反应后期氨氮的转化量明显大于铁离子的转化，因此还应该存在其他的电子供体.

为了进一步探讨氨氮转化过程潜在的电子受体，在反应器3运行的初期仅投加120.7mg·L^-1的氨氮，无微量元素，因此反应器内无其他电子受体.经过7 d(约168 h)的运行，反应器内氨氮浓度未出现明显的下降，浓度维持在121.7mg·L^-1(图 4).由饥饿实验(表 2)可知，出现波动是因为部分微生物的死亡. TOC浓度由0mg·L^-1增加到5.4mg·L^-1进一步证实了该推论.分别在反应器运行的第8 d和11 d向反应器内添加硫酸盐(浓度23.7mg·L^-1)和Fe³⁺(浓度12.58mg·L^-1).然而当反应器运行至13 d时，氨氮浓度为118.37mg·L^-1，未出现明显的下降，硫酸盐浓度27.1mg·L^-1，Fe³⁺浓度9.5mg·L^-1，Fe²⁺浓度3.0mg·L^-1.说明此时硫酸盐未参与厌氧氨氧化反应，而Fe³⁺参与量很少.此时的厌氧氨氧化污泥曾现出暗黄色.

图 4

Fig. 4

图 4 不同电子受体不同时间存在时氨氮的转化 Fig. 4 Ammonia conversion with a variety of electron acceptors at the different time

考虑到长期未有适宜的电子受体存在，导致微生物因内源硝化而使得生物活性下降，在反应器运行的第14 d，投加少量的亚硝酸盐，浓度为58.36mg·L^-1，2 h以内氨氮出现快速下降.当反应器运行至15 d时，氨氮浓度下降到63.7mg·L^-1，亚硝氮浓度为0mg·L^-1，硝酸盐浓度从检测到的最高值7.7mg·L^-1下降到2.5mg·L^-1.更奇怪的是在随后没有亚硝酸盐和硝酸盐存在的情况下，氨氮继续出现下降.当反应器运行至21 d时，氨氮浓度下降到50.1 mg·L^-1，硫酸盐浓度为26.5mg·L^-1，未出现明显的下降. Fe³⁺浓度小幅下降，同时有少量Fe²⁺的生成，浓度约5mg·L^-1左右.此时ORP为-100~-50 mV，同时通过刃天青指示剂的投加进一步确定反应器不存在漏氧的现象.与反应器2对比分析可知，必须通过投加亚硝酸盐激活厌氧氨氧化菌的活性才能实现反应器3内出现明显的过量氧化，但是过量氧化氨氮的电子受体何来，尚未明确. Bodelier等^[25]发现生物体内的氨氧化酶可以产生H₂O₂，然后为环境中提供氧分子，并且该过程是一个pH值下降的过程. Sabumon等^[26]研究也表明即使ORP在-185~-275 mV的条件下，Fe²⁺可能与厌氧氨氧化菌细胞产生的H₂O₂发生芬顿反应.因此可以推测后期的氨氮的过量氧化极有可能是因此而发生.

为了进一步强化氨氮的过量氧化，在反应器4运行初期投入氨氮、亚硝酸盐、硫酸盐和Fe³⁺，浓度分别为90.58、43.3、25和15 mg·L^-1.在反应器运行的前120 h，反应器内发生的现象基本与反应器2中一样(图 5)，首先出现发生以亚硝酸盐为电子受体的厌氧氨氧化反应，产物的硝酸盐不断积累.当亚硝酸盐去除后，硝酸盐浓度开始逐步降低.硝酸盐降低完成后，氨氮仍然持续降低. 128 h后，反应器内氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐，硫酸盐和Fe³⁺，浓度分别为0、0.78、7.36、25.1和10.53mg·L^-1.为了进一步探究氨氮的过量氧化，此时仅向反应器内投加134mg·L^-1的氨氮.随着反应器内的持续运行，反应器内氨氮仍然持续降低.当反应器运行至470 h时，反应器内氨氮、亚硝酸盐、硝酸盐，硫酸盐和Fe³⁺，浓度分别为47.66、0、0、14.09和1.053 mg·L^-1，同时出现11.92mg·L^-1的Fe²⁺，无硫化物的产生. Liu等^[5]和Yang等^[6]分别报道了在无机营养条件下，接种厌氧氨氧化污泥的反应器实现硫酸盐和氨氮去除的结果，但是具体的转化途径尚未明确. Sabumon等^[26]认为厌氧氨氧污泥中硫酸盐的降低是硫酸盐先与有机物反应生成硫化物，产生的硫化物再与硝酸盐和亚硝酸盐反应产生单质硫.不管其途径如何，但是其最终转化的产物与氨氮发生反应前，是氨氮过量氧化的一个潜在电子受体.

图 5

Fig. 5

图 5 多电子存在时氨氮过量氧化持续性 Fig. 5 Duration of ammonia conversion with a variety of electron acceptors

随着反应器后期持续的运行，反应器内无亚硝酸盐，硝酸盐、Fe³⁺等电子受体的情况下，氨氮基本维持在45mg·L^-1，未出现明显的降低，说明后期的氨氮过量氧化不能持续.推测其原因可能是在无电子受体存在的条件下，微生物的活性逐步降低，所产生的H₂O₂下降，导致氨氮不能持续的下降.

将同时存在多电子的反应器2污泥进行了主要氮素转化微生物的分析，包括全菌、厌氧氨氧化菌、亚硝化菌和硝化细菌，如图 6所示.接种污泥中基本以厌氧氨氧化菌为主(0 h)，同时存在少量的亚硝化菌和硝化细菌.当反应器2内亚硝酸盐和硝酸盐完全去除时(16 h)，反应器内的微生物拷贝数(以湿重计，下同)为1.32E+10拷贝·g^-1，获得一定的增长，厌氧氨氧化菌拷贝数为3.62E+09拷贝·g^-1，亚硝化菌拷贝数11.3E+03拷贝·g^-1，均获得了增长.而硝化菌拷贝数为2.96E+02拷贝·g^-1，出现小幅下降.当反应器内无亚硝酸盐和硝酸盐的情况下，氨氮降解缓慢.当反应器2运行至170 h，反应器内微生物群落数量发生了巨大的变化，总细菌拷贝数为9.83E+09拷贝·g^-1，出现明显的下降；厌氧氨氧化菌拷贝数下降到1.52E+09拷贝·g^-1；亚硝化菌和硝化菌拷贝数分别增长到2.41E+05拷贝·g^-1和1.29E+04拷贝·g^-1.进一步说明后期的氨氮过量氧化是由亚硝化菌参与完成的，但是氧的来源是否是氨氧化酶产生还需要进一步深入研究.

图 6

Fig. 6

图 6 多电子存在时氨氮过量转化过程中微生物的变化 Fig. 6 Change of microbes during ammonia excess conversion with a variety of electron acceptors

(1) 在无亚硝态氮的情况下，4个反应器内均出现氨氮浓度的下降，因此所接种的厌氧氨氧化污泥中确实存在着氨氮的过量氧化现象.

(2) 所接种的污泥是以亚硝酸盐为电子驯化出的厌氧氨氧化污泥，所以亚硝酸盐成为最适合的电子受体，在参与氨氮转化过程被首先利用.随后硝酸盐、硫酸盐和Fe³⁺等成为直接或者间接电子受体参与氨氮的过量氧化反应，机理还需要深入分析.

(3) 在保证厌氧氨氧化活性的条件下，除了硝酸盐、硫酸盐和Fe³⁺之外，还存在着导致过量氨氮转化的物质，促使氨氮的氧化，伴随着氨氧化菌和硝化菌大量生长.