2017, Vol. 38
2. 中国科学院南京地理与湖泊研究所, 湖泊与环境国家重点实验室, 南京 210008
2. State Key Laboratory of Lake Science and Environment, Nanjing Institute of Geography and Limnology, Chinese Academy of Sciences, Nanjing 210008, China
近年来，有害藻类水华在湖泊和水库中频发，尤其在夏季，带来了生态危害，影响了饮水安全[1].藻类水华的暴发与水体富营养化是密不可分的[2]，藻类大量繁殖使得饮用水发臭[3, 4]，改变了湖泊群落结构，降低生物多样性.例如，水华阻挡光线达到水底，同时消耗大量氧气，这不仅改变了大型植被的结构还降低水质[5].此外，很多微囊藻属释放藻毒素威胁鱼类、鸟、牲畜、人类的健康[6, 7].水华的治理应该首先削减湖泊营养盐，从根本上阻断蓝藻水华生长的营养物质，但这是一个长期且耗资巨大的工程[8].化学方法抑藻，包括：铜、氯、铝、钙、高锰酸钾等[9]，已经发展多年但是这种方法容易产生二次污染并且专一性差[10].与化学法相比，粘土法被认为具有环境友好型特点，但是有毒的藻细胞被粘土吸附沉积于底泥后，其发生降解时会危害底栖生物[11].
近年来生物材料控藻广受关注，Kim等[12]发现玉竹水溶性提取物抑制铜绿微囊藻生长但是对小球藻(Chlorella vulgaris)生长影响不大. Park等[13]发现橡树提取物对铜绿微囊藻的抑制作用.自1980年代起，现场和实验室研究发现，大麦秆在水体中的降解可以有效抑制包括蓝藻、绿藻、硅藻等多种藻类的生长[14].接下来大量的研究证实，以干重计浓度范围为0.1~7.2 g ·L-1的西方型大麦秆可以有效抑制铜绿微囊藻生长[15~17]，稍低于西藏裸大麦秆(东方型大麦秆)的使用浓度(2.0~8.0 g ·L-1)[10].尽管大麦秆抑藻物质尚未确定，但是充分发挥抑藻作用的大麦需要至少3个月的降解已经被证实[18].近来，Park等[19]报告0.01 mg ·L-1的水稻秸秆甲醇粗提物可以有效地抑制铜绿微囊藻的生长，苏文等[20]研究发现浸泡5 d的水稻秸秆水提液即可显著抑制铜绿微囊藻生长，稻秆抑藻的有效浓度(以干重计)范围为2.0~10.0 g ·L-1.水稻秸秆，以往的农业废弃物可以成为一种具有抑制藻类水华巨大潜力的生物材料.
自然水体中藻类群落是由多种藻组成的，目前报告多是水稻秸秆对单一藻抑制效果的研究，限制了稻秆抑藻这一方法的推广应用，本文选用资源丰富、已有培育历史20年、江苏水稻主栽品种的武育梗为实验材料，在室内利用流式细胞仪对比了其秸秆对4种水华优势种或产生藻毒素的蓝藻和3种常见的绿藻生长的影响.目前大量的室内和野外实验研究抑藻效果采用的方法是计数或叶绿素含量测定[12, 15, 21, 22]，但是这种方法只能表示生物量的变化并不能监测生理和形态的改变，本文采用流式细胞仪，一方面快速监测了细胞浓度的变化[10]，同时观察了单个细胞形态和生理状况的变化[23, 24]，通过对不同藻细胞形态(细胞大小)和生理指标变化(叶绿素荧光)的分析，初步探究了水稻秸秆选择性抑制不同藻类生长的机制.
1 材料与方法 1.1 材料水稻秸秆用去离子水清洗3~5次，33℃下干燥5 d，剪成2 cm长的小段，粉碎，过40目筛.取20 g粉碎的稻秆，分别浸泡于装有400 mL无菌水的1 L锥形瓶中.密封放置于25℃的人工气候箱，光暗比12 h :12 h，5 d后稻秆浸泡液过GF/C膜用于抑藻实验.
1.2 藻种及培养蓝藻共4种，产毒铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa, FACHB-912)[25]、非产毒铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa, FACHB-469)、产毒水华鱼腥藻(Anabaena flos-aquae, FACHB -245)[26]和鱼害微囊藻(Microcystis ichthyoblabe, FACHB-1294).绿藻3种，羊角月牙藻(Selenastrum capricornutum, FACHB-271)、蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa, FACHB-9) 和斜生栅藻(Scenedesmus obliqnus, FACHB-416).藻种由中国科学院武汉水生生物研究所提供，用BG-11培养基[27]于光照培养箱中培养.培养条件为：光强40 μE ·(m2 ·s)-1，温度25℃，光暗比12 h :12 h，每天定时摇晃3次.
1.3 实验方法每种藻处理都设置1个对照组和6个质量浓度梯度组(0.5、1.0、2.0、4.0、8.0、10.0 g ·L-1)，在100 mL锥形瓶内加入35 mL BG11培养基，高温灭菌后接种处于对数生长期的藻，抑藻实验体系均用灭菌去离子水定容到50 mL，对照不加浸泡液，每个浓度梯度3个平行样，设置5个空白对照，培养3 d后加入不同浓度的稻秆浸泡液，于实验第7 d取样，过300目滤膜后，立即使用流式细胞仪(Becton Dickinson)和显微镜(Zeiss, Germany)进行测定和观察.
1.4 仪器分析应用FACSVantage SE流式细胞仪进行样品的测定，激光器为Coherent水冷氩离子激光器，激发的波长为488 nm.在FL3处收集叶绿素荧光，荧光检测波长为655~695 nm.藻细胞体积大小和叶绿素荧光强度分别以前向光散射(FSC)和FL3表征.每个样品所检测的细胞数为10 000个，检测到的数据在计算机上用软件WinMDI进行分析处理.并通过显微镜(Zeiss, Germany)对藻类细胞生长、群体形成进行了观察，当观察到群体形成时，每个群体包含的细胞数目多少的计算参照文献[28].
1.5 统计分析根据藻密度计算7种藻的抑制率，计算公式为：
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式中，N为处理组的藻密度，N0为对照组的藻密度.
FSC和叶绿素荧光强度表示为占对照组的百分数，计算公式为：
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式中，Fc为对照组的荧光强度平均值，Ft是稻秆浸泡液处理组的荧光强度平均值.每组3个平行，数据以平均值±标准方差表达，用SPSS 16.0软件包进行统计分析，组间差异利用one-way analysis of variance(ANOVA)分析，P < 0.05表示显著性差异.
2 结果与分析 2.1 RSE对7种淡水藻生长的影响经过RSE高浓度10.0 g ·L-1处理后，蛋白核小球藻、羊角月牙藻和斜生栅藻的藻液颜色加深，镜检结果显示视野中的藻个数显著增加(图 1)，铜绿微囊藻、鱼害微囊藻、水华鱼腥藻的藻液明显变澄清，表明蓝藻的生长可能被抑制了(图 2).这一实验结果在图 3中得到证实.
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图 1 暴露于10.0 g ·L-1稻秆浸泡液7 d后对3种绿藻生长的影响 Fig. 1 Effect on growth of three green algae cells after a 7-d RSE exposure at 10.0 g ·L-1 |
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图 2 暴露于10.0 g ·L-1稻秆浸泡液7 d后对4种蓝藻生长的抑制作用 Fig. 2 Inhibition effect on growth of four blue algae cells after a 7-d RSE exposure at 10.0 g ·L-1 |
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不同的字母表示两者存在显著差异, P < 0.05 图 3 不同浓度稻秆浸泡液对7种藻生长的影响 Fig. 3 Effect of RSE on the growth of seven freshwater algae at different extract concentrations |
RSE对3种绿藻(蛋白核小球藻、羊角月牙藻和斜生栅藻)和4种蓝藻(2种铜绿微囊藻、鱼害微囊藻、水华鱼腥藻)的生长有促进和抑制两种作用(图 3).低浓度时(0.5~4.0 g ·L-1)RSE对3种绿藻生长的影响具有特异性，但是高浓度(8.0~10.0 g ·L-1)的RSE显著促进了3种绿藻的生长[图 3(a)]. 0.5 g ·L-1时，RSE促进了蛋白核小球藻和斜生栅藻的生长，轻度抑制了羊角月牙藻的生长；1.0 g ·L-1时，蛋白核小球藻的生长被RSE促进了25%，RSE对羊角月牙藻的抑制率为7.9%，RSE对斜生栅藻的生长影响不明显[图 3(a)]. 2.0~10.0 g ·L-1时，蛋白核小球藻和斜生栅藻的生长随着RSE浓度升高，被促进的作用持续增强，RSE对斜生栅藻的促进作用强于蛋白核小球藻；2.0和4.0 g ·L-1的RSE对羊角月牙藻的抑制率分别为15.2%和8.0%[图 3(a)]，8.0和10.0 g ·L-1的RSE显著促进了羊角月牙藻的生长，但促进的程度低于另外2种绿藻，10.0 g ·L-1时，与对照组相比，斜生栅藻、蛋白核小球藻和羊角月牙藻的生长分别被促进了895%、226%和41%.
RSE显著抑制了4种蓝藻的生长[图 3(b)]，其发挥抑藻效果的最低有效浓度为2.0 g ·L-1. 0.5~2.0 g ·L-1的RSE显著促进了鱼害微囊藻和非产毒铜绿微囊藻的生长[范围为6%~26%，图 3(b)]；2.0~10.0 g ·L-1的RSE显著抑制了4种蓝藻的生长[范围为5%~98%，图 3(b)]，并且抑制效果随暴露浓度增加而增强.
2.2 RSE对7种藻的细胞大小和叶绿素荧光强度的影响RSE显著影响了7种淡水藻的细胞大小和叶绿素荧光强度(图 4).对斜生栅藻和蛋白核小球藻来说，影响其细胞大小[图 4(a)]和叶绿素荧光强度[图 4(b)]的最低有效浸泡液的浓度为4.0 g ·L-1.当RSE不低于4.0 g ·L-1时，与对照组相比，RSE处理后蛋白核小球藻的细胞大小(ANOVA, P < 0.05) 和叶绿荧光强度(ANOVA, P < 0.05) 明显变大；斜生栅藻细胞明显变大(ANOVA, P < 0.05) 但是叶绿素荧光强度却明显变小(ANOVA, P < 0.05).对羊角月牙藻来说[图 4(a)和4(b)]，与对照组相比，只有当RSE范围为1.0~4.0 g ·L-1时显著抑制了叶绿素荧光强度(ANOVA, P < 0.05)，但是细胞大小没有发生明显变化.
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图 4 FSC、叶绿素荧光强度暴露于稻秆浸泡液7 d后的变化 Fig. 4 Variations in FSC and in vivo chlorophyll-a fluorescence after a 7-d RSE exposure |
图 4(c)和图 4(d)显示RSE显著影响了蓝藻的细胞大小和叶绿素荧光强度，且对不同蓝藻的细胞大小和叶绿素荧光强度的影响存在很大差异. RSE处理后，与对照组相比，产毒铜绿微囊藻细胞随着暴露浓度增加而增大(ANOVA, P < 0.05)，非产毒的铜绿微囊藻细胞的大小在低浓度下(<4.0 g ·L-1)减小，高浓度下比对照组显著增大(>4.0 g ·L-1, P < 0.05)，10.0 g ·L-1时产毒铜绿微囊藻细胞增大的数量是非产毒铜绿微囊藻的4倍；2.0~10.0 g ·L-1时鱼害微囊藻和水华鱼腥藻的细胞大小显著下降，10.0 g ·L-1时鱼害微囊藻细胞大小的抑制程度是水华鱼腥藻的6倍. RSE为0.5~1.0 g ·L-1时，与对照组相比，水华鱼腥藻和2种铜绿微囊藻的叶绿素荧光强度被显著抑制了(ANOVA, P < 0.05)，鱼害微囊藻的叶绿素荧光强度分别被促进了27%(ANOVA, P < 0.05) 和7%(ANOVA, P>0.05). RSE为2.0~10.0 g ·L-1时，图 5显示蓝藻的荧光强度可以分为两部分：正常荧光强度区域和被抑制的荧光强度的区域.稻秆浸泡液对铜绿微囊藻(M. aeruginosa-469, M. aeruginosa-912)、鱼害微囊藻和水华鱼腥藻荧光强度均值的抑制率由浸泡液浓度为2.0 g ·L-1时的27%、46%、51%、65%升为10.0 g ·L-1时的74%, 93%, 95%和95%[图 4(d)]，这可能是因为荧光强度正常区域的细胞大多迁移至荧光强度被抑制的区域造成的(图 5).
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图 5 暴露于浓度为2.0~10.0 g ·L-1的稻秆浸泡液的铜绿微囊藻(M. aeruginosa-469, M. aeruginosa-912)，鱼害微囊藻(M. ichthyoblabe)和水华鱼腥藻(A. flos-aquae)叶绿素荧光强度的迁移 Fig. 5 Histogram overlay showing shift in in vivo chlorophyll-a fluorescence of M. aeruginosa-469, M. aeruginosa-912, M. ichthyoblabe and A. flos-aquae exposed to a dose range of 2.0-10.0 g ·L-1of RSE |
表 1列出了RSE处理后7种淡水藻的7 d EC50值，表明7种藻对水稻秸秆的敏感性由大到小顺序为产毒水华鱼腥藻>鱼害微囊藻>产毒铜绿微囊藻>不产毒铜绿微囊藻>羊角月牙藻、蛋白核小球藻、斜生栅藻. RSE对7种淡水藻生长的影响包括促进和抑制作用，以前已有研究报道水生和陆生植物对藻生长的抑制或促进作用与其浓度有关[9, 13, 15, 29].本文发现浸泡液低浓度时(0.5~1.0 g ·L-1)，鱼害微囊藻和非产毒铜绿微囊藻的生长被促进了，但是当浸泡液浓度提高(2.0~10.0 g ·L-1)后，水稻秸秆抑制了两种藻的生长(图 3).稻秆对藻生长的促进作用可能是由于稻秆释放的一些未知的有机态营养成分或化合物[15]，抑制作用可能是水稻秸秆释放了一些化感组分，目前酚类化合物一直被认为是稻秆释放的具有化感作用或植物性毒素的化合物[19].除此之外，很多生物材料(大麦秆、芦苇、玉竹、水稻秸秆、橡树、稻壳)在大量室内和野外实验中被报告具有特异性抑制多种淡水藻尤其是蓝藻和绿藻生长的作用，可以克服控藻不具选择性的缺点[9, 13, 15, 19, 30, 31].虽然很多前人关于植物化感作用控藻生长的报告与本文吻合[11, 15, 21, 22, 32]，但是本文考虑到自然水体多种藻类同时存在的客观情况，较为系统地研究了RSE对多种野外常见藻类生长的影响作用，可以为水稻秸秆的野外应用提供理论依据.
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表 1 水稻秸秆对7种淡水藻生长和叶绿素荧光强度的影响1)(以干重计)/g ·L-1 Table 1 Effect of RSE on the growth and in vivo chlorophyll-a fluorescence of selected freshwater algae(DW)/g ·L-1 |
3.2 群体形成可能是绿藻对RSE不敏感的重要原因之一
本文通过对7种淡水藻细胞形态和生理指标的分析，进一步探讨了RSE选择性抑制蓝藻和绿藻的机制. 图 3(a)和4(a)显示，蛋白核小球藻和斜生栅藻的细胞生长被促进时，细胞变大.通过统计镜检结果，本文认为细胞的变大与群体形成分不开(图 6)，群体形成是藻细胞对抗不利生物因素和非生物因素的一种策略，例如捕食，温度或盐度变化等[22].浸泡液高浓度时(4.0~8.0 g ·L-1)，蛋白核小球藻和斜生栅藻群体的平均细胞个数分别多于2个和10个，而对照组的细胞个数分别为1.2和4.3(图 6). Men等[32]报告由芦苇提取的甲基乙酰乙酸乙酯(ethyl 2-methylacetoacetate)加入斜生栅藻后，细胞个数为2~8个的群体增加了. Park等[22]同样报告稻壳甲醇提取物使得四尾栅藻(Scenedesmus quadricauda)群体增加，而对铜绿微囊藻群体形成没有明显作用. 图 6中蛋白核小球藻群体的形成可能是由于水稻秸秆释放的某些化学物质诱发的，类似于浮游动物的捕食作用对其群体形成的诱发[33, 34].由此看来，群体形成可能是绿藻蛋白核小球藻和斜生栅藻对RSE不敏感的一个重要原因.尽管RSE对蓝藻细胞大小既有使其增大也有使其减小的作用，但是实验过程中并没有观察到明显的群体形成.与对照组相比，水华鱼腥藻和鱼害微囊藻变小，并随着浸泡液浓度增大变得更小[图 4(c)].当面临逆境时，例如黑暗，有报道铜绿微囊藻会通过消耗本身储存的资源，使得细胞变小[35]，化感物质使得细胞变小也已被透射电镜结果证实过[36].观察非产毒铜绿微囊藻细胞大小变化发现，其大小在浸泡液低浓度时[图 4(c)]变小，在高浓度时候细胞变大，说明暴露于浸泡液引起了藻细胞的自我调整[10].细胞增大在产毒铜绿微囊藻的处理组同样可观察到，这也可能是由于细胞渗透性改变引起的[37].还有可能的原因是细胞无法完成正常的分裂或者氧化自由基大量形成造成细胞调整细胞体积功能失效，就像在衣滴虫(Chlamydomonas eugametos)中发现的一样[38].
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不同的字母表示两者存在显著差异, P < 0.05 图 6 水稻浸泡液处理7 d后蛋白核小球藻(C. pyrenoidosa)和斜生栅藻(S. obliqnus)形成的群体细胞平均个数 Fig. 6 Mean number of cells per colony of C. pyrenoidosa and S. obliqnus populations grown for 7d in the presence of RSE at different concentrations |
群体形成被认为是一个细胞再生而非细胞聚集的过程，所以这一过程中细胞生长和光合作用都是活跃的[28].叶绿素荧光强度是一个灵敏表征光合作用状态，生理状态或细胞色素浓度大小的指标[39].蛋白核小球藻叶绿荧光强度的增加可能是光合作用增强的标志，但是相对的，斜生栅藻在浸泡液低于8.0 g ·L-1时，荧光强度有少量增加，高浓度[8.0~10.0 g ·L-1，图 4(b)]时荧光强度反而显著下降.可能的解释是荧光强度可能被群体形成的遮挡作用被低估，这一现象需要进一步的研究(图 6).对羊角月牙藻来讲，较长的平稳期和生命周期是它比其它2种绿藻对浸泡液更敏感的原因[32]，因此导致月牙藻在浸泡液低浓度时细胞生长被抑制，叶绿素荧光强度下降[图 3(a)和图 4(b)].浸泡液浓度高于4.0 g ·L-1时，月牙藻生理和形态受RSE影响不大，这也许是它生长被促进程度低于蛋白核小球藻和斜生栅藻的一个原因.
不同于绿藻，蓝藻在生长被抑制时，对RSE的生理响应方式比较一致[图 3(b)和图 4(d)]，都表现出叶绿素荧光强度下降，光合作用被抑制.大部分叶绿素荧光强度是在光合系统Ⅱ反应中心处于QA态下测定的[40]，光合强度的下降说明是因为电子传递的供体被阻碍，很多报告说明光合作用被抑制是化感作用抑藻的机制之一[10, 41].对比4种蓝藻生长和叶绿素荧光强度对浸泡液的敏感性可以发现，除了鱼害微囊藻，其它3种蓝藻叶绿素荧光度比生长更敏感(表 1)，这可能是由于浸泡液低浓度时鱼害微囊藻的叶绿素荧光强度被增强，造成EC50变大.
4 结论(1) 水稻秸秆对4种蓝藻(有毒和无毒铜绿微囊藻、有毒水华鱼腥藻、鱼害微囊藻)和3种常见绿藻(羊角月牙藻、蛋白核小球藻和斜生栅藻)生长的抑制作用具有选择性，不同淡水藻对水稻秸秆敏感性不同，敏感性大小为：产毒蓝藻>非产毒蓝藻>绿藻.
(2) 水稻秸秆处理后，绿藻细胞变大，并观察到群体形成，蓝藻细胞大小也有变化，但是没有群体形成，推断群体的形成可能是绿藻生长对水稻秸秆不敏感的一个重要原因.
(3) 水稻秸秆引起蓝藻的叶绿素荧光强度下降，强烈抑制了4种蓝藻的光合作用，然而水稻秸秆对绿藻的光合作用的影响较小，光合系统Ⅱ反应中心的敏感性可能是蓝藻生长被强烈抑制的原因.
致谢: 在实验过程中得到了龚伊、阳振、卢亚萍、史小丽、刘凌光、吴松涛、段晓尘、钱梦雨、赵旭辉等人的帮助，并且在论文的书写和修改中得到了姜广甲同学的帮助，在此一并感谢！| [1] | Grover J P, Baker J W, Ureña-Boeck F, et al. Laboratory tests of ammonium and barley straw extract as agents to suppress abundance of the harmful alga Prymnesium parvum and its toxicity to fish[J]. Water Research, 2007, 41(12): 2503–2512. DOI: 10.1016/j.watres.2007.03.025 |
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