2017, Vol. 38
2. 东北林业大学林学院, 哈尔滨 150040;
3. 农业部都市农业(北方)重点实验室, 北京 100097
2. College of Forestry Science, Northeast Forestry University, Harbin 150040, China;
3. Key Laboratory of Urban Agriculture(North), Ministry of Agriculture, Beijing 100097, China
近30年来, 我国水产养殖业得到快速发展, 养殖产量已经连续多年居世界第1位[1].在面临我国资源与环境严峻形势下, 传统粗放的养殖模式必然会向节水、环保、生产效率高、养殖周期短、可持续生产的循环水养殖系统(recirculating aquaculture systems, RAS)转变[2]. RAS兴起于20世纪80年代末[3], 它通过沉淀、过滤、生物净化、增氧、杀菌消毒等一系列物理、化学和生物手段主动控制养殖水质环境和营养供给[4], 生物过滤系统是RAS污染物去除的重要组成部分[5].在循环水养殖系统中, 养殖对象的排泄物及残饵残渣等物质是NH4+-N和NO2--N等污染物的主要来源[6], 如何高效去除对养殖水产构成威胁的NH4+-N和NO2--N等污染物是水产养殖水质净化的关键性问题[7].反应器填料性质变化有时也会对生物膜微生物群落造成影响, 了解生物膜内微生物群落结构, 尤其是硝化菌群结构组成也有利于循环水养殖系统的稳定运行[8~10].
不同种类的填料对于生物过滤系统的硝化性能有重要影响.本研究采用移动床生物膜反应器(moving bed biofilm reactor, MBBR)和挂帘式生物滴滤池处理模拟养殖废水, 分析比较6种不同填料条件下, NH4+-N转化为NO3--N的效率, 同时研究不同生物过滤系统内生物膜的微生物群落结构, 来筛选最适填料, 以期为更有效地处理循环水产养殖废水奠定实验基础.
1 材料与方法 1.1 实验材料本实验以3组(编号M1、M2、M3) 悬浮填料组成的MBBR系统和3组(编号F1、F2、F3) 滤布填料构成的挂帘式生物滴滤池作为研究对象, 其填料基本参数见表 1、表 2.多孔流化悬浮填料塑料P1, 高密度聚乙烯K1, K2填料.
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表 1 悬浮填料的基本参数 Table 1 Basic parameters of the fillers |
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表 2 挂帘滤布的基本参数 Table 2 Basic parameters of the filter cloth |
活性污泥：取自水产养殖生物过滤系统的污泥.
1.2 实验装置水处理生物过滤系统分为MBBR和挂帘式生物滴滤池, 图 1(a)为MBBR装置示意, 材料为有机玻璃, 内径为13.7 cm的圆柱体, 总体积为3 L, 有效体积为2 L, 填料填充率为30%. 图 1(b)为挂帘式生物滴滤池装置示意图, 生物滤池材质为有机玻璃板, 构型为长方体, 总体积为3 L, 长20 cm, 宽10 cm, 高15 cm, 生物滤池内纵向插入4张滤布.人工配水在两种生物过滤系统中反复循环处理, 具体循环过程如下：进水从集水桶(有效容积6 L)经蠕动泵泵入生物过滤系统, 经过生物过滤系统处理后出水流回集水桶, 再泵入系统中循环处理.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of experimental device |
本实验用水为人工模拟养殖废水, 进水配方为：C6H12O6 33.3 mg·L-1, NH4Cl 68.76 mg·L-1, NH4+-N 18 mg·L-1, NaHCO3 71.4 mg·L-1, Na2HPO4 18.85 mg·L-1, 混合微量元素1 mg·L-1.
混合微量元素：MnSO4·H2O 33.8 mg·L-1, H3BO3 49.4 mg·L-1, ZnSO4·7H2O 43.1 mg·L-1, FeSO4·7H2O 97.3 mg·L-1, CuSO4·5H2O 25.0 mg·L-1.
反应器启动方法：将6 mL稀释污泥按1‰(体积比), 接种到反应器中, 配置模拟养殖废水6 L, pH调至7.5~8.0, 流速为0.5 L·min-1, DO为8~8.5 mg·L-1, 循环运行2 d, 待大量污泥附着在生物填料上, 将剩余污泥排出后, 加入人工模拟养殖废水进行驯化, 循环运行2周.
序批式实验反应器运行参数：反应器挂膜启动后, 进水更换为新配人工模拟养殖废水, pH调至7.5~8.0, 流速为0.5 L·min-1(即反应器水力停留时间为4 min), DO为8~8.5 mg·L-1, 温度利用加热棒控制在25℃, 实验运行40 h, 重复3个批次.每8 h取反应器出水口水样, 检测NH4+-N、NO2--N和NO3--N浓度.
1.4 分析方法NH4+-N浓度的检测方法：纳氏试剂光度法[11], 检测试剂购自连华科技有限公司. NO2--N浓度检测方法：重氮偶合分光光度法[11](GB/T 5750.5-2006). NO3--N浓度检测方法：紫外分光光度法[11]. DO使用溶解氧测量仪(哈希LDO便携式溶氧仪). pH使用德国WTW inoLab pH7310台式pH测量仪.
1.5 高通量测序及数据分析方法 1.5.1 DNA提取和PCR扩增取反应器填料(60 d), 收集生物膜, 采用PowerSoil® DNA提取试剂盒(MO BIO Laboraterie, Inc., Carlsbad, CA, USA)提取细菌DNA. PCR扩增细菌16S核糖体RNA基因的V3可变区提取DNA送美吉公司进行Illumina MiSeq测序.所用引物为515F 5′-barcode-GTGCCAGCMGCCGCGG)-3′和907R 5 ′-CCGTCAATTCMTTTRAGTTT-3′, 且每个样本分别加上8 bp的标签(barcode)序列.具体扩增条件及体系见文献[12]为：95℃预变性2 min, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃复性30 s, 25个循环, 再72℃延伸5 min.反应体系为20 μL, 包括4 μL的5×FastPfu Buffer, 2 μL的2.5 mmol·L-1 dNTPs, 引物(5 μmol·L-1)各0.8 μL, 0.4 μL的Fast Pfu Polymerase和10 ng模板DNA.每个样品的扩增重复3次.
PCR扩增真核微生物18s RNA基因的V4可变区, 引物为3NDF(5′-GGCAAGTCTGGTGCCAG-3′)和反向引物V4-euk-R2(5′-ACGGTATCTRATC RTCTTCG-3′)[13, 14], 95℃预变性2 min, 接着30个循环, 95℃变性30 s, 55℃退火30 s, 72℃延伸30 s, 最后72℃延伸5 min.反应体系为20 μL, 包括每种引物0.2 μmol·L-1, 1×PCR Buffer, 2.5 U的Pfu DNA Polymerase和10 ng模板DNA[14, 15].
1.5.2 Illumina MiSeq测序从2%琼脂糖凝胶中回收扩增子, 依照AxyPrep DNA Gel Extraction Kit说明书进行纯化(Axygen Biosciences, Union City, CA, U.S.), 再用QuantiFluorTM-ST (Promega, U.S.)进行定量.将纯化后的扩增子等量混合, 然后根据Illumina MiSeq测序平台的标准流程进行双端(2×250 bp或2×300bp)测序.
1.5.3 数据分析及作图用QIIME (version 1.17) 软件对原始文件进行处理, 用UPARSE(version 7.1 http://drive5.com/uparse/)软件聚类生成操作分类单元(operational units, OTUs), 相似度为97%.分类学比对时, 用silva (SSU115)16S核糖体RNA数据库, 算法为RDP Classifier (http://rdp.cme.msu.edu/), 置信阈值为70%[16].用R语言(版本3.1.0) 绘图包pheatmap软件, 选取相对丰度前20的属, 对相对丰度取10为底的对数, 制作热图.利用R语言中prcomp软件做主成分分析.
2 结果与讨论 2.1 填料挂膜效果对比在同样的挂膜时间内, 3种挂帘式生物滴滤池的总体挂膜效果要好于3种MBBR, 挂膜第10 d, 填料表面逐渐变为黄色, 第40 d时M1、M2、M3这3种填料内部有明显黄褐色的生物膜形成, 目测与M2相比较, M1和M3内部有更厚的生物膜, 从生物膜干重测量表明(表 3), 单位体积的M1填料的生物膜重量(11.9 g·L-1)与M2(6 g·L-1)和M3(9.1 g·L-1)相比, M1含有较多的生物膜, 说明M1填料具有更好的挂膜效果. F1、F2、F3表面附有大量生物膜, 单位面积碳纤维填料(45.97 g·m-2)与涤纶无纺布(41.24 g·m-2)和工业滤纸(6.34 g·m-2)相比含有较多的生物膜, 说明比表面积大有利于微生物的附着与生长, 这与Zhang等[17]研究结果类似, 说明具有更大内部表面积的填料挂膜启动更快. MBBR中悬浮填料会随着曝气的水流而上下摆动, 在水流的冲刷下导致悬浮填料上附着的微生物容易脱落, 而挂帘式生物滴滤池填料相对固定, 微生物不仅附着在填料表面, 也会附着在滤布填料内部, 避免了硝化细菌由于水流和曝气冲刷而脱落, 挂帘式生物滴滤池的结构更适于微生物的附着与生长, 有利于提高NH4+-N和NO2--N的去除效率.
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表 3 填料生物膜干重对比 Table 3 Dry weights of biofilms on carriers |
2.2 稳定运行阶段不同填料反应器运行效果对比
挂膜成熟后, 不同填料过滤系统去除模拟养殖废水中NH4+-N的情况如图 2, 初始NH4+-N浓度为18 mg·L-1, 随着反应系统的运行, NH4+-N浓度逐渐降低, 经过16 h的处理6个反应器的NH4+-N浓度均降低到0左右.但8 h时, 碳纤维挂帘式生物滴滤池的NH4+-N浓度最低, 其NH4+-N去除率(86.76%)高于其他反应器(61.96%~78.76%). 8 h时碳纤维挂帘式生物滴滤池具有更高的NH4+-N去除率, 其比表面积大, 能够为微生物的附着提供更大的空间和良好的生存环境, 刘雨等[18]认为当单位面积上附着的生物膜上微生物含量多, 有助于对NH4+-N的快速降解, 而反之则降解速率越低.
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图 2 序批式实验中NH4+-N、NO2--N、NO3--N浓度变化 Fig. 2 NH4+-N, NO2--N, NO3--N concentration changes in the batch experiments |
NO2--N能通过鳃和皮肤渗透到鱼体使亚铁血红蛋白失活, 从而失去携带氧的功能, 使水生生物体内缺氧而导致死亡, 所以在处理养殖废水时要尤其注意NO2--N的积累量.序批式实验中NO2--N浓度均是先升再降, NO2--N峰值达到4.18 mg·L-1, 而相比较而言挂帘式生物滴滤池去除NO2--N更为迅速(图 2), 16 h时基本降为0.5 mg·L-1以下.由于本研究中NH4+-N一次性添加, 所以前期的高NH4+-N浓度会引起NO2--N积累, 这与邱立平等[19]认为游离NH4+-N浓度过高引起NO2--N积累的原因相类似. NO3--N生成规律6个反应器保持一致, 均是不断积累的过程, NO3--N的峰值基本是在NO2--N浓度达到最低值时出现的, 说明NO2--N已基本转化为NO3--N.
MBBR在充分曝气的条件下, 悬浮填料随流水扰动上下摆动, 利用生长在填料表面的硝化细菌对养殖废水进行处理.挂帘式生物滴滤池以滤布为填料, 在布水器的作用下, 养殖废水均匀淋在滤布上, 利用生长在滤布填料上的微生物对养殖废水进行降解, 整个过程并不需要曝气.碳纤维滤布填料与其他5种填料相比具有更好的挂膜效果, 挂膜速度快、挂膜生物量多且稳定; 碳纤维挂帘式生物滴滤池具有较好的硝化效率, 对NH4+-N有更好的处理效果, 并且NO2--N积累程度低.而且不需要传统工艺中的曝气与反冲洗步骤, 简化工艺流程的同时节省了运行成本, 适宜在水产养殖等低碳氮比废水脱氮中推广应用.
2.3 不同反应器内生物膜上微生物群落结构解析α多样性分析可以衡量区域内物种资源的丰富度, 评价微生物群落的结构特征及稳定性[20].不同反应器的生物膜DNA经过提取、扩增和高通量测序分析, 去除嵌合体后序列平均长度为656 bp, 经过均一化后, 每个样品有20 998条序列, 将相似性高于97%的序列归为1个OTU, 并进行α多样性分析, 所有样品的覆盖率(coverage)说明测序数量能够覆盖99%的细菌种类.无论是细菌还是真核微生物, 挂帘式生物滴滤池(编号F1~F3) 中表征物种丰度的Chao1、ACE及表征群落均匀多样性的Shannon等指数, 均高于MBBR(编号M1~M3), 见表 4和表 5, Simpson指数[21]也可以表示样品的多样性程度, 其值越大表明样品群落多样性越低.结果表明, 挂帘式生物滴滤池生物膜中含有更为丰富的微生物, 在细菌方面, 以碳纤维滤布为填料的F1生物滤池的物种丰度与多样性均是最高, 即相对于MBBR, 而真核微生物方面, 以涤纶无纺布为填料的F2生物滤池的真核微生物丰度最高, 以工业滤纸为填料的F3生物滤池的多样性最高.可以看出挂帘式生物滴滤池的微生物群落的稳定性更强, 不利于病原菌的大量生长[22, 23].
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表 4 微生物群落中细菌种系覆盖和多样性指数对比 Table 4 Comparison of phylotype coverage and diversity estimators in the bacterial communities |
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表 5 微生物群落中真核微生物种系覆盖和多样性指数对比 Table 5 Comparison of phylotype coverage and diversity estimators in the microeukaryote communities |
两种反应器的生物膜上微生物群落在门水平分类上的相似性能够明显将挂帘式生物滴滤池(编号F1~F3) 和MBBR(编号M1~M3) 区分开(图 3).在细菌群落系统总体上看, 变形菌门(Proteobacteria, 43.8%)、放线菌门(Actinobacteria, 15.2%)、拟杆菌门(Bacteroidetes, 12.4%)、硝化螺菌门(Nitrospirae, 6.6%)、酸杆菌门(Acidobacteria, 6.6%), 5个门的平均相对丰度高于5%.这几大类微生物是水生环境中的常见微生物, 变形菌门是一类对氮素循环有重要作用的微生物[24], 其中存在具有氨氧化能力的细菌, 可以在好氧条件下将NH4+-N氧化为NO2--N[25].杆菌门是一类在淡水环境中大量存在的异养浮游细菌, 能够降解和代谢有机物[26~28], 硝化螺菌门使得NO2--N向NO3--N转换得以进行[29].变形菌门和硝化螺菌门在硝化过程中承担着重要作用, 确保NH4+-N向NO3--N转化.在真核微生物落系统中[图 3(b)], 总体上看绿藻门(Chloroplastida, 31.62%)、线虫门(Nematoda, 27.93%)、轮形动物门(Rotifera, 15.4%)、丝足虫门(Cercozoa, 6.54%), 这4个门在6种反应器中均有分布, 但真核微生物群落系统丰度均有不同差异.挂帘式生物滴滤池中丝足虫门(Cercozoa)含量明显高于MBBR, 而MBBR中绿藻门(Chloroplastida)更占优势.吕福荣等发现属于绿藻门的小球藻对氮、磷有良好的吸附与利用能力[30, 31].刘宏远等发现当生物滤池中出现轮虫和线虫时, 标志着生物相已达到完全成熟, 生物滤池运行状况良好.线虫和轮虫都属于无脊椎动物, 能够摄食多余和老化的生物膜及有机颗粒物质, 延长填料的过滤周期, 有着积极作用[32].线虫门是优势类群, 常生活在污泥和生物膜上, 它们以细菌、藻类、轮虫和其他线虫喂食.轮形动物门中轮虫通常具有较长的趾, 可以靠趾固着介质表面, 以吸食表面的细菌和有机碎屑为生[33].
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图 3 细菌、真核微生物群落系统发育分类分析-门水平 Fig. 3 Phylogenetic classification of bacterial communities and microeukaryote communities |
在细菌属水平相对丰度上[图 4(a)], 放线菌中的Nakamurella属(15.43%)和硝化螺菌属(Nitrospira, 12.27%)在6个反应器中相对含量均较高, 放线菌属的Nakamurella multipartita菌株是一种自活性污泥中分离, 可以生产多糖, 有利于生物膜形成的一类微生物, 该类微生物的大量生长有利于微生物在填料上的附着并形成生物膜[34].硝化螺菌属能够将亚硝氮氧化成硝态氮, 广泛存在于淡水水生环境中, 在水环境硝化过程中起着重要作用[24].亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)是能够将氨氮氧化成亚硝态氮的自养亚硝化细菌[35].值得注意的是, 在MBBR反应器中, 3种填料反应器的硝化螺菌属平均相对丰度为12.0%, M1形成的生物膜不但硝化螺菌属含量高, 而且亚硝化单胞菌属相对含量(5.3%)也明显高于其他两种载体M2(2.6%)和M3(5.0%).而在挂帘式滴滤池中, 硝化螺菌属平均丰度为12.6%, F1和F2的硝化螺菌属相对丰度高于F3, 但自养的亚硝化单胞菌相对丰度是F2最高.虽然两类型反应器的生物膜中两类自养硝化细菌(硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属)的平均相对丰度相差不大, 但由于两者的生物膜量差异(表 3), 使得挂帘式生物滴滤池的铵态氮向亚硝氮转化, 及亚硝氮向硝态氮转化的速率要高于MBBR反应器.
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图 4 细菌、真核微生物群落系统属水平物种相对丰度热图 Fig. 4 Heatmap analysis of bacterial and microeukaryote community |
在真核微生物属水平相对丰度上[图 4(b)], 可以看出, 在挂帘式生物滴滤池(编号F1~F3) 中线虫纲小杆目中的Rhabditida norank(39.49%)占明显优势, 而MBBR(编号M1~M3) 中绿藻纲中的Chlorophyceae norank(29.66%)占明显优势.绿藻纲中的Chlorophyceae norank(11.81%)、磷壳虫属(Euglypha, 12.03%)这2类菌在挂帘式生物滴滤池中相对丰度较高, 而在MBBR中, 线虫纲小杆目中的Rhabditida norank(13.93%)、毛枝藻属(Stigeoclonium, 18.47%)、轮虫纲中Adinetida norank(12.32%)、蛭态目中Bdelloidea unclassified(10.77%), 这四类真核微生物的相对丰度较高, 可以看出两种反应器中真核微生物构成有差异.
另一方面, 主成成分析也表明两类反应器上生物膜组成有明显区别, 如果其组成越相似, 反映在PCA图中的距离越近.细菌群落系统而言[图 5(a)], 挂帘式生物滴滤池中细菌群落相似性高, 而MBBR中不同形状填料上附着的细菌群落间也有区别(如M1、M3和M2间的差别), 两个主成分因子的贡献率分别为36.86%和26.82%.真核微生物群落系统而言[图 5(b)], 挂帘式生物滴滤池中真核微生物的相似性要高于MBBR, 两个主成分因子的贡献率分别为70.98%和19.8%.
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图 5 生物膜微生物群落的主成份分 Fig. 5 Principal component analyses of bacterial and microeukaryote community structure in biofilms |
(1) 挂帘式生物滴滤池与MBBR相比具有更好的挂膜效果, 挂膜速度快、挂膜生物量多且稳定; 碳纤维挂帘式生物滴滤池铵态氮转化速率高, 短时间内对NH4+-N有更好的处理效果, 并且NO2--N积累程度低.
(2) 通过生物膜上细菌群落结构解析表明, 在不同类型反应器内形成的生物膜上细菌群落结构有明显差别, 且同一类型反应器不同填料上的细菌群落结构也有所不同.两种生物过滤系统中两类主要自养硝化细菌(硝化螺菌属和亚硝化单胞菌属)的平均相对丰度相差不大, 但同种生物过滤系统中两种硝化细菌相对丰度高的填料, 对应的铵态氮转化效率也较高.与MBBR相比, 挂帘式生物滴滤池内生物膜的细菌群落具有更好的稳定性.
(3) 通过生物膜上真核微生物群落结构解析表明, 在不同类型反应器内形成的生物膜上真核微生物群落结构有明显差别, 虽然两种生物过滤系统菌群相类似但是存在丰度上的差异, 挂帘式生物滴滤池中丝足虫门含量明显高于MBBR, 而MBBR中绿藻更占优势.
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