水提取态有机氮(WEON)目前被定义为沉积物中能够被水或盐溶液提取出来的有机态氮^[1].溶解性有机氮是溶解性有机质(DOM)含氮的部分^[2]，其结构组分非常复杂，且大部分结构组分如蛋白质、腐殖质等存在形式及作用机理亟待解决^[3].有研究表明10%~80%的溶解性有机氮可被生物利用^{[4, 5]}，溶解性有机氮生物有效性的差异一定程度上取决于其结构组分.许多光谱测定手段已成为表征水溶性有机氮的结构和反应性的有效方法^[6].有研究表明，紫外-可见吸收光谱技术能反映有机组分的芳香性和分子量等信息并评估结构的稳定性，三维荧光光谱能够很好地表征DON荧光组分，并识别其物质来源^[7].沉积物WEON受各因素的影响，而不同来源对沉积物WEON有直接或间接的影响.研究沉积物WEON含量组分特征及与其他来源溶解性有机氮结构的差异性，综合分析各来源结构组分特征，有助于分析和评估溶解性有机氮对湖泊生态功能及水质的影响.

洱海是云贵高原第二大淡水湖泊，流域内人口密度大，在地区社会经济中起着重要作用.洱海水质总体较好，维持在地表水国标Ⅱ~Ⅲ级(GB 3838-2002)，但富营养化进程加剧，逐渐由中营养型湖泊向富营养型湖泊过渡^[8].研究表明，洱海沉积物DON内源释放对湖泊氮代谢有重要影响^[9]，且洱海沉积物WEON生物可利用性非常高^[6].洱海2006和2013年都发生了较大规模的藻类水华^[10]，对洱海有不同程度的影响.

本研究试图研究洱海沉积物WEON与其他来源溶解性有机氮含量分布规律，并利用紫外-可见光谱和三维荧光光谱手段结合平行因子分析法^[11]进行表征其结构组分特征的差异性，以期为洱海底泥阻控防治规划提供技术服务和理论支持，并为湖泊富营养化潜在威胁的预测提供依据.

洱海是云南省第二大高原淡水湖泊，位于大理白族自治洲境内，其流域面积为2 565 km²(地处99°32′~100°27′E，25°25′~26°16′N)，湖泊面积为249 km²，湖周长为128 km，最大水深为21.3 m(平均10.6 m).湖水主要来源于入湖河流，降雨和融雪.洱海沉积物质地分布差异性明显，洱海北部和南部水深较浅，有少量的植被分布，中部湖区水深较大，基本无水生植物生长, 北部入湖河流流经洱海主要的畜牧农田区.洱海沉积物表层主要以含粉砂质泥、粉砂和泥质为主，其分布受水下地形的影响和制约，近岸浅水过渡区以粉砂和粉、砂质泥为主，湖心区以泥(包括黏土矿物)为主^[12].

本研究在洱海选取洱海北中南四季的代表性点位分别于2009年7月、2009年10月、2010年1月、4月这4个季节采集沉积物样品，沉积物样品在2014年9月提取测定，用于分析洱海沉积物WEON随时间的变化规律；利用彼得森采泥器^[10]在洱海外源输入较少同时酶活性较低的春季，采集47个表层样(0~10 cm)，立即放入密封袋中，4℃下保存带回实验室，经冷冻干燥后研磨过100目筛，密封保存，用于分析洱海沉积物WEON空间分布特征.于2010年10月采集上覆水、间隙水、入湖河流和湿沉降样品，主要入湖河流为弥苴河、永安江波罗河、白石溪、中和溪和清碧溪.采用自制开放式采雨器，收集雨水样品.具体采样点位信息见图 1.

图 1

Fig. 1

图 1 洱海采样点位分布示意 Fig. 1 Distribution of sampling sites in Erhai Lake

采用稀盐溶液提取沉积物WEON，按V(水):m(土)为10:1的比例加入0.02 mol·L^-1的KCl溶液，于25℃、200 r·min^-1下振荡1 h后，5 000 r·min^-1离心10 min，过GF/F 0.45 μm滤膜(提前在马弗炉中450℃下烘3 h).洱海沉积物有机质的含量采用重铬酸钾外加热法测定；DON采用差减法进行测定，即：

ω(NH₄⁺-N)使用纳氏试剂分光光度法(HJ 535-2009)；ω(NO₃^--N)采用酚二磺酸分光光度法(GB 7480-87) 测定；ω(NO₂^--N)采用分光光度法(GB 7493-87) 测定；ω(DOC)采用TOC测定仪测定(High DOCⅡ，Elemental，德国).

紫外可见光谱采用分光光度计测定(哈希, 美国)进行扫描，荧光光谱采用日立F-7000荧光光谱分析仪(日立, 日本)进行扫描，并结合平行因子算法分析.平行因子算法(PARAFAC)能够将多个叠加的荧光峰区分开来，用裂半分析和残差分析检验模型确定最优组分数^[13].所用数据处理及统计分析软件包括Origin 8.0、Microsoft Excel 2010、SPASS 10.0和MATLAB2015.

沉积物释放是湖泊上覆水DON的一个主要来源，其DON可释放量很大程度受季节影响(图 2).洱海表层沉积物WEON含量季节性变化表现为：夏季＞春季＞秋季＞冬季(图 2，中部区域春季与秋季变化差异不明显).夏季洱海表层沉积物溶解性有机氮[(39.07±9.71) mg·kg^-1]明显高于其他季节，春季均值[(27.70±12.91) mg·kg^-1]与秋冬两季相差不大，春季沉积物WEON含量在空间上变化较大.冬季洱海表层沉积物WEON含量[(18.85±4.80) mg·kg^-1]最低，并且区域之间差别不大，表明季节变化对表层沉积物WEON的影响较为明显，这主要与外源输入和环境因素的影响有较大关系，如温度、水量、生物量等^[14].

图 2

Fig. 2

图 2 洱海沉积物WEON含量季节性变化特征 Fig. 2 Seasonal variation of WEON characteristics of sediments from Lake Erhai

为了便于分析，根据洱海地形将洱海分为3个湖区，即北部、中部、南部.各个湖区之间呈现相似季节性变化规律，北部与南部沉积物WEON分布规律呈现：夏季＞春季＞秋季＞冬季，中部与南北部湖区略有差异，表现为沉积物WEON含量在秋季高于春季，DOC与沉积物WEON含量变化规律差异较大，北部湖区DOC含量与沉积物WEON含量变化规律一致，而南部与中部呈现春季＞夏季＞秋季＞冬季规律.由于洱海春季和冬季降雨较少且外源污染较少，更能反映湖泊本身特性，而冬季沉积物微生物活性较低，因此本次研究选择春季样品，进一步揭示洱海沉积物WEON含量组分特征.

为研究洱海沉积物空间分布特征, 选取不同湖区47个代表点位进行分析.洱海表层沉积物WEON含量在14.22~119.33 mg·kg^-1之间，平均值为[(63.69±25.05) mg·kg^-1]，其中北部湖区沉积物WEON含量平均83.43 mg·kg^-1，中部湖区平均54.40 mg·kg^-1，南部湖区平均57.66 mg·kg^-1(图 3).北部东岸红山湾地区及中部海潮河区域，沉积物WEON含量明显高于洞庭湖，巢湖和鄱阳湖^[15]，表明洱海沉积物WEON含量较高，有一定的释放风险.各形态氮占比对沉积物WEON也有较大影响，为了进一步分析WEON含量在洱海表层沉积物中的分布规律，比较溶解性有机氮在DTN中的占比特征.北部湖区WEON的平均含量为78±17 mg·kg^-1，占DTN的比例为31%±6%；中部湖区WEON平均含量为[(64±15) mg·kg^-1]，占DTN的比例为25%±7%；南部湖区平均含量为[(54±13) mg·kg^-1]，占DTN的比例为22%±7%，高于河口和近海的WEON占比^[16].这表明洱海沉积物WEON/DTN相对较高，且由北至南依次降低，这与洱海沉积物WEON的含量和水流方向基本一致，表明洱海沉积物WEON含量一定程度上受洱海流向的影响，且WEON所占DTN比例越大，沉积物WEON含量越高.

图 3

Fig. 3

图 3 洱海沉积物WEON表层样分布变化 Fig. 3 Spatial distribution of surface sediment WEON in Erhai

有研究发现，SUVA₂₅₄值是单位浓度在254 nm波长处紫外吸收值，SUVA₂₅₄反映DON的芳香性，该值越高，芳香性越强^[17]. E₃/E₄值是有机物在吸收波长为300 nm和400 nm处紫外吸收值的比值，研究发现E₃/E₄ < 3.5时湖泊水溶性有机物以腐殖酸为主，当其>3.5时则以富里酸为主^[18].紫外光谱指数S_R能够间接指示DON的分子量大小，且S_R与DON分子量呈现负相关，即S_R值越大，表明DON分子量越小^[19].洱海沉积物WEON的S_R值在1.21~2.00之间，平均值为1.64，呈现中部>北部>南部的趋势，说明洱海沉积物WEON分子量中部最小，南部最大，这是由于中部湖区水深较大，溶解氧较低，且受外源影响较小，，沉积物受自然代谢影响较大，更易矿化释放小分子WEON，而南部湖区大量水生植物在20世纪初期凋亡和沉降^[20]，其腐败残体可能与沉积物WEON分子量增加有关.洱海沉积物SUVA₂₅₄指数和E₃/E₄值分别为0.89~1.34和3.09~4.35，沉积物WEON的SUVA₂₅₄值远高于山口湖(0.24~0.37)^[21]，表明洱海沉积物WEON腐殖化程度高^[22]，且含有腐殖酸，主要以富里酸为主，SUVA₂₅₄指数和E₃/E₄的值在北部区域比中部和南部区域高，表明洱海北部湖区WEON芳香性较高，且以富里酸为主，这是因为洱海主要入湖河流在北部湖区，且受农业和农村面源污染影响，造成一定程度的含氮新鲜有机质输入，而沉积物越“新鲜”, 其芳香性越高^[17].

荧光指数FI(E_x=370 nm, E_m=450 nm/E_m=500 nm)能表征DON的来源^[23]，陆源和生物来源两个端源的FI值分别是1.4和1.9，荧光指数FI≤1.4时类富里酸荧光物质主要是由陆源输入引起，而当FI≥1.9时主要来源于生物活动^[22].自生源指数(BIX)大于1时, 间接表明DON主要来自内源代谢, 而介于0.6~0.7时, 表明主要为陆源输入, 即受入湖河流水质和人为活动等因素影响较大^[24].腐殖化指数HIX为激发波长为254 nm处，发射波长在435~480 nm与300~345 nm波长范围内荧光强度平均值的比值，可用于反映DON样品腐殖化程度^[25].当HIX小于4时，表明荧光物质主要来源于内源微生物活动或细菌产生^[24].洱海沉积物WEON的FI指数在1.65~1.68之间，该指数在各湖区间差异较小，其中北部平均1.65，中部湖区平均1.68，南部湖区平均1.66，表明洱海沉积物WEON受陆源和微生物源的共同作用.沉积物WEON的自生源指数BIX在0.6~1.1之间，各湖区存在一定差异，北部湖区平均0.90，中部湖区该值平均1.00，南部湖区平均0.95，表明洱海沉积物WEON同时受外源和内源的影响，这与上述FI指数反应一致. HIX在2.00~2.33之间，远高于舟山渔场(0.4~1.2)^[26]，其中南部湖区(2.33)＞北部(2.02)≥中部湖区(2.00)，表明洱海沉积物WEON腐殖化程度相对较高，且受微生物影响较大，控制洱海水质状况，应该更多考虑微生物活动相关的因素.

洱海沉积物WEON含量及组分结构受各种环境因素和来源的影响，而洱海间隙水，上覆水，湿沉降和入湖河流为其主要的影响因素.本研究结果表明，各来源DON含量分别为间隙水DON含量0.20~1.71 mg·L^-1(平均0.77 mg·L^-1)；入湖河流DON含量0.21~0.41 mg·L^-1(平均0.26 mg·L^-1)；湿沉降DON含量0.02~0.47 mg·L^-1(平均0.26 mg·L^-1)；上覆水DON含量0.05~0.25 mg·L^-1(平均0.11 mg·L^-1)，沉积物间隙水DON含量远高于其他来源，而间隙水能直接与沉积物相互交换，沉积物WEON为各来源DON在洱海的“源”和“汇”，高浓度的沉积物WEON通过间隙水向上覆水释放，其对洱海水环境有潜在风险.不同时期采集的湿沉降样品DON含量变化较大，这与降雨量及空气污染物浓度等环境因素有较大关系，湿沉降在洱海DON输入的同时，增加了地表径流量，致使农田农药化肥残留被冲刷，流入洱海水体，使得湿沉降对洱海的影响程度加大^[27].洱海间隙水和入湖河流DON均以中部区域浓度最高，南部和北部相对较低.北部入湖河流流速较高，水体交换快，含氧量较高^[28]，一方面促进湖区上覆水氮代谢，促进DON的生成；另一方面，由于洱海水体大体流向为由北向南，部分污染物最先沉积于北部湖区，使得北部沉积物WEON含量最高.中部入湖河流流经主要城镇区域，城市生活污水和工业废水大量排入，造成入湖河流DON浓度较高(0.319 mg·L^-1)，在湖泊内环流等作用下，较多的氮素富集于该区域的上覆水中，但中部湖区水体较深，氧含量较少，DON分解速率较慢，致使其间隙水氮富集浓度较高^[29]，进一步向沉积物WEON转化.同时由于中部湖区水量多，环境容量较大，结果呈现为中部湖区上覆水DON浓度最低.金赞芳^[30]等研究表明湖泊各形态的氮既向沉积物沉积, 又从沉积物释放，且温度和溶解氧等环境条件是影响沉积物-水界面氮迁移转化的主要因素.各来源DON含量受各因素的影响，不同点位不同时间含量差异较大，这与洱海地理环境特征有关.入湖河流DON高于上覆水DON含量，同时沉积物间隙水DON含量远高于上覆水，入湖河流和沉积物WEON由于浓度梯度均向上覆水转移.

各来源水样DON的SUVA₂₅₄和S_R平均值依次为入湖河流>上覆水>间隙水>湿沉降，入湖河流DON的芳香化程度和分子量远高于其他3个来源及上覆水，表明洱海上覆水DON的芳香性由各个来源因素的共同作用，入湖河流是一个重要因素，但间隙水和湿沉降也是不可忽略的两个因素.洱海不同来源DON的E₃/E₄平均值均大于3.5，反映洱海不同来源水体DON以富里酸为主，上覆水DON所含富里酸组分最高，其次为湿沉降和入湖河流，间隙水DON中富里酸最少，而富里酸为难降解组分^[31]，表明洱海上覆水DON中易降解组分较少，生物有效性较低，有助于维持洱海水质.

间隙水DON的FI指数平均值约1.83，上覆水和入湖河流的平均值分别为1.64和1.66，均在1.4和1.9之间，表明其DON受陆源输入和生物活动共同作用^[22]，三者均高于富营养化的宝应湖^[32]上覆水DON(平均值1.24)，说明其DON受微生物影响较大.不同来源的水体及其上覆水体DON受微生物和外源输入共同作用，可能是流域内植被覆盖较高，人类活动频繁，植被残体腐殖降解和人类生产生活产生大量富里酸，通过径流进入入湖河流和上覆水，并在沉积物中富集.此外，入湖河流DON样品的HIX指数较上覆水和间隙水的高，三者远高于洨河(平均值0.61) 和乌梁素海^[33]间隙水(平均值0.73)，进一步反映洱海主要来源(入湖河流和间隙水)DON的腐殖化程度较高，而湿沉降DON腐殖化程度较低(平均HIX为0.90)，这与紫外光谱的结果相一致.

三维荧光光谱手段能检测出荧光特征峰，表征DON的组分特征.洱海主要的荧光特征峰主要有A、B、C和D峰(图 4)，其中类富里酸峰A位于激发波长/发射波长[E_x/E_m=(315~325) nm/(415~440) nm]，木质素和其它植物残体为其主要的来源；峰C [E_x/E_m=(310~360) nm/(370~450) nm]为类腐殖酸物质，与类腐殖酸物质有关；峰B位于E_x/E_m=225/310 nm，峰D位于E_x/E_m=275/310 nm，两者均为类蛋白物质，来源于芳香性荧光蛋白和蛋白质的相关组分^[34].三维荧光光谱扫描本研究沉积物样品，结果表明沉积物WEON荧光光谱主要含有两类荧光峰，即荧光峰A和B，其中峰A代表紫外区类腐殖质荧光峰和峰D代表高激发类色氨酸荧光峰^[35].洱海不同来源DON样品主要检测出4种荧光峰(荧光峰A、B、C和D)，其荧光峰强度在洱海样品除湿沉降样品外，其它来源样品中均检测出峰A，峰强度呈间隙水>上覆水≈入湖河流趋势，峰C只出现在洱海北部上覆水样品和清碧溪样品中，说明类富里酸荧光物质对洱海DON的贡献较大，其中，间隙水和入湖河流可能是上覆水类富里酸DON的重要来源.此外，多数样品特别是入湖河流和湿沉降样品(除弥苴河外)均检测出峰D，间隙水峰强度最高，上覆水的最低，说明洱海生物活动较频繁，沉积物对洱海不同来源DON影响较大.

图 4

Fig. 4

图 4 洱海溶解性有机氮典型荧光图谱(北中南) Fig. 4 Typical fluorescence peaks of DON in Erhai Lake

传统的“寻峰法”对多个荧光峰叠加可能造成识别不准确的情况，PARAFAC模型能够很好地将多个荧光峰分开，PARAFAC分析结果表明，洱海沉积物及不同来源DON含有2个组分(图 5)，C1在激发波长为275 nm和发射波长为425 nm存在一个荧光峰，该峰为内源性可见紫外区腐殖质峰^[36]，表明生物降解形成的荧光峰；C2在发射波长为330 nm，激发波长分别为225 nm和280 nm处存在两个荧光峰，该峰为类色氨酸峰，表明主要蛋白物质中含有游离或固定态氨基酸，蛋白质或多肽较难降解^[37].

图 5

Fig. 5

图 5 PARAFAC模型鉴别出洱海不同来源DON的2个荧光组分及其激发发射波长位置 Fig. 5 Fluorescence spectra and excitation/emission profiles of two components from PARAFAC model

从荧光结构组分来讲，由PARAFAC对各样品的荧光光谱分离解析，得出沉积物及各水体DON主要含有两个荧光峰C1和C2，C1和C2均为沉积物WEON荧光强度最大，表明沉积物WEON含有主要的荧光组分；除湿沉降样品外其他样品均为C1组分占总组分的绝对优势，表明其生物可利用性较低，洱海水体富营养化风险较小，但其各较难降解的组分在湖内可能沉降富集于沉积物中；而湿沉降样品C1组分中荧光峰强非常低，其中类蛋白组分占比C2/C1在所有样品中值最高(1.03~1.17)，表明其生物可利用性相对较高，可能对洱海水体造成较大影响，同时对沉积物WEON的影响最小.在各来源中，入湖河流DON组分的C2/C1比值最小，表明其生物可利用性最低，更易在洱海沉积物中富集，对沉积物WEON影响相对较大.

为揭示洱海沉积物WEON含量与其光谱学特征参数及各指标间关系，分析了洱海不同来源DON含量与光谱参数等指标相关关系(见表 1).研究结果表明，间隙水和上覆水与沉积物WEON具有较好的相关性，沉积物和间隙水呈现显著负相关(r=-0.634, P < 0.05)，沉积物WEON含量和间隙水DON荧光组分C1、C2组分也存在较好的相关性(分别为r=-0.96，P < 0.01；r=-0.635, P < 0.05)，表明沉积物和间隙水DON具有同源性，间隙水DON和沉积物WEON相互转化，即沉积物向间隙水释放DON，沉积物WEON会减少，同时间隙水DON汇入沉积物时，间隙水DON也会减少.此外，沉积物WEON含量和间隙水DON荧光组分C1、C2和上覆水荧光组分C1、C2存在不同程度的相关性.通过相关性分析发现，入湖河流DON与各参数无明显相关性，表明入湖河流DON并非直接影响洱海各湖区沉积物WEON含量.其中沉积物WEON含量与上覆水DON荧光C1、C2组分均呈现极显著相关(r=-0.79, P < 0.01；r=-0.944, P < 0.01)，表明上覆水DON的荧光组分特征能够很好指示沉积物WEON含量特征，即上覆水中DON荧光组分C1和C2越大，沉积物WEON含量越低，说明洱海上覆水DON有一部分为沉积物释放，沉积物WEON对湖泊水体有一定的贡献和影响.

表 1 (Table 1)

表 1 不同来源DON含量与各荧光组分相关性分析1) Table 1 Correlation between the DON content of different sources with the components of DON spectral parameter in Erhai

表 1 不同来源DON含量与各荧光组分相关性分析1) Table 1 Correlation between the DON content of different sources with the components of DON spectral parameter in Erhai

(1) 洱海沉积物WEON含量随季节性变化趋势为夏季＞春季＞秋季＞冬季，空间分布规律为北部＞中部＞南部.洱海沉积物WEON腐殖化程度高，主要以富里酸为主，含有A峰和B峰两类荧光峰；其分子量分布为中部最小，南部最大；受内源和外源共同影响，且受微生物影响较大.

(2) 洱海不同来源DON腐殖化程度规律为入湖河流>上覆水>间隙水>湿沉降；湿沉降生物可利用性较高，如降雨集中可能对洱海水体造成较大影响；入湖河流DON生物可利用性最低，易在沉积物中富集. PARAFAC分析结果表明，洱海沉积物WEON及各来源DON含有2个荧光组分，组分1为内源性可见紫外区腐殖质峰，表明生物降解形成的荧光峰；组分C2为类色氨酸峰.

(3) 洱海上覆水DON的结构组分和沉积物WEON含量显著相关，上覆水DON荧光组分能够很好指示沉积物WEON含量，即上覆水中DON荧光组分C1和C2越大，沉积物WEON含量越低，说明洱海上覆水DON部分为沉积物释放，且沉积物WEON对湖泊水体有一定的贡献.