含盐废水(NaCl质量分数＞1%)主要来自于食品加工、石油天然气加工等工业排放、沿海地区海水利用直接排放的污水等^{[1, 2]}. 废水中含盐量过高时，会破坏微生物的细胞膜和菌体内的酶，对微生物的生长产生抑制或导致其死亡^[3]，而利用耐盐型微生物处理高盐废水是一种行之有效的方法. 目前，部分研究者已经驯化和筛选出耐盐脱氮微生物. 张兰河等^[4]采用逐步提高废水中NaCl浓度负荷的方法对活性污泥进行驯化，实现含盐废水序批式活性污泥法(SBR)工艺的启动，在温度为30℃、NaCl浓度为10g·L^-1的条件下，实现了含盐废水的短程硝化，并将NH₄⁺-N平均去除率维持在90%以上. 多数研究显示异养硝化菌同时也是好氧反硝化菌，异养硝化-好氧反硝化菌对环境的适应能力强于传统脱氮细菌，其耐盐脱氮性能在含盐污水脱氮处理方面有较大的应用潜力^[5~7]. 淡水厌氧氨氧化污泥进行长期的盐度驯化，厌氧氨氧化污泥最终可适应高达30g·L^-1的盐度环境^[8]. Dapena-Mora等^[9]将淡水厌氧氨氧化污泥经过驯化后，可以在3%水盐度下取得较好的脱氮性能，最大比厌氧氨氧化活性(SAA)出现在盐度为15g·L^-1时. Ma等^[10]研究表明，10 g·L^-1左右的NaCl盐度对厌氧氨氧化活性和污泥特性没有长期的不利影响，30g·L^-1 NaCl的冲击负荷是厌氧氨氧化反应器稳定运行所能耐受的阈值. 虽然目前关于厌氧氨氧化系统所能耐受的盐度负荷阈值不确定(30~75g·L^-1NaCl)，但工业高盐度废水中盐度都在1%以上，有时甚至高达3%~5%，如此高的含盐量会对常规厌氧氨氧化工艺产生明显的抑制作用，若要实现厌氧氨氧化工艺在此类废水处理中的有效应用，必须考虑高盐水质对厌氧氨氧化的潜在负面影响，开发1%在高盐环境下高效稳定厌氧氨氧化工艺的调控方法.

微生物主要通过两种方式来应对高盐胁迫，分别为：微生物增加细胞内离子浓度，尤其是钾离子浓度，来平衡外部渗透压，以便细胞内的酶能够适应新的环境(SI策略)和细胞内积累相容溶质，使外部高渗透压在细胞质中保持平衡(CS策略)^[11]. 研究人员发现当厌氧处理系统中的Na⁺浓度达到7 000~8 000mg·L^-1，会严重抑制厌氧微生物的生长. 如果加入适量的K⁺则抑制效应将下降60%，这种效应被称为拮抗效应^[12]. 通过长期驯化^[13]、添加相容性溶质(如甜菜碱、海藻糖)等措施^[14]，可应用厌氧氨氧化工艺处理高氨氮高盐度工业废水. 另外单独或组合投加对Na⁺具有拮抗作用的K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺以及Fe²⁺等，能大大减轻生物处理高盐肝素废水的抑制作用^[15].

目前的研究主要集中在脱氮微生物处理效率的影响层面，对环境胁迫响应的系统研究较少. 本实验采用SI策略，通过向已经海水驯化后的淡水厌氧氨氧化反应中添加不同浓度的KCl，探索利用K⁺缓解盐度对ANAMMOX活性抑制的可行性，从盐分对厌氧氨氧化脱氮过程的影响以及含盐废水生物脱氮强化措施等方面展开研究，以期为厌氧氨氧化处理高盐废水提供理论支持.

实验采用ASBR厌氧氨氧化反应器，其结构如图 1所示. 该反应器由有机玻璃制作而成，有效体积7 L. 人工配制的废水从反应器下部的进水口由恒流泵进入反应器内，内置电动搅拌器，整个反应器表面用黑布包裹，防止光线对厌氧氨氧化活性污泥造成负面影响. 反应器的外层有恒温水浴，温度控制在35℃±2℃，进水pH通过0.1 mol·L^-1的盐酸控制在7.4±0.1. 反应器运行1个周期的时间为4 h，其中进水2 min，反应时间4 h，静置20 min，出水3 min.

图 1

Fig. 1

1.取样口及进出水口; 2.排泥口; 3.搅拌; 4.水浴循环进出水口; 5.水浴恒温控制器; 6.水封; 7.进水蠕动泵; 8.储水箱; 9.水浴循环蠕动泵 图 1 ASBR厌氧氨氧化反应器装置示意 Fig. 1 Schematic of ASBR ANAMMOX reactor

实验所选厌氧氨氧化菌已经本课题组长期驯化，能在全海水条件下稳定运行. 在本实验开始时厌氧氨氧化效果较好，在4 h内，氨氮去除率60.35%，亚硝态氮56.83%，NLR为1.34 kg·(m³·d)^-1，NRR为0.712 kg·(m³·d)^-1，该污泥形态基本为颗粒状，呈现砖红色，污泥浓度为3.03g·L^-1.

实验所用废水由人工配置，废水主要由海水(5 L)、KH₂PO₄ 0.145 g、CaCl₂·2H₂O 0.75 g、MgSO₄·7H₂O 0.3 g、NaHCO₃ 8.4 g、微量元素Ⅰ和微量元素Ⅱ各6 mL. 微量元素Ⅰ：EDTA 5g·L^-1、FeSO₄·7H₂O 5g·L^-1;微量元素Ⅱ：EDTA 15g·L^-1、H₃BO₄ 0.011g·L^-1、MnCl₂·4H₂O 0.99g·L^-1、CuSO₄·5H₂O 0.25g·L^-1、ZnSO₄·7H₂O 0.43g·L^-1、NiCl₂·6H₂O 0.19g·L^-1、CoCl₂·6H₂O 0.24g·L^-1、(NH₄)₆MoO₂·4H₂O 0.16g·L^-1、NaSeO₄·10H₂O 0.159 6g·L^-1. NH₄⁺由NH₄Cl提供，NO₂^-由NaNO₂提供，确保进水氨氮为110mg·L^-1、亚硝态氮浓度为145.2mg·L^-1，K⁺由KCl按需配置，由于海水条件，配水中本身含K⁺约0.39g·L^-1. 废水的配制过程中首先利用高纯氮气曝气15 min，将水中的分子氧去除后，再按量投加NH₄Cl、NaNO₂和KCl，最后用恒流泵进水.

NH₄-N采用纳氏分光光度法；NO₂-N采用N-(1萘基)-乙二胺分光光度法；NO₃-N采用麝香草酚分光光度法；pH 值: WTW pH/0xi 340i 便携式pH 计;紫外/可见分光光度计:UV-5200；实验所要测的数据包括氨氮和亚硝态氮的去除率，硝态氮的生成量.

本实验研究不同浓度梯度下的K⁺对厌氧氨氧化性能的影响，K⁺浓度梯度设置为0、2、4、6、8、10、12、14、16、18、20和22 mmol·L^-1，当所加K⁺浓度使反应器脱氮效能低于0 mmol·L^-1时即为产生明显抑制，此时应停止实验，为了评价盐度对ANAMMOX活性的影响，引入参数活性比X，计算公式如式(1)，其中SAA和SAA₀分别为实验组和对照组的最大比厌氧氨氧化活性.

(1)

由图 2可知，在整个实验过程中，反应器在K⁺浓度提升的初期出现短暂的性能下降，但经过短暂的适应后便可恢复，随着进水K⁺浓度不断地递增，出水NH₄⁺-N和NO₂^--N浓度出现明显的变化，未添加K⁺时出水NH₄⁺-N和NO₂^--N平均浓度分别为35.38mg·L^-1和39.95mg·L^-1，当K⁺浓度为2 mmol·L^-1时，出水NH₄⁺-N和NO₂^--N平均浓度分别40.27mg·L^-1和45.21mg·L^-1，出水NH₄⁺-N与NO₂^--N浓度有一些提高. 但随后出水NH₄⁺-N和NO₂^--N平均浓度开始下降，最终在K⁺浓度为8 mmol·L^-1时，出水NH₄⁺-N平均浓度达到最低，为12.26mg·L^-1，此时出水NO₂^--N平均浓度为18.2mg·L^-1. 在K⁺浓度为10 mmol·L^-1时出水NO₂^--N平均浓度达到最低值，为17.66mg·L^-1，此时出水NH₄⁺-N平均浓度为13.27mg·L^-1. 此后随着K⁺浓度升高，出水NH₄⁺-N和NO₂^--N浓度呈波动式升高，但它们的浓度还是低于0 mmol·L^-1时，最终当K⁺浓度为22 mmol·L^-1时，出水NH₄⁺-N和NO₂^--N平均浓度分别为46.75mg·L^-1和43.91mg·L^-1，已低于0 mmol·L^-1时的出水浓度，K⁺对厌氧氨氧化菌的作用呈现先促进后抑制的总趋势.

图 2

Fig. 2

图 2 K+浓度变化对反应器各主要指标的影响 Fig. 2 Effect of K+ concentration change on main indexes of the reactor

在K⁺浓度为0 mmol·L^-1时，NH₄⁺-N 和NO₂^--N的平均去除率为60.4%和56.8%，ΔNO₃^--N为12~15mg·L^-1，NLR和NRR分别为1.341 kg·(m³·d)^-1和0.712 kg·(m³·d)^-1，反应器运行稳定. 当K⁺浓度为2 mmol·L^-1时，出水NH₄⁺-N与NO₂^--N浓度呈先下降后上升再下降的趋势，在本浓度梯度末期，与0 mmol·L^-1时相比，出水NH₄⁺-N与NO₂^--N的去除率已有一些提高，NH₄⁺-N与NO₂^--N的平均去除率由60.35%和56.83%上升到62.0%和57.9%，去除负荷NRR由0.712 kg·(m³·d)^-1上升至0.746 kg·(m³·d)^-1. 而ΔNO₃^--N有所下降，为6.55~11.62mg·L^-1，且X为94%. 由数据分析可知，由于K⁺的突然加入破坏了原先反应器中的平衡状态，因此出水NH₄⁺-N与NO₂^--N会首先呈上升趋势，但经过5 d的适应过程，在本浓度实验末期反应器已适应了K⁺存在，最终使得NH₄⁺-N与NO₂^--N去除率上升.

在K⁺浓度为4 mmol·L^-1的周期内，出水NH₄⁺-N与NO₂^--N的平均去除率为68.5%和65.3%，ΔNO₃^--N变化幅度较大，但生成量逐渐提升，NRR达到0.848 kg·(m³·d)^-1，K⁺对厌氧氨氧化处理高盐废水产生强化作用，厌氧氨氧化的脱氮效能得到明显提升. 当K⁺浓度持续上升，在6~8 mmol·L^-1的周期内，厌氧氨氧化的脱氮效能继续提升，最终在K⁺浓度为8 mmol·L^-1时达到最佳去除效果，NH₄⁺-N与NO₂^--N的平均去除率为89.2%和84.9%，NO₃^--N的平均生成量为14.9mg·L^-1，NRR为1.12 kg·(m³·d)^-1，SAA较对照组提高了58%，厌氧氨氧化菌活性达到最大. 在这一周期内厌氧氨氧化菌已适应钾离子变化，且适当提高进水钾离子的浓度有利于强化高盐环境下厌氧氨氧化脱氮效能.

K⁺浓度10 mmol·L^-1时反应器处于临界点，K⁺浓度的升高不再提升反应的脱氮效能，NH₄⁺-N、NO₂^--N的平均去除率为87.2%和84.8%，NRR达到1.09 kg·(m³·d)^-1，X为142%，去除效果有些下降，但下降趋势不明显，K⁺并没有产生明显抑制，仍表现为对厌氧氨氧化的促进作用. 在K⁺浓度为12、14和16 mmol·L^-1时的周期内，NH₄⁺-N、NO₂^--N和NRR的变化波动幅度较大，去除效率和NRR较10 mmol·L^-1时呈进一步下降趋势，ΔNO₃^--N开始逐渐降低. K⁺浓度的提升不再促进厌氧氨氧化反应，在K⁺浓度为18、20 mmol·L^-1周期内，去除率稳定下降，反应器已适应高浓度钾离子. 当K⁺浓度大于22 mmol·L^-1时，NH₄⁺-N 与NO₂^--N 出水浓度低于0 mmol·L^-1时浓度，去除率基本保持在56%以内，NRR为0.708 kg·(m³·d)^-1. 说明ANAMMOX 活性污泥受到抑制甚至死亡.

在整个海水驯化过程，ASBR 厌氧氨氧化反应器基本遵循厌氧氨氧化反应原理，其计量比与理论值1∶1.32∶0.26相接近^[16]. 由图 2(c)中可以看出，进水钾离子浓度变化时，NO₂^--N/NH₄⁺-N去除量比值和NO₃^--N/NH₄⁺-N 的比值开始偏离理论值1∶1.32∶0.26，但随着钾离子浓度的升高，反应器运行越来越稳定，而且，从NO₂^--N/NH₄⁺-N 比值的趋势可以看出，其比值在整个反应器运行过程中随着钾离子浓度升高而降低. NO₃^--N/NH₄⁺-N 的比值从K⁺浓度为2 mmol·L^-1后，一直小于理论值0.26，这可能由于海水中存在有机物质，为反硝化作用提供了碳源. 当K⁺浓度升高到4 mmol·L^-1时，反应器中NO₃^--N/NH₄⁺-N 的比值有所提高，这说明，提高钾离子浓度一定程度上缓解了盐的毒害作用，有助于ANAMMOX 菌的生长.

选取具有代表性的6个K⁺浓度梯度(0、2、8、14、20和22 mmol·L^-1)，考察了一个周期内NH₄⁺-N、NO₂^--N和NO₃^-N的浓度变化. 由图 3(a)~3(c)可知，随着K⁺浓度的提升，在8 mmol·L^-1时去除率达到最大，其NH₄⁺-N和NO₂^--N去除率为86.8%和84.%，随后K⁺浓度的提升对反应产生抑制，最终在K⁺为22 mmol·L^-1时反应器脱氮效能已低于0 mmol·L^-1时，此时可认为K⁺对反应产生明显抑制. 进水NO₃^--N则随着K⁺浓度提升而增加，这是由于前一浓度梯度NO₃^--N的积累导致的，而NO₃^--N变化量是不断增加的，但在14、20和22 mmol·L^-1浓度时，进水NO₃^--N几乎保持不变，NO₃^--N变化量却不断减少，这可能由于K⁺的增加对厌氧氨氧化菌活性产生抑制，却促进了反硝化作用，使得NO₃^--N被消耗.

图 3

Fig. 3

图 3 不同K+浓度下周期内各主要指标变化 Fig. 3 Changes of the main indexes at different K+ concentration during one cycle

由图 3(d)、3(e)可知，各K⁺浓度条件下体系pH值快速增加，与之相对应ORP呈递减趋势，随着K⁺浓度的增加，反应体系pH值增加越大，在K⁺浓度为8 mmol·L^-1时pH增加量最大为0.44，此后pH增加量呈递减趋势，这说明在8 mmol·L^-1时厌氧氨氧化菌活性达到最佳效果，此后过多K⁺产生不良影响，厌氧氨氧化菌活性开始降低.，由图 3(f)可知，在4 h内，基质浓度(NH₄⁺-N 和NO₂^--N 浓度之和)呈下降趋势，且基质去除速率各不相同. 在0 mmol·L^-1时，基质的去除速率呈先下降后逐渐提升再下降的趋势，且几乎每1h达到峰值；而在2、8和14 mmol·L^-1浓度时，其变化趋势呈先上升后下降再上升的趋势，又在8 mmol·L^-1时基质去除速率达到最大，约为64.8mg·(L·h)^-1，这应该是由于K⁺浓度适宜厌氧氨氧化菌生长而起到促进作用. 此后过高的K⁺浓度使微生物的代谢受阻，基质转化率降低.

反应器运行初始时所接种的厌氧氨氧化活性污泥的颜色为鲜红色[图 4(a)]，但随着K⁺浓度的增加，在10倍显微镜下观察到，厌氧氨氧化活性污泥的颜色逐渐呈现出暗红色[图 4(b)]，盐度增强了ANAMMOX 颗粒污泥的聚集能力^[17]，并且随着K⁺浓度的提升活性污泥的密度也逐渐增大；实验结束后在电镜下[图 4(c)]观察可以看到这些细菌呈球形，两面有火山口型凹陷，推测是典型的厌氧氨氧化细菌^[18]，这说明K⁺浓度的提升不会损害厌氧氨氧化菌的生长.

图 4

Fig. 4

图 4 实验过程中污泥状态 Fig. 4 Sludge status during the experiment

李智行等^[19]在对高效耐海水型厌氧氨氧化污泥的驯化过程中发现，当海水盐度提高过程中，厌氧氨氧化反应速率经历了升高、降低、再升高的过程，反应器对盐度冲击的响应可分为3个阶段:敏感期、过渡稳定期和恢复期^[20]. 齐泮晴等^[21]、Windey等^[22]在其研究过程中发现，通过梯度提高海水盐度对淡水污泥进行驯化后，厌氧氨氧化菌的耐海水盐度性能增强，最终可以适应高达3%的海水盐度环境. 在本实验中，通过60d的连续培养可知，K⁺浓度变化对高盐环境下厌氧氨氧化的影响较大，具体可以分为4个阶段：适应阶段,随着K⁺浓度的提高(0~2 mmol·L^-1)，厌氧氨氧化污泥不断适应K⁺的存在，厌氧氨氧化污泥的活性获得刺激，有利于污泥脱氮效能的提高，刺激后的NRR是刺激前的1.19倍；活性提升阶段(2~8 mmol·L^-1),K⁺浓度在此范围内变化时，厌氧氨氧化污泥活性随K⁺浓度变化而增大，污泥脱氮效能持续提高，在8 mmol·L^-1时达到最佳去除效果，这时的NRR是未加K⁺前的1.56倍；活性稳定阶段(8~20 mmol·L^-1)，随着K⁺浓度的进一步提高，厌氧氨氧化污泥活性开始下降，但NRR仍大于未加K⁺时的NRR，K⁺并未对厌氧氨氧化脱氮效能完全产生抑制；抑制阶段(大于20 mmol·L^-1)，随着K⁺浓度的进一步提高,厌氧氨氧化污泥活性进一步下降，最终处于完全抑制状态.

研究人员发现在厌氧处理系统中加入适量的K⁺可有效抑制钠盐的毒害作用，产生拮抗效应的机理可能与嗜盐菌具有吸K⁺排Na⁺的功能有关^[23]，此功能使得微生物细胞内一直处于一种高K⁺低Na⁺的情形^[24]. 何娟等^[23]在厌氧条件下驯化污泥发现K⁺在盐浓度大于16g·L^-1时开始表现出解抑效应，一些耐盐微生物的蛋白质和酶类需要较高的K⁺浓度才能维持正常的功能和结构. 有研究发现，在高盐环境下厌氧氨氧化菌内K⁺浓度随着NaCl浓度的提高而迅速增加，而胞内的Na⁺浓度并没有明显变化趋势^[25]. 在本实验中，K⁺对细胞膜的通透性强于Na⁺，厌氧氨氧化菌会优先吸收K⁺用来维持微生物渗透压，且K⁺维持微生物渗透压的作用远远大于Na⁺. 随着K⁺浓度的升高，厌氧氨氧化菌吸收越来越多K⁺以用来维持微生物渗透压，减轻了高盐环境对厌氧氨氧化菌的毒害作用，有效的提升了厌氧氨氧化脱氮效能.

根据嗜盐微生物的耐盐机制推断，厌氧氨氧化菌在极端的高盐环境下可以产生更多的胞外聚合物(EPS)来抵御极端的环境^{[26, 27]}，厌氧氨氧化微生物通过主动运输调节渗透压或产生胞外聚合物来抵抗高盐环境都要消耗大量能量，导致菌体扩增的时间受阻，而通过在厌氧处理系统中投加K⁺可以缓解高盐环境对微生物的毒害作用，从而达到提高系统的处理效果. 本实验结合嗜盐微生物耐盐机制推断厌氧氨氧化体内酶的产生、稳定和活性都需要较高浓度的K⁺来实现的，其吸收K⁺主要是通过钠钾泵^[28]和K⁺通道^[29]来实现. 研究发现K⁺对厌氧氨氧化颗粒污泥的影响与浓度有关：在一定浓度范围内，K⁺≤20 mmol·L^-1可作为辅酶或激活某些酶的活性. 何健^[30]研究发现保持反应器中较高的K⁺质量浓度(50mg·L^-1以上)可以减轻Na⁺对微生物的抑制作用，在本实验，厌氧氨氧化反应中K⁺也对Na⁺产生拮抗效应，促进了厌氧氨氧化菌的酶活性，钠盐的毒害作用被削弱，使菌体有更多能量用于扩增，提高了反应器的脱氮效能；高于一定浓度时(≥20 mmol·L^-1)，过量的K⁺也会产生盐毒害作用，抑制厌氧氨氧化颗粒污泥的酶活性.

基因组研究发现厌氧氨氧化菌利用通道转运蛋白进行基质转运，Na⁺-K⁺-2Cl协同转运蛋白和K⁺-Cl协同转运蛋白是厌氧氨氧化菌的铵离子转运蛋白^[31]，且NH₄⁺和K⁺的理化性质非常接近，NH₄⁺和K⁺常常竞争细胞膜上的共用离子通道^[32]. 厌氧氨氧菌中的脱氢酶是厌氧氨氧化反应的关键酶，过量Na⁺进入细胞后，会破坏脱氢酶、DNA等细胞内物质，并引起细胞凋亡^[33]，进而影响到了厌氧氨氧化污泥活性. 在本实验中，随着K⁺浓度的不断提高，K⁺与Na⁺、NH₄⁺竞争离子通道的能力越来越强，在Na⁺-K⁺-2Cl协同转运蛋白和K⁺-Cl协同转运蛋白的作用下，细胞内处于一种高K⁺低Na⁺的情形，脱氢酶活性提高，在K⁺为8 mmol·L^-1时脱氮效能达到最佳效果，在此之后，厌氧氨氧化菌对K⁺的吸收达到饱和，脱氢酶活性不会再提升，而过量的K⁺含量则会破坏脱氢酶，厌氧氨氧化的脱氮效能也会随之降低.

(1) 钾离子浓度变化对厌氧氨氧化菌脱氮效能影响研究结果表明，不同浓度的钾离子对厌氧氨氧化污泥脱氮效能影响有显著性差异，K⁺离子对厌氧氨氧化污泥脱氮效能的影响可分为4个阶段：适应阶段(0~2 mmol·L^-1)，厌氧氨氧化适应K⁺的存在；活性提升阶段(2~8 mmol·L^-1)，K⁺对厌氧氨氧化生物系统有促进作用，氮去除率显著提升；活性稳定阶段(8~20 mmol·L^-1)，脱氮效能处于稳定状态；抑制阶段(大于20 mmol·L^-1)，对厌氧氨氧化产生抑制作用，效果越来越明显.

(2) 在K⁺浓度为8 mmol·L^-1时达到最佳去除效果，NH₄⁺-N与NO₂^--N的平均去除率为89.24%和84.87%，NRR为1.113 kg·(m³·d)^-1，NH₄⁺-N和 NO₂^--N的去除率较未添加钾离子时分别提升了32.4%和33%，NRR提升了36%.