在污水处理中，由于硝化细菌是自养异养细菌且生长缓慢，容易流失，所以近年来固定化微生物技术的应用越来越受到人们的关注.固定化微生物技术是通过化学或物理的手段, 将微生物细菌限定于载体空间区域内，保持其活性并且可以反复利用^{[1, 2]}.与传统生物处理法相比，固定化微生物技术具有微生物流失少、污泥产量少、抗冲击负荷能力强等优点，可以包埋预先筛选出的特种菌种，运用于污水处理系统中^[3~6].目前，包埋固定化硝化细菌处理氨氮废水成为国内外学者的研究焦点.郝婧^[7]所用的包埋固定化硝化细菌处理高氨氮废水，在反应温度为28~30℃，pH为8.2，包埋颗粒体积填充率为25%的条件下，氨氧化速率最高约30 mg·(L·h)^-1.赖鼎东^[8]利用固定化氨氧化细菌进行含氮废水短程硝化时发现，温度为30℃，pH为8.5时亚硝酸盐氮积累率可达90%以上，氨氧化速率最高约为7.9 mg·(L·h)^-1.Inoue等^[9]以聚乙烯醇为载体固定硝化细菌，填充率为50%时处理低温氨氮废水，硝化速率为17 mg·(L·h)^-1.由此可见包埋硝化细菌处理氨氮废水反应效率通常较低，且包埋后需严格控制反应条件，达到亚硝酸盐氮的高积累.

因此，包埋硝化细菌实现短程硝化是可行的.但硝化细菌中氨氧化细菌含量较少，严重影响了硝化速率.为此，本实验研究氨氧化细菌的包埋固定化.以水厂回流污泥为菌源，定向筛选AOB并淘汰NOB，以期达到细菌包埋完成后能实现较高的氨氧化速率和亚硝酸盐氮积累率.

实验污泥取自北京高碑店污水处理厂硝化污泥.污泥富集培养连续流装置见图 1，反应池有效容积22 L.

图 1

Fig. 1

图 1 污泥富集培养装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of sludge enrichment and cultivation device

污泥富集培养实验采用人工模拟氨氮废水，主要成分有: NH₄Cl(投加量取决于NH₄⁺-N浓度)，Na₂CO₃(投加量取决于NH₄⁺-N浓度)，K₂HPO₄、KH₂PO₄(投加量取决于NH₄⁺-N浓度，其中N:P为5)，MgSO₄·7H₂O(20mg·L^-1)，CaCl₂·2H₂O(10mg·L^-1).每升进水中加入0.5 mL微量元素，其中ZnSO₄·7H₂O(0.12 mg·L^-1)，NaMoO₄·2H₂O(0.12mg·L^-1)，CoCl₂·6H₂O(0.15mg·L^-1)，MnSO₄·H₂O(0.12mg·L^-1)，NiCl₂·6H₂O(0.120 mg·L^-1)，CuSO₄·5H₂O(0.03mg·L^-1)和FeCl₃·6H₂O(1.5 mg·L^-1)^[10~13].

培养过程中反应温度控制在25℃，DO为1~1.5 mg·L^-1范围内，pH为8~8.4.实验起始时MLSS为4 030 mg·L^-1，MLVSS为2 473 mg·L^-1，实验过程中每天连续排泥.初期进水氨氮浓度为100 mg·L^-1，后逐步提高至700 mg·L^-1.水力停留时间由4 h缩短到2 h.

按照本实验室成熟的包埋技术，取7 L富集培养后的污泥进行离心浓缩，加入胶状体聚乙烯醇(PVA)混合制成包埋液，均匀涂装在条状载体上，包埋液中PVA与浓缩污泥的浓度分别为10%和25%^[14~16].以硼酸和无水硫酸钠为交联剂交联4 h.包埋连续流装置同上，包埋填料填充率为8%.实验采用人工模拟氨氮废水，其构成同上.实验在室温下进行，反应pH为7.2~8，DO为2~4 mg·L^-1之间.实验进水氨氮浓度由50 mg·L^-1逐步提高至250 mg·L^-1，HRT为4 h.为适应高碑店污水处理厂的实际进水氨氮浓度，在氨氧化速率和亚硝酸盐氮积累率稳定后，降低进水氨氮浓度至30~40 mg·L^-1[17]，并缩短水力停留时间至2 h.

取原始污泥混合液和富集培养后的污泥混合液分别标记为Yu01和Yu02，提取DNA并对样本16S rRNA的V3-V4区域进行PCR扩增^[18~20].

采用Illumina HiSeq2500 PE250高通量测序平台对样品进行测序.针对测序数据进行环境微生物的16S分析，首先对原始的paired-end reads进行过滤得到高质量reads，然后通过序列拼接得到较长的序列，将其与16S参考数据库作比对，同时去除嵌合体序列，最终将过滤后的序列按照一定的阈值进行归类，得到多个序列聚类操作分类单元(OTUs)，设定阈值的序列相似性为0.97分为同一类，分成的一个类就是一个OTU，代表一个种^[21].接着根据OTUs结果进行α多样性的计算. α多样性指标包括丰富度指数(ACE)、多样性指数(Shannon、Simpson)、goods_coverage和observed_species等.其中丰富度衡量单个样本中物种种类个数，实际通过估算OTU的个数来衡量；多样性指数衡量群落的异质性. goods_coverage表示样品文库的覆盖率，即测序深度指数，其数值越高，则样本中序列没有被测出的概率越低. Observed_species代表该样品中OTU的个数.

NH₄⁺-N采用纳氏试剂分光光度法测定；NO₂^--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定；NO₃^--N采用紫外分光光度法测定^[22]；pH采用SX711便携式pH计测定；溶解氧采用JPSJ-605F型溶解氧仪测定.

从图 2可以看出，反应起始阶段(1~5 d)进水氨氮控制在100 mg·L^-1，HRT为4 h，污泥比氨氧化速率开始由0.103 g·(g·d)^-1缓慢增长至0.348 g·(g·d)^-1.此时还处于活性恢复阶段，为了提高污泥比氨氧化速率，从第6 d开始提高进水氨氮浓度并将HRT缩短为3 h.至第22 d，由于污泥比氨氧化速率增长较快，提高进水氨氮浓度至400 mg·L^-1并同时缩短HRT至2 h并保持不变.

图 2

Fig. 2

图 2 污泥进水氨氮浓度及污泥比氨氧化速率变化 Fig. 2 Changes of influent ammonia nitrogen concentration and sludge specific ammonia oxidation rate

经过30 d的富集培养，污泥比氨氧化速率呈对数增长至1.368 g·(g·d)^-1.随着污泥比氨氧化速率的不断提高，在水力停留时间2 h内出水氨氮浓度逐渐减小为零，此时反应较易向全程硝化转化.所以继续增加进水氨氮浓度至500 mg·L^-1，此时污泥比氨氧化速率增长缓慢，说明高浓度氨氮对氨氧化细菌的活性有一定抑制作用.而后继续增加进水氨氮浓度至700 mg·L^-1，可以发现在短暂的适应期过后，污泥比氨氧化速率继续增长，最终高达2.028 g·(g·d)^-1.污泥比氨氧化速率的持续增长可以证明富集培养阶段氨氧化细菌活性不断增强.

由于反应体系中始终保持着较高浓度的亚硝酸盐氮，作为NOB的反应底物，亚硝酸盐氮的积累对NOB的生长有一定的促进作用.为了将NOB彻底淘洗出去，实验过程中每天不断排泥.从图 3可以看出，前23 d系统中MLVSS不断增长，这是由于前期排泥量较小.为保持系统中稳定的污泥浓度，第24 d开始加大排泥量，污泥浓度逐渐减小，至第35 d基本稳定.尽管每天不间断排泥，系统总污泥浓度仍不间断增长，后由高通量测序可知污泥中氨氧化细菌大量增长.

图 3

Fig. 3

图 3 污泥浓度变化 Fig. 3 Changes of sludge concentration

从图 4可以看出，反应起始阶段(1~5 d)亚硝酸盐氮积累率由33%迅速增长至70%.从第6 d开始提高进水氨氮浓度后，亚硝酸盐氮积累率进一步增加至85%以上并逐渐稳定.此后由于氨氮浓度不断提高，FA对NOB的抑制作用不断增大，且每天不间断地排泥，致使NOB活性越来越低且数量越来越少.而此时氨氧化细菌大量增长且活性不断增强，在系统中占有明显的生态优势.这使得亚硝酸盐氮积累率从第20 d起始终保持在90%以上.

图 4

Fig. 4

图 4 污泥亚氮积累率变化 Fig. 4 Changes of nitrite nitrogen accumulation rate of sludge

本实验进行至第60 d，污泥比氨氧化速率的高表达和亚硝酸盐氮的高积累已达到预期效果，此时取污泥样品进行高通量测序，结果表明氨氧化细菌已成为优势菌种，可以进行后续包埋实验.另外，本实验污泥富集培养阶段出水用于反硝化实验，脱氮后排放.

通过对两组样品16S rRNA基因文库高通量测序，污泥原样(Yu01) 与富集培养后的污泥样品(Yu02) α多样性指标计算结果见表 1.

表 1 (Table 1)

表 1 α多样性指标计算结果 Table 1 The α diversity index calculation results

表 1 α多样性指标计算结果 Table 1 The α diversity index calculation results

由表 1可知，两个样品的文库覆盖率均大于0.98，表明测序深度已经基本覆盖到样本中所有的物种. Yu01的Shannon多样性指数和Simpson多样性指数大于Yu02，说明原污泥群落多样性高于筛选后的污泥.多样性指数较高的原始污泥群落各种之间个体分配较均匀，而筛选后的污泥各种之间生物量差异较大，优势种群明显.

为了更深入研究系统的优势菌种，计算每个样本在属级的相对丰富度. 表 2、表 3列出了每个样品前三类优势菌属及与硝化作用相关的Nitrospira和Nitrosomonas所占百分比及系统分类.

表 2 (Table 2)

表 2 Yu01优势菌属 Table 2 Dominant genera of Yu01

表 2 Yu01优势菌属 Table 2 Dominant genera of Yu01

表 3 (Table 3)

表 3 Yu02优势菌属 Table 3 Dominant genera of Yu02

表 3 Yu02优势菌属 Table 3 Dominant genera of Yu02

与常规分子生物学手段相比，高通量测序可以提供更丰富的微生物信息.尽管如此，Yu01与Yu02仍有50.5%与51.4%的序列无法归入已知细菌属.原泥样品菌群分布较均匀，均为废水处理系统中的常见菌种^{[23, 24]}.其中与硝化作用相关的为Nitrospira和Nitrosomonas.已知的Nitrospira菌属为硝酸盐氧化细菌，Nitrosomonas菌属为氨氧化细菌，前者为后者的11.25倍.筛选后的污泥样品中，Nitrosomonas成为优势菌，这与Wells等^[25]的研究结果一致，即绝大多数反应器中Nitrosomonas是AOB的优势菌种.而Nitrospira仅占系统的0.02%，此时Nitrosomonas是Nitrospira的900倍.

对包埋填料进行活性恢复.由图 5可知起始阶段系统进水氨氮浓度为50 mg·L^-1，氨氧化速率由1 mg·(L·h)^-1缓慢增加至6 mg·(L·h)^-1.此时氨氧化速率较低，从第12 d起为提高反应速率将进水氨氮浓度增加至100 mg·L^-1，可以发现随着氨氮浓度的增加，氨氧化速率增长加快，至第19 d迅速增长至20 mg·(L·h)^-1.因此，通过逐步增加进水氨氮浓度的方法提高氨氧化速率是可行的.此后继续阶段性地提高进水氨氮浓度至250 mg·L^-1，氨氧化速率最可高达50 mg·(L·h)^-1.

图 5

Fig. 5

图 5 包埋填料氨氧化速率变化 Fig. 5 Changes of ammonia oxidation rate of immobilization filler

从图 6可以看出，实验过程中系统始终保持95%以上亚硝酸盐氮积累率.证明系统中氨氧化细菌始终保持着绝对的生态优势.由此可以证明，包埋固定本实验筛选后的氨氧化细菌有利于实现硝化系统中稳定的亚硝酸盐氮积累.

图 6

Fig. 6

图 6 包埋填料亚氮积累率变化曲线 Fig. 6 Changes of nitrite nitrogen accumulation rate of immobilization filler

为适应高碑店污水处理厂的实际进水氨氮浓度，在氨氧化速率和亚硝酸盐氮积累率稳定后，降低进水氨氮浓度至30~40 mg·L^-1.由图 7、8可以看出，系统始终保持着90%以上的氨氮去除率以及亚硝酸盐氮积累率.

图 7

Fig. 7

图 7 系统氨氮去除率变化 Fig. 7 Changes of ammonia nitrogen removal rate in the nitrification system

图 8

Fig. 8

图 8 系统亚氮积累率变化 Fig. 8 Changes of nitrite nitrogen accumulation rate in the nitrification system

(1) 采用连续流运行方式逐步提高进水氨氮浓度，可以促进氨氧化细菌活性的增强并使之大量增长，从而大大地提高氨氧化速率，但高浓度氨氮对氨氧化细菌的活性有一定的抑制作用.

(2) 固定化富集培养后的氨氧化细菌，反应器包埋填充率为8%时，氨氧化速率最高可达50 mg·(L·h)^-1，亚硝酸盐氮积累率稳定在90%以上.

(3) 用包埋填料处理水厂模拟污水，氨氮去除率和亚硝酸盐氮积累率均可保持在90%以上.