2017, Vol. 38
多环芳烃(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)是指两个或两个以上的苯环稠合在一起的一类中性或非极性有机化合物.在环境毒理学研究中, 多环芳烃已被列入具有三致性(致癌性、致畸性、致突变)的持久性有机污染物名单, 并引起了人们的高度关注[1~4]. PAHs作为脂溶性的有机污染物, 很容易被植物吸收积累, 通过食物链进入生物循环, 对人类的健康造成威胁[5~7].有研究表明, 环境中的PAHs主要赋存于土壤中[8, 9], 这势必会造成种植于其上的农作物的污染.因此, 植物根系对PAHs的吸持作用及其生物有效性的研究有利于保障农业生产的安全和增进人类的身体健康.
通常情况下, 土壤中既残存有前茬的失活根系, 也存在现茬的活体根系.尽管植物根系对介质中PAHs的吸持作用已有颇多研究[10~12], 并且取得了一些创新性结果, 然而, 上述两种根系对PAHs的吸持作用有无差异及吸持的PAHs生物有效性有何不同等问题迄今鲜有报道, 而这些问题的阐明有助于科学评估作物根系吸持的PAHs的当季和后茬生物有效性及其健康风险.为此, 本文以菲为PAHs的代表, 研究了大豆和小麦活体根系、灭活根系和烘干根系在不同时间和菲浓度下对菲的吸持作用, 比较了大豆和小麦各类根系吸持菲的差异, 并对产生差异的原因进行了探讨; 此外, 还观察了根系吸持菲的解吸行为和生物有效性.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试小麦(Triticum aestivum L.)品种为南农9918, 大豆(Glycine max L.)品种为中黄25, 均为江苏地区的主要栽培品种.两种作物的种子购自江苏省农业科学院种子站.
1.2 试验设计 1.2.1 植物培养取适量的种子放入烧杯中, 清水冲洗去除瘪粒, 用3%的H2O2溶液浸泡5 min进行消毒.消毒后的种子放置在底部铺有滤纸的托盘中, 上面滤纸覆盖并用去离子水润湿.然后置于恒温培养箱中, 在25℃黑暗的条件下进行催芽.种子萌发后播种在以蛭石为基质的塑料花盆中并放入光照培养箱中培养15 d, 培养条件：光照强度为400 μmol·(s·m2)-1, 光照周期为白天16 h, 夜晚8 h, 白天/晚上温度设置为25/20℃, 湿度为75%.培养结束后, 用清水洗掉根系表面的蛭石, 将根系剪下, 用去离子水将根系洗涤3遍并用吸水纸擦干备用.
1.2.2 根系菲吸持/解吸试验大豆和小麦根系菲吸持的动力学：按照Su等[13]的方法, 称取2 g活体根或灭活根(在105℃下处理45 min)或烘干根0.2 g于250 mL的三角瓶中, 加入50 mL混合溶液(含0.01 mol·L-1 CaCl2、400 mg·L-1 NaN3和1 mg·L-1菲), 三角瓶密封后置于恒温摇床上, 在25℃, 180 r·min-1的条件下避光振荡.分别在振荡0.1、0.5、1、4、8、12、16、24 h时, 取样测定根系菲吸持量.采用NaN3抑制体系中微生物的活性.
大豆和小麦根系菲吸持的浓度依赖性：称取2 g活体根或灭活根或0.2 g烘干根于250 mL的三角瓶中, 加入50 mL混合溶液(含0.01 mol·L-1 CaCl2、400 mg·L-1 NaN3和一定溶度的菲), 溶液中菲浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mg·L-1, 将三角瓶密封后置于恒温摇床上, 在25℃, 180 r·min-1的条件下避光振荡8 h取样, 测定根系菲的吸持量.
大豆和小麦根系吸持菲的解吸试验：将一定质量菲吸持饱和的大豆和小麦根系置于无菲背景溶液(含0.01 mol·L-1 CaCl2、400 mg·L-1 NaN3)中, 在25℃、180 r·min-1的条件下恒温振荡72 h, 然后测定背景溶液中菲浓度.
1.2.3 根系吸持的菲的生物有效性试验将菲吸持量相同的大豆和小麦活体根、灭活根与烘干根分别放入盛有500 mL Hoagland营养液的烧杯中, 然后向烧杯中移入正常生长的5株大豆和15株小麦植株, 处理4 h后测定植株中菲含量.
1.3 菲的提取和测定吸持菲的提取：按照Schwab等[14]方法提取根系吸持的菲.吸持完成后用去离子水冲洗根系表面, 然后将根浸入40 mL甲醇中3 min.用去离子水稀释至甲醇/水(体积比)为1:9.用移液管移取10 mL混合液于分液漏斗中, 用二氯甲烷萃取3次, 收集有机相, 真空旋转蒸干.用2 mL甲醇重新溶解, 过0.22 μm有机滤膜后用HPLC分析.
植株中菲的提取：按照Zhan等[15]的方法提取根系吸收的菲.处理结束后, 将根系用超纯水洗涤擦干后放入甲醇中浸泡3 min, 再用超纯水冲洗根系并用滤纸擦干.将洗净擦干的植株剪碎放入50 mL的玻璃离心管中, 用1:1(体积比)二氯甲烷/丙酮混合液10 mL超声提取30 min, 重复提取3次.提取液过无水硫酸钠硅胶柱收集至50 mL锥形瓶中, 然后用10 mL 1:1(体积比)的二氯甲烷/正己烷混合液冲洗硅胶柱.最后将收集到的溶液真空旋转蒸干后用2 mL甲醇重新溶解, 过0.22 μm有机滤膜后用HPLC测定.
HPLC分析条件：美国Thermo公司生产UltiMate 3000, 泵型号为LPG-3400SDN, 紫外检测器型号为VWD-3100, 色谱柱为4.6 mm×150 mm C18柱, 柱温30℃, 流动相为甲醇/水(80/20, 体积比), 流速为1.0 mL·min-1, 进样量为10 μL, 菲的紫外检测波长为254 nm.在样品测定前, 采用内标法进行分析标准的测定, 菲的回收率为90.88%.
1.4 根系含水率和比表面积的测定含水率的测定：称取一定量的植物样品烘干至恒重, 以样品烘干前后质量差计算根系的含水率.
比表面积的测定：将洗净的植物根系放入盛有超纯水的有机玻璃盘中, 运用LA1600型根系扫描仪(LA 1600+scaimer, Regent Instruments Inc, Canada)扫描根系并对根图像进行数据处理, 获得根表面积参数.
1.5 根系脂肪含量的测定大豆和小麦根系脂肪含量的测定参照Li等[16]的方法.将烘干的大豆和小麦根系用研钵研碎.称取一定量的研磨后的根系于500 mL的索氏提取器中, 加入三氯甲烷:甲醇=2:1(体积比)的混合液提取12 h, 将提取液旋转蒸干, 用正己烷重新溶解, 过0.22 μm的有机滤膜后装入称重的烧杯中, 等正己烷挥发完全后再次称重, 计算根系脂肪含量.
1.6 数据统计分析采用Excel 2007和Origin 8.5软件对试验数据进行处理、分析、绘图, 用SPSS 21.0对试验数据进行方差分析和Duncan显著性检验.
2 结果与讨论 2.1 大豆和小麦根系菲吸持动力学大豆和小麦根系菲吸持的时间动态如图 1所示.随着吸持时间的增加, 大豆和小麦活体根系对菲的吸持量均呈现先增加后减少, 然后逐渐达到平衡的趋势[图 1(a)].大豆活体根系对菲的吸持量在4 h达到最大值18.52 mg·kg-1, 8 h时达到吸持稳定状态, 吸持量最终稳定在13 mg·kg-1左右; 小麦活体根系对菲的吸持则在1 h时达到最大值(12.98 mg·kg-1), 并在4 h时达到吸持平衡状态, 平衡时吸持量为8.7 mg·kg-1左右.
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同一曲线标记不同字母表示差异显著(P < 0.05) 图 1 大豆和小麦活体根系、灭活根系、烘干根系对菲吸持的时间动态 Fig. 1 Variation of sorption content of phenanthrene to soybean and wheat living roots, dead roots and dried roots with time |
活体根系菲吸持表现为先增加再减少最后趋于平衡的原因是：当活体根系置于菲溶液中, 菲首先会吸持在与溶液直接接触的根系细胞壁上, 随后细胞壁上吸持的部分菲会转移到细胞内部, 从而造成细胞壁上吸持的菲逐渐减少; 一段时间后, 这种动态过程会达到稳定状态, 这时吸持在细胞壁上的菲含量也趋于稳定. Kang等[17]对黑麦草试验结果与本研究一致.
由图 1(b)和1(c)可知, 随着暴露时间的延长, 大豆和小麦灭活根系和烘干根系对菲的吸持均先增加然后趋于稳定, 这与刘建武等[18]报道的结果一致.大豆灭活根系在1 h达到吸持平衡, 菲的最大吸持量为17 mg·kg-1; 而小麦灭活根系在0.5 h达到吸持平衡, 菲最大吸持量为11 mg·kg-1.大豆和小麦烘干根系均在4 h达到吸持平衡, 菲的吸持量分别为120 mg·kg-1和90 mg·kg-1.
灭活根系较活体根系更快达到吸持平衡是因为活体根经高温灭活, 其细胞壁和细胞膜的通透性增加[13], 有机污染物可快速进入根系, 从而更快地达到吸持稳定状态.烘干根系达到吸持平衡的时间比灭活根系长是由于烘干根系浸于菲的水溶液后, 根系存在吸水膨胀过程, 导致其达到吸持平衡时间较长.
根系理化性质、植物生育期等因素会对植物根系吸持有机污染物产生影响[14, 19].试验所用大豆和小麦根系的性质如表 1所示.小麦活体根系的比表面积为178.5 cm2·g-1, 远大于大豆活体根系(80.64 cm2·g-1); 小麦灭活根系的比表面积为229.8 cm2·g-1, 也显著大于大豆灭活根系(114.5 cm2·g-1).所以, 在同浓度的菲溶液中, 相同质量的小麦活体/灭活根系比大豆活体/灭活根系具有更大的比表面积, 能更充分地与菲溶液接触, 加速菲的吸持, 使吸持更快地达到平衡, 这一结果与Chen等[20]的结果一致.焦杏春等[21]研究表明比表面积大的水稻侧根对PAHs的吸持效率大于节根. Wild等[22]发现蒽进入比表面积大的小麦活体根系的速度大于玉米活体根系.所以, 植物根系的比表面积越大, 对菲的吸持速率也越大.此外, 小麦根系的最大吸持量小于大豆根系(图 1), 这也可使小麦根系更快地达到吸持平衡.
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表 1 大豆和小麦根系的比表面积和含水率 Table 1 Specific surface area and water content of soybean and wheat roots |
为了直观地比较各根系对菲的吸持速率, 本研究计算了各根系从吸持开始至达到吸持最大值时, 单位时间内根系菲的平均吸持速率, 其结果如表 2所示.从中可以看出, 大豆活体根系和灭活根系的菲吸持速率分别小于小麦活体根系和灭活根系, 但是大豆烘干根系的菲吸持速率大于小麦烘干根系.通过计算可知小麦活体根、灭活根和烘干根系的比表面积分别是相应大豆根系比表面积的2.3、1.9、1.5倍, 菲吸持速率分别是相应大豆根系的2.8、1.4、0.74倍.小麦和大豆活体根系和灭活根系比表面积差异越小, 菲吸持速率差异也越小, 说明根系菲的吸持速率与比表面积成正比; 小麦烘干根系的比表面积大于大豆烘干根系, 菲吸持速率却较小, 说明除比表面积外, 还有其他因素影响根系菲的吸持速率.本试验测得大豆和小麦烘干根系的脂肪含量分别为4.0%和2.1%, 脂肪含量越高对菲的亲和能力越强, 吸持菲的速率越快.
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表 2 大豆和小麦根系菲的吸持速率/mg·(kg·h)-1 Table 2 Phenanthrene sorption rate of soybean and wheat roots/mg·(kg·h)-1 |
2.2 大豆和小麦根系菲吸持的浓度依赖性
大豆和小麦各根系对菲吸持作用的浓度依赖性结果如图 2所示.随着溶液中菲浓度的增加, 大豆和小麦各根系的菲吸持量呈显著增加的趋势; 大豆各根系菲吸持量均显著高于相应的小麦根系.
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图 2 大豆和小麦活体根系、灭活根系、烘干根系的菲吸持的浓度依赖性 Fig. 2 Sorption content of phenanthrene to soybean and wheat living, dead, dried roots at different phenanthrene levels |
对图 2中大豆和小麦根系菲吸持的结果分别采用Henry、Freundlich、Langmuir吸附等温式进行拟合. 3种等温式的吸持常数列于表 3.对于大豆和小麦各根系来说, Henry等温式拟合的效果较好, R2都大于0.973, 说明分配作用在吸持过程中占主要地位[23, 24].大豆和小麦灭活根系和烘干根系的Freundlich等温式拟合的R2都为0.998, 拟合效果优于Henry等温式拟合, 小麦根系的Langmuir等温式拟合效果优于大豆根系, 表明除了分配作用外表面吸持在根系吸持菲的过程中起到控制作用.构成植物根系的主要组分有纤维素、半纤维素、果胶、木质素、脂肪等.一方面菲可以强烈地分配到具有芳香碳的木质素和脂肪碳的脂肪中; 另一方面物理或化学作用又可以使菲被吸持到固体表面上.大豆和小麦活体根系的Freundlich等温式拟合效果较灭活根系和烘干根系差. Su等[13]认为相对于灭活根系, 植物活体根系细胞壁与PAHs存在特殊的键和作用; 刘婷婷等[25]研究了海州香薷根系细胞壁对铜的吸附固定机制, 结果表明细胞壁蛋白结合Cu2+的方式主要是在ATP酶等动力的供应下, 主动结合Cu2+, 而离体的细胞壁无能量供应, 加之蛋白质失活, 对Cu2+的固定能力消失, 因而植物活体根系具有生物活性, 对菲的吸持也更为复杂.小麦根系的比表面积大于大豆根系, 菲分子在小麦根系上的吸持表现为单分子层的表面吸持, 刘建武等[18]研究了萘在水葫芦根系上的吸持, 表明Langmuir等温式拟合效果最好, 大豆根系的Langmuir等温式拟合效果较差, 是因为大豆根系的脂肪含量较高, 菲在其上的吸持分配作用较小麦根系强.
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表 3 Henry、Freundlich和Langmuir吸附等温式拟合常数 Table 3 Parameters of Henry, Freundlich and Langmuir model-based sorption isotherm |
大豆根系的菲吸持量显著大于相应处理小麦根系的原因是根系脂肪和水分含量的影响.通常, 脂肪含量越高, 植物根系对有机污染物的吸持能力也越强[26, 27].大豆根系脂肪含量高于小麦, 其对菲的吸持能力也更强.由表 1可知大豆活体根系的含水率高于小麦, 使更多的菲溶解在大豆根系质外体或共质体溶液中, 增加大豆活体根系菲的吸持量.对于大豆和小麦来说, 灭活根系的吸持量均大于活体根系, 是因为活体根系经高温灭活后, 根系的膜通透性增加, 污染物可以快速扩散进入根内, 促进有机污染物在根系有机组分间的分配, 使根系的吸持容量增大[13].
2.3 大豆和小麦根系吸持的菲的解吸大豆和小麦根系菲解吸的结果如图 3所示.大豆各根系的菲解吸率均小于相应的小麦根系; 活体根、灭活根和烘干根的菲解吸率为：活体根＞烘干根＞灭活根.
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同一图案标注不同字母表示显著性差异(P < 0.05) 图 3 大豆和小麦根系的吸持菲的解吸率 Fig. 3 Desorption rate of the sorbed phenanthrene on soybean and wheat roots |
本试验测得大豆根系的脂肪含量为4.0%, 小麦根系的脂肪含量为2.1%.脂肪中的脂肪族碳等可与菲之间形成强的共轭体系, 使吸持的菲难以解吸下来[28, 29], 因此, 脂肪含量越高, 菲的解吸率越低, 大豆根系的菲解吸率小于相应的小麦根系.由表 1可知小麦活体根、灭活根、烘干根系的比表面积分别是相应的大豆根系的2.3、1.9、1.5倍, 吸持菲的小麦活体根、灭活根、烘干根系的解吸率分别是相应大豆根系的1.55、1.42、1.36倍, 两者的变化规律一致, 因此比表面积也是影响解吸率的另一重要因素.吸持在小麦根系表面的菲能更充分地跟溶液接触, 其吸持的菲解吸到溶液中的概率也更大.
Su等[13]研究表明非极性有机污染物在活体根系上的转运主要是通过质外体途径在细胞间的细胞壁上移动, 因而菲在活体根上的吸持主要是吸持在根系细胞壁上.灭活根系的细胞结构被破坏, 膜通透性大, 菲可快速扩散进入根类脂物中, 促进分配, 因此菲可以吸持在灭活根系的细胞壁组分上, 也可以吸持在细胞膜组分中.细胞膜的主要组分是磷脂双分子层, 对菲具有强的亲和作用, 吸持在该组分上的菲更难解吸.因而灭活根系的菲解吸率较活体根低.烘干根不具有完整的细胞结构, 菲可以吸持在细胞膜的类脂结构上, 但是烘干根系的比表面积较大, 可使吸持的菲解吸的概率更大.因此具有完整细胞结构的活体根系的解吸率高, 且比表面积越大, 解吸率越高.
2.4 大豆和小麦根系吸持菲的生物有效性本研究的生物有效性是指吸持在根系上的菲被植株利用的实际可能性[30, 31].大豆和小麦根系吸持菲的生物有效性试验结果如图 4所示.对大豆和小麦而言, 根系吸持的菲的生物有效性均表现为活体根系＞烘干根系＞灭活根系, 且大豆根系吸持的菲的生物有效性低于相应的小麦根系.这些结果与解吸率结果相一致, 因此大豆和小麦根系吸持菲的生物有效性与菲的解吸率呈正相关关系, 解吸率可以用于表征根系吸持菲的生物有效性.同时, 上述结果也说明了作物根系吸持的菲的当季有效性高于残茬.
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同一作物根系同一图案标注不同字母表示显著性差异(P < 0.05) 图 4 根系吸持菲的生物有效性 Fig. 4 Bioavailability of the sorbed phenanthrene on soybean and wheat roots |
(1) 分配作用和表面吸附作用共同控制根系对菲的吸持作用, 活体根的吸持更为复杂.根系的含水率越高、膜通透性越大、脂肪含量越高, 根系菲的吸持容量越大.根系吸持菲的能力为：大豆根系大于相应的小麦根系.
(2) 根系吸持菲的解吸率为：大豆各根系的菲解吸率均小于相应的小麦根系; 活体根＞烘干根＞灭活根.
(3) 根系吸持菲的生物有效性为：小麦根系＞大豆根系; 活体根系＞烘干根系＞灭活根系.
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