2017, Vol. 38
2. 中国科学院环江喀斯特生态系统观测站, 环江 547100;
3. 中国科学院大学, 北京 100049
2. Huanjiang Observation and Research Station for Karst Ecosystems, Chinese Academy of Sciences, Huanjiang 547100, China;
3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
土壤胞外酶参与了土壤有机质的分解, 释放出植物与微生物所需的能量与矿质营养[1], 是土壤有机质分解的限速步骤, 因此土壤胞外酶在生态系统物质循环和能量流动中扮演着重要的角色[2].在某种程度上, 土壤胞外酶活性也能表征土壤养分转化和运移能力的强弱, 是评价土壤肥力的重要参数之一[3].目前研究较多的土壤胞外酶包括：降解纤维素的β-葡糖苷酶(β-glucosidase, BG)和纤维素酶(cellobiohyrolase, CBH); 降解几丁质和肽聚糖的β-1, 4-N-乙酰葡糖氨糖苷酶(β-1, 4-N-acetylglucosaminidase, NAG); 水解蛋白质和多肽的亮氨酸氨基肽酶(leucine aminopeptidase, LAP); 矿化有机磷的酸性(或碱性)磷酸酶(acid or alkaline phosphatase, ACP or ALP)[4].在生态学研究中, 这些胞外酶的活性与碳、氮、磷元素的循环密切相关.因此, 对这些土壤胞外酶活性的研究有助于理解土壤养分循环特征及机制.
土壤酶活性受许多因素影响, 包括土壤理化性质、土地利用类型和地形(坡位和坡向)等[5, 6].这些因素可分为两大类：一类是直接影响土壤酶活性的因子, 包括土壤湿度、温度、pH和有机质等; 另一类是间接影响土壤酶活性的因子, 包括气候、地形、树种和土地利用类型等[7].第一类因子通过提供了酶促反应的底物和环境, 直接影响着酶活性大小[8]; 第二类因子, 如地形因子通过影响微气候、径流和蒸发蒸腾等途径改变了土壤属性, 从而间接影响土壤酶活性[9]; 再如树种因子会通过改变凋落物数量与质量以及根系分泌液影响土壤有机质底物的可利用性, 进而影响土壤酶活性[10].目前已有大量研究报道了这些因素对土壤酶活性的影响[11, 12], 然而大部分是针对单个影响因素的研究, 关于土壤属性、树种和地形对土壤酶活性的综合影响及交互作用的研究较少.
喀斯特是地表生态系统的重要组成部分, 中国西南喀斯特区是世界最大、最集中连片的喀斯特区.喀斯特区独特的土壤条件(如：高pH、高钙与高缓冲能力、特殊水文条件、地形特征复杂等)决定了其土壤理化性质及植物群落类型等都有别于其他地区.目前, 关于喀斯特地区中性偏碱性的土壤中土壤酶活性变化的研究还较少[13], 影响土壤酶活性的主控因子依然还不清楚, 并缺乏对主控因子影响能力的量化.因而, 在喀斯特山区开展土壤酶活性特征研究, 一方面可获取区域代表性数据, 另一方面可揭示喀斯特山区土壤肥力的供应和保持特征, 以期为喀斯特生态恢复实践提供理论支撑.
1 材料与方法 1.1 研究区概况研究区位于广西环江木论国家自然保护区(25°06′~25°12′ N, 107°53′~108°05′ E), 属典型喀斯特峰丛洼地景观以及亚热带季风气候区.保护区森林面积9 991 hm2, 森林覆盖率93.4%, 生长着中亚热带隐域性的喀斯特森林顶级植被群落.林区主要优势种为厚壳桂和伞花木.海拔最低为405 m, 最高为823 m.年平均气温为19.6~21.6℃, 最低温出现在1月, 约为3.4~8.7℃, 最高温出现在7月, 约为23.0~26.7℃.年均降雨量为1 530~1 820 mm.全年干湿季明显, 其中4月到8月属于湿季, 9月到次年3月属于旱季.林区基岩主要为石灰岩和白云岩.土壤主要为石灰土.坡上土壤深度约为0~30 cm, 洼地土壤深度约为0~80 cm.
1.2 实验设计样地建立在保护区缓冲区的常绿落阔叶混交林内.选取南北朝向的两个坡(坡度20°~25°)及两个坡中间的洼地(坡度2°~4°)作为研究样地(图 1).分别在每个坡向的上、中、下坡和两个坡中间的洼地各设置1个面积为20 m×20 m的大样方, 共7个大样方.样方之间距离>10 m.每个样方内设置3个小样方.每个小样方内选取代表性的优势树种, 即厚壳桂和伞花木作为研究对象.所选择的厚壳桂平均胸径、树高和树龄分别为8.8 cm、9.5 m和20年; 伞花木平均胸径、树高和树龄分别为9.3 cm、7.2 m和20年.在2014年8月, 每个样方内选择厚壳桂和伞花木各5株, 在每株树下1 m范围内采集1个0~15 cm表层土样, 将采集的5个土样混成一个混合土样.共采集42个混合土壤样品.新鲜土样放于冰盒中带回实验室, 先用镊子挑去根和石块, 过2 mm筛后分两部分保存.一部分保存在4℃冰箱内供土壤酶活性和无机氮分析, 另一部分经自然风干后用于土壤理化性质分析.
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图 1 样方分布示意 Fig. 1 Schematic of sampling plot distribution |
土壤pH采用pH计测定(土水比为1:2.5)[14]; 土壤有机碳(SOC)采用重铬酸钾氧化-外加热法(油浴)测定[14]; 速效磷(AP)采用0.5 mol·L-1 NaHCO3浸提、钼锑抗比色法测定; 全氮(TN)采用半微量开氏法-流动注射仪(Fiastar 5000) 测定[14]; 铵态氮(NH4+-N)和硝态氮(NO3--N)采用0.5 mol·L-1 K2SO4浸提, 再用流动注射仪(Fiastar 5000) 测定.
1.4 土壤酶活性的测定6种土壤酶活性的测定均采用96微孔酶标板荧光分析法进行测定[15, 16].所测土壤水解酶及其所用底物见表 1.具体步骤为：称取1 g鲜土至800 mL的广口烧杯中, 碱性磷酸酶加入125 mL NaHCO3缓冲液(pH=8), 其他酶加入125 mL CH3COONa缓冲液(pH=5), 涡旋荡1 min, 制成土壤悬浮液, 并使用八通道移液器(Eppendorf)向96孔酶标板中加样.空白孔中加入250 μL缓冲液; 土壤控制孔中加入50 μL缓冲液和200 μL土壤悬浮液; 基底控制孔中加入50 μL底物溶液和200 μL缓冲液; 参考标准孔加入50 μL标准液和200 μL缓冲液; 猝灭标准孔中加入50 μL标准液和200 μL悬浮液; 样品测定孔则加入200 μL土壤悬浮液和50 μL底物溶液.各控制孔和样品测定孔均设置8个重复.所有酶标板放置在黑暗的25℃培养箱中培养4 h后, 使用多功能酶标仪(瑞士Tecan Infinite F200/M200型多功能酶标仪)进行荧光测定.仪器设定自动在每个孔加入10 μL, 1 mol·L-1的NaOH溶液, 1 min后进行荧光检测.酶标仪设定在365 nm波长处激发, 在450 nm处检测荧光.酶活性计算公式如下：
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表 1 所测土壤酶的国际分类编号、缩写以及所用底物1) Table 1 Soil enzymes assayed for potential activity along with their enzyme commission number (EC), abbreviation and substrate |
酶活性[μmol·(h·g)-1]=(净荧光值/单位标准物的荧光值)/(土壤干重×培养时间)
其中, 单位标准物的荧光值=[参考标准物荧光值/(10 μmol·L-1×0.000 05 L)]; 净荧光值=[(样品测定荧光值-土壤控制荧光值)/猝灭系数]-基底控制孔荧光值; 猝灭系数=(猝灭标准荧光值-土壤控制荧光值)/准物荧光值.
1.5 数据分析采用单因素方差分析比较树种之间(厚壳桂和伞花木)、坡位之间(上坡、中坡、下坡和洼地)以及不同坡向(南向和北向)之间土壤理化性质和土壤酶活性的差异.采用最小显著差数法(LSD)进行多重比较.
将所有的酶当作一个整体, 采用多响应置换过程(MRPP)比较树种、坡位以及不同坡向之间土壤酶活性的差异. MRPP是一种用于两组或者多组多元数据矩阵差异性分析的非参数检验, 不要求数据的正态分布和方差齐性[17].其中, 数值T(test statistic)为描述组间差异程度的统计量, T的绝对值越大, 其组间差异越大. A(agreement statistic)值为描述组内数据一致性的统计量[18]. A值介于-1~1之间, 大于0.1代表组内差异高.
采用方差分解的方法分析各环境因子(即：地形因子、树种因子和土壤因子)对土壤酶活性变化的相对贡献率.其中地形因子包括坡位和坡向, 树种因子包括厚壳桂和伞花木, 土壤因子包括土壤有机碳、总氮、碳氮比、有效磷、pH、土壤含水量、氨氮、硝氮和无机氮.方差分解法是将响应变量的总方差无偏分解成由各组解释变量所决定的子方差, 即可给出每组变量的单独解释部分、共同解释部分以及总的解释量[19].相对贡献的结果采用韦恩图进行描述.
土壤因子和土壤酶活性之间的关系采用冗余分析的向前选择法和蒙特卡洛置换检验来分析检验土壤因子对土壤酶活性的影响是否显著, 得出影响土壤酶活性变异的主要土壤因子(P < 0.05).冗余分析是一种排序方法, 通过原始变量与典型变量之间的相关性, 分析引起原始变量变异的原因.其结果的显著性是由蒙特卡洛置换检验来确定的, 置换次数为499.蒙特卡洛置换检验是一种常用的置换检验方式.
采用t-value双区检验图描述单一土壤因子对酶活性的影响. t-value双区检验图中的箭头代表土壤酶活性指标; 三角形代表土壤指标; 从某个土壤指标到原点为直径构成的圆圈代表该土壤指标所能解释的范围.比如, 某个土壤酶活性指标的箭头完全落入某土壤指标构成的圆圈中, 代表该种该土壤酶活性与该土壤指标具有显著相关性.如果落入实线圈表示呈显著正相关, 落入虚线圈为显著负相关[20].以上分析通过PC-ORD和Canoco 5.0两个软件完成.其中, PC-ORD软件用于进行MRPP分析, Canoco 5.0用于方差分解分析和冗余分析.
2 结果与分析 2.1 研究区土壤酶活性及理化性质的差异性分析土壤β-葡糖苷酶、纤维素酶、亮氨酸氨基多肽酶、几丁质酶、酸性磷酸酶、碱性磷酸酶均值分别为173.8、21.7、16.0、34.5、308.9和394 nmol·(h·g-1).研究区土壤中性略偏碱性, pH平均值为7.3(表 2).区域内土壤有机碳、总氮、有效磷、无机氮的平均含量分别为77.4 g·kg-1、5.4 g·kg-1、6.5 mg·kg-1、262.1 mg·kg-1(表 2).多重比较结果表明, 树种间的土壤pH, β-葡糖苷酶和酸性磷酸酶差异显著.坡向间、有效磷、pH、铵态氮、β-葡糖苷酶、纤维素酶、亮氨酸氨基多肽酶和酸性磷酸酶的差异显著.坡位间、有机碳、总氮、有效磷、碳氮比、pH、硝态氮、无机氮、β-葡糖苷酶、纤维素酶、亮氨酸氨基多肽酶和酸性磷酸酶的差异显著(表 2).
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表 2 不同树种、坡向和坡位下的土壤基本理化性质1) Table 2 Physicochemical properties of soil under different tree species, slope aspect and slope positions |
2.2 树种、坡位和坡向对土壤酶活性的影响
通过MRPP比较了树种间、坡位间和坡向间土壤酶活性的差异, 其结果如表 3所示：总体上, 树种间和坡向间土壤酶活性差异不显著(P > 0.05);坡位间土壤酶活性差异显著(P < 0.05).其中上坡与中坡、上坡与下坡和上坡与洼地这3组的T值和A值都比较大, T值较大说明上坡与中坡、下坡和洼地的组间差异最为明显, A值较大则表明其组内的一致性较好.同时, P值也说明了上坡与中坡、下坡和洼地之间土壤酶活性差异极显著, 中坡和洼地之间土壤酶活性差异显著.
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表 3 树种、坡向和坡位之间土壤酶活性的多响应置换过程分析 Table 3 MRPP for soil enzyme activities under different tree species, slope aspect and slope position |
2.3 方差分解分析
通过方差分解的方法分析了地形、树种和土壤属性这3组解释变量对土壤酶活性的相对贡献, 结果如图 2所示：3组解释变量总共解释了土壤酶活性变异的55.3%.其中, 土壤属性解释了土壤酶活性变异的44.2%, 地形因子解释了土壤酶活性变异的30.7%, 而树种因子仅仅解释了土壤酶活性变异的4.4%. 3组变量存在交互作用, 其中地形和土壤共同解释的变异为22.4%;地形和树种土壤属性共同解释的变异为0.4%;树种和土壤属性共同解释的部分为1.2%;三者共同解释的部分为0.当剔除了两两间共同解释部分后, 土壤因子净解释了土壤酶活性变异的20.6%, 地形因子净解释了土壤酶活性变异的7.9%, 树种因子净解释了土壤酶活性变异的2.8%.
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图 2 土壤、地形和树种这3组解释变量的方差分解 Fig. 2 Variation partitioning for soil EEAs by soil factors, topographical factors and tree species factors |
通过冗余分析手动前置选择法和蒙特卡洛置换检验得出影响土壤酶活性的主要土壤属性指标为土壤pH(P=0.002)、总氮(P=0.002) 和无机氮(P=0.008).进一步采用t-value双序图确定土壤pH、总氮和无机氮对土壤酶活性的影响, 图中箭头完全落入实线圈内则表示两者正相关, 完全落入虚线圈内则表示两者负相关.如图 3所示：pH与酸性磷酸酶(ACP)、几丁质酶(NAG)和纤维素酶(CBH)显著负相关; 总氮与碱性磷酸酶(ALP)和几丁质酶(NAG)显著正相关, 而与酸性磷酸酶(ACP)和纤维素酶(CBH)显著负相关; 无机氮则与酸性磷酸酶(ACP)和纤维素酶(CBH)显著正相关.
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(a)表示pH的t值检验双区图，（b)表示TN(总氮）的t值双区检验图，（c)表示DIN(无机氮）的t值双区检验图; t-value双序图中的箭头代表土壤酶活性指标; 三角形代表土壤指标; 从某个土壤指标到原点为直径构成的圆圈代表该土壤指标所能解释的范围，比如，（b)中NAG的箭头完全落入TN表征的实线圆圈中，代表NAG与TN具有显著正相关关系，而ACP的箭头完全落入TN表征的虚线圆圈中，代表ACP与TN具有显著负相关关系 图 3 土壤因子对土壤酶活性影响的t值双区检验 Fig. 3 The t-value biplots showing the relationships between enzyme activities and soil properties |
研究发现树种对土壤酶活性没有显著影响, 这与目前关于树种对土壤酶活性影响的大量单因子研究的报道结果不同.一般地, 树种能通过凋落物分解或根分泌物调节根际土壤养分有效性而影响土壤酶活性[21].比如, Ushio等[22]调查了马来西亚婆罗洲地区山地森林生态系统树种对酸性磷酸酶、β-葡糖苷酶和多酚氧化酶的影响, 结果表明树种可通过影响土壤湿度、有机碳、总氮等土壤理化性质而影响土壤酶活性.导致本研究中树种对土壤酶活性无显著影响的原因可能有两个.其一, 喀斯特地区树种相对单一, 选用的厚壳桂和伞花木虽然是该区域内两种最为主要的树种, 但是其功能性状可能比较接近.其二则可能是由于植被与土壤属性存在功能上的重叠, 导致方差分解中分析时无法体现出树种的效应.
本研究还发现坡位对土壤酶活性影响显著, 但是坡向的影响则很小.地形可通过影响土壤属性或者改变局部气候(温度和降水)从而影响土壤酶活性.比如, Kang等[6]发现脲酶、脱氢酶、磷酸酶和硫酸酯酶这4种土壤酶的活性均在北坡高于南坡, 这可能是因为南坡上对酶活性有抑制作用的铁、铝离子浓度高而对酶活性有激发作用的镁、钾离子浓度低[23]. Khalili-Rad等[9]调查了坡位对土壤生物活性的影响, 结果表明下坡的微生物量和土壤酶活性显著高于上坡, 并指出这可能是因为下坡有机碳的富集为微生物提供了丰富的碳源.本研究中, 坡位间的酶活性差异与坡位间显著的土壤属性(包括土壤pH、总氮和无机氮等)差异相吻合(表 3), 这说明地形因子对土壤酶活性的影响大部分可通过土壤属性解释.这也解释了图 2所示的地形与土壤属性的强烈交互效应.同时值得注意的是, 地形本身也解释了7.9%的变异.这部分变异说明地形还可能通过诸如局部气候等非土壤属性的因子影响土壤酶活性.
3组研究变量中, 土壤性质对于解释土壤酶活性变异的贡献最大.这说明在局域尺度上, 土壤性质才是解释土壤酶活性空间变化的主导因素.如上所述, 地形和树种对土壤酶活性的影响主要是通过改变土壤属性进行间接作用.相比之下, 土壤属性才是最直接的作用因素.这可能是导致本研究结果的主要原因.
3.2 土壤理化性质中影响酶活性的关键因子虽然诸多学者对土壤因子与土壤酶活性的关系进行了广泛研究, 其中包括有机质、总氮、总磷、土壤pH、土壤湿度和碳氮比等, 但是不同研究得出的土壤酶活性的主控因子不同[5, 24~26].本研究发现测定的9个土壤理化指标中, 土壤pH、总氮和无机氮对土壤酶活性有显著影响.
土壤pH不仅是影响土壤微生物群落组成的主要因子[27, 28], 也是影响土壤酶活性的关键因子[29].目前的整合分析表明, 在全球尺度上土壤pH与大部分的土壤酶活性的均存在显著的关系[13].在本研究中, 土壤pH与亮氨酸氨基多肽酶正相关, 而与酸性磷酸酶、几丁质酶和纤维素酶显著负相关.这与之前大部分研究结果相一致.比如, Sinsabaugh等[13]的整合分析表明虽然酸性磷酸酶、纤维素酶和β-葡糖苷酶与土壤pH相关性不显著, 但都呈负相关趋势, 几丁质酶与土壤呈显著负相关, 但亮氨酸氨基多肽酶却与土壤pH呈显著正相关. Kivlin等[26]综合分析了加利福利亚地区多种生态系统影响土壤酶活性变异的因子, 发现酸性磷酸酶、纤维素酶和β-葡糖苷酶与土壤pH显著负相关, 并指出这可能是因为这些酶已经适应当地土壤中性偏碱性的环境, 而实验所用pH为5.5的缓冲液可能对酶活性起到反作用, 使得这些酶与pH呈负相关关系.这刚好与本研究的情况相吻合.由于大部分水解酶在pH等于5左右的时候活性最佳[30], 因而实验采用pH为5的缓冲液.然而在喀斯特区域的土壤pH介于6~8之间, 土壤水解酶可能已经适应这种中性偏碱性的环境, 因而土壤酶与土壤pH呈显著负相关.
土壤总氮也是影响土壤酶活性的重要因素(图 3).本研究发现土壤总氮与碱性磷酸酶和几丁质酶显著正相关, 与酸性磷酸酶和纤维素酶显著负相关.碱性磷酸酶和几丁质酶与土壤总氮显著的正相关与目前大部分的研究结果一致.例如Banerjee等[31]在澳大利亚东南部地区发现其所调查的林地和草地生态系统中几丁质酶、纤维素酶和磷酸酶与土壤总氮显著正相关.李为等[32]调查了桂林岩溶生态系统土壤酶活性的时空动态及其与土壤肥力的关系, 发现碱性磷酸酶均与土壤总氮呈显著正相关.何跃军等[33]研究了石灰岩退化生态系统不同恢复阶段的土壤酶活性, 发现土壤总氮与碱性磷酸酶之间呈显著正相关关系.然而也有少数研究表明土壤酶活性与总氮之间呈负相关关系.比如, Brockett等[7]在加拿大地区发现几丁质酶和磷酸酶的活性与总氮浓度呈显著负相关关系.氮素是合成土壤酶的重要元素, 因此土壤总氮含量一定程度上决定了微生物产生的酶的数量[34].此外, 总氮能增加植被地下细根生物量, 促进根际微生物生长, 致使土壤中相关酶活性增强[35].因而, 总氮与大部分酶呈正相关关系.研究中碱性磷酸酶与总氮显著正相关, 酸性磷酸酶与总氮显著负相关可能是由于土壤pH对土壤酶活性变异有更为强烈的影响而导致的.由于研究区土壤总氮与土壤pH的变化一致, 而土壤pH对酸性磷酸酶和碱性磷酸酶有更为强烈的相反作用, 从而导致总氮与两种磷酸酶之间也有相反的关系.
除了土壤pH和土壤总氮之外, 土壤无机氮也是影响土壤酶活性的重要因子.本研究发现土壤无机氮与酸性磷酸酶和纤维素酶都显著正相关.这也与之前许多研究结果相一致.例如Banerjee等[31]发现纤维素酶、几丁质酶和磷酸酶均与土壤铵态氮和硝态氮都呈显著正相关.葛晓改等[36]调查了三峡库区不同林龄马尾松土壤养分与酶活性的关系, 发现纤维素酶与土壤硝态氮呈显著正相关.由于酶自身也是一种蛋白质, 因而微生物产生酶也需要氮源.而无机氮作为氮素的一种, 可为微生物提供氮源, 促进酶的产生, 增强酶的活性.这可能是无机氮与酶呈正相关的原因.
4 结论(1) 树种和坡向对酶活性的影响不显著, 而坡位对酶活性的影响显著.
(2) 地形、树种和土壤属性共同解释了土壤酶活性变化的55.3%.其中土壤性质是影响酶活性变化的主要因子, 解释量为44.2%.
(3) 土壤pH、总氮、无机氮是影响土壤酶活性变化的主要控制因子.
(4) 研究说明在喀斯特地区小尺度内土壤酶活性主要受土壤理化性质的影响.由于目前土壤胞外酶活性的主控因子研究还不够深入, 特别是在偏碱性的钙质土壤区域相关研究尤其缺乏, 本研究为该领域提供了新的知识.同时, 本研究首次量化了喀斯特地区小尺度内地形, 树种, 及土壤属性对土壤酶活性变化的影响, 对该地区土壤酶活性研究有重要的参考价值.
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