2017, Vol. 38
2. 中国建筑西北设计研究院有限公司, 西安 710018
, WU Jing1
, ZUO Jian-e1 , WANG Xiao-lu1 , WANG Chong1 , WANG Guang-qi1,2 , WANG Kai-jun1 , QIAN Yi1
2. China Northwest Architecture Design and Research Institute Co., Ltd., Xi'an 710018, China
随着污水排放量增加、处理率提升且处理程度不断深化，我国污泥产生量也逐年增加.截至2015年末，我国城镇污水年处理量达到507.7×108t，处理率达91.0%[1].相应地，2015年污泥 (含水率80%) 产生量达到3 500×104 t，据预测，到2020年污泥年产生量将达到6 000×104~9 000×104 t[2].污泥汇集了污水中约30%~50%的COD、30%~45%的氮和90%左右的磷，以及一些病原菌及重金属等[3].如果未经有效的处理处置，随意堆放，污泥极易对环境造成严重的二次污染，同时也造成资源浪费[4].
厌氧消化是一项应用广泛的污泥处理技术，它能够实现污泥的稳定化、减量化，降低污泥的卫生风险，同时还能将部分有机物转化为沼气实现能量的有效回收[5].欧美国家经过厌氧消化的污泥达到50%以上[4].然而，污泥厌氧消化在我国的应用还十分有限[6].这里面的原因当然是多方面的，单就技术来看，传统污泥厌氧消化的进料含固率一般为2%~5%，存在产气率低、处理设施体积大、投资高、加热能耗高、沼渣产量大等问题，在一定程度上制约了其推广应用[7, 8].高固消化可将进料含固率提高到8%~20%，意味着污泥中有机质浓度增加，待处理污泥体积减少，利于解决上述限制污泥传统厌氧消化推广应用的问题[7~10].王广启等[7]和戴晓虎等[11]认为高固厌氧消化是解决我国脱水污泥处理处置问题的重要途径，具有较好的应用前景.
污泥高固厌氧消化已经引起关注.多个研究对比了污泥的低固和高固厌氧消化，结果显示，随着含固率 (约为2%~15%) 的增加，VS去除率和甲烷产率等并未明显降低，反应器的处理能力和容积沼气产率将大幅提高[9, 12, 13]；若延长高固消化的固体停留时间 (solid retention time, SRT)，则VS去除率和产气率还能有所提高[14].
在优化污泥高固厌氧消化性能方面，有机含量[13]、SRT[13, 15, 16]、中温/高温消化[15, 17]和分级/分相工艺[5, 6, 18]等对VS去除率和产气率的影响已有报道.其中的温度和分级/分相关系到工艺类型的实质.按照温度不同，常用的厌氧消化分为中温厌氧消化 (35℃) 和高温厌氧消化 (55℃).两者相比，高温厌氧消化的反应速率更高，在处理高含固率污泥时可能获得更高的沼气产率[15]，但也可能造成更高的氨氮浓度从而抑制消化过程[17].两相工艺则能够使厌氧消化的两大类主力微生物，即产酸菌和产甲烷菌，各自在最佳环境条件下生长，保持较高微生物的活性，从而获得良好的消化性能[6].若将酸化相的温度提高到70℃的超高温，则可进一步强化水解效果提高消化性能，且对病原菌和蠕虫卵的杀灭率也较高[6].戴晓虎等[6]研究发现含固率为10%的污泥经过70℃酸化4 d后，再进行55℃厌氧消化16 d，与相同污泥直接55℃厌氧消化20 d相比，VS去除率提高15%，甲烷产率提高约1/3. Liao等[18]研究表明，对于含固率高达15%的污泥，70℃水解30 min，能使其厌氧消化的沼气产率提高11%；要达到水解污泥消化15 d的甲烷产率，未水解污泥则需要22 d.
微生物过程是厌氧消化的核心，但目前对污泥高固厌氧消化的微生物机制尚未深入研究. Liu等[19]报道称，在单级中温厌氧消化器中，当进泥含固率从10%增加到19%时，细菌群落中厚壁菌门减少，拟杆菌门增多；古菌群落中乙酸营养型产甲烷菌减少，而氢营养型和甲基营养型产甲烷菌增多.戴晓虎等[11]通过降低pH和提高总氨氮浓度两种方法调控游离氨，考察了进料含固率为15%的中温污泥高固厌氧消化反应器在这两种情况下的性能表现和微生物群落变化，研究发现一些糖类和蛋白质类发酵细菌会受到影响，而主要的产甲烷菌始终是甲烷八叠球菌.王腾旭等[20]研究表明，两相高固污泥厌氧消化系统中的微生物群落结构显著不同，微生物结构与COD、TS和VS显著相关.厌氧消化过程复杂，影响因素众多，包含反应温度、进料组分、相分离、氨氮、SRT、有机负荷等.目前已报道的研究结果尚不足以系统揭示污泥高固厌氧消化的微生物机制.为此，本研究采用“超高温酸化 (70℃)-高温甲烷化 (55℃)”的强化两相工艺，运行了一个中试污泥高固厌氧消化系统，并利用16S rRNA克隆文库技术研究了该系统稳定运行时的微生物群落，以期更多地认识污泥高固厌氧消化的微生物机制.
1 材料与方法 1.1 试验装置中试试验持续约9个月.采用的强化两相厌氧消化工艺为“超高温酸化-高温甲烷化”(图 1).中试两相的反应器有效容积分别为0.24 m3和1 m3，反应温度分别为 (70±1)℃和 (55±1)℃，SRT分别为3 d和12.5 d.两相反应器都用螺带式搅拌器连续搅拌混合.每天监测系统的产气和有机物去除率.待运行时间超过50 d (2个总SRT为31 d) 后，产气速率和有机物去除率提升并稳定，系统达到稳定运行阶段，此时才开始采集泥样做相关分析.
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图 1 工艺流程示意示意 Fig. 1 Process flow chart |
高温产甲烷相的种泥采自一个生产规模的中温污泥厌氧消化器，SS和VSS分别为29.8 g·L-1和17.0 g·L-1.用作试验进料的原泥为脱水剩余活性污泥，取自广州的一个污水处理厂.原泥的含固率为8.75%±0.78%，有机质含量 (VS/总固体) 为65.0%±3.02%.
1.3 分析方法沼气产量和沼气中的甲烷含量每天用湿式防腐气体流量计和红外甲烷检测器测定.污泥样品的pH用pH计测量，含固率和VS用重量法测量[21].对于溶解性化学需氧量 (soluble chemical oxygen demand, SCOD)、总氨氮 (total ammonia nitrogen, TAN) 和总碱度 (total alkalinity, TALK) 等参数的测量，污泥样品首先经5 000 r·min-1离心10 min，然后上清液用0.45 μm滤膜过滤，最后所得的滤液用于进一步分析. SCOD用快速消解-分光光度法，TALK采用溴甲酚绿-甲基红指示剂滴定法，TAN采用纳氏试剂分光光度法[21].游离氨 (free ammonia nitrogen, FAN) 根据Hansen等[22]的公式计算.
1.4 微生物群落分析在系统稳定运行期，从两相反应器中各取泥500 mL，混匀后取500 μL，用磷酸缓冲液洗3次，每次磷酸缓冲液经离心去掉.清洗后的污泥球保存于-80℃直到提取DNA.样品的总DNA用Fast DNA SPIN Kit for Soil (MP Bio-medicals, LLC, USA) 提取.细菌和古菌的16S rRNA基因用Wang等[23]的方法进行PCR扩增，细菌和古菌的引物分别为63F/1387R和109F/915R. PCR产物用QIA quick PCR purification kit (Takara Corp., Japan) 纯化，然后克隆到pGEM-T-easy载体.克隆由上海生工用3730XL DNA Analyzer (ABI, USA) 测序.
使用QIIME[24]对所得序列进行分析.首先用Blast_Fragments方法扫描识别并去除嵌合体，余下有效序列；随后，依据97%的序列相似性，将有效序列划分为不同的操作分类单元 (operational taxonomic units, OTU)，选取各OTU的代表序列与GreenGen数据库进行比对注释，并基于OTU分布结果计算覆盖度和Shannon多样性指数.
2 结果与讨论 2.1 中试系统的运行情况运行50 d后，系统的沼气产率、甲烷含量和消化污泥的主要性质已经稳定，系统达到稳定状态.稳定运行期，中试系统平均的总VS去除率和甲烷产率 (以CH4/VS去除计) 分别为35.7%和0.648 m3·kg-1.仅在高温产甲烷相检测到沼气，沼气中甲烷含量为65.3%±1.9%.超高温酸化相未检测到沼气，但去除VS的效果明显，占系统总的有机物去除率的44.7%.同时，超高温酸化相的SCOD和TAN分别为 (16 747±2 190) mg·L-1和 (1 858±163) mg·L-1，显著高于原泥的 (6 899±585) mg·L-1和 (522±144) mg·L-1，表明原泥中的部分固体有机物已转化为更容易被微生物吸收利用的溶解性有机物.在随后的高温产甲烷相中，大部分溶解性有机物被降解转化.稳定运行期，酸化相和产甲烷相的pH分别为6.5±0.0和7.8±0.3，TALK (以CaO计) 分别为 (1 650±423) mg·L-1和 (1 903±300) mg·L-1，FAN分别为 (51.4±4.5) mg·L-1和 (118.7±21.8) mg·L-1.
2.2 微生物群落结构表 1列出了各克隆文库的一些重要结构参数.各文库的覆盖度都较高，表明后续分析可靠.两相反应器中基质和环境条件不同，使得微生物群落的多样性不同.酸化相的细菌群落多样性低于产甲烷相，可能是因为随着易降解基质的消耗，难降解基质的降解越来越重要，难降解基质种类比较多，相关的细菌的比重有所上升.产甲烷相的古菌群落多样性低于酸化相，可能是因为产甲烷相的FAN浓度比酸化相高，会抑制乙酸营养型产甲烷古菌Methanosaeta和Methanosarcina等的生长[25].
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表 1 细菌文库和古菌文库的结构 Table 1 Structure of bacterial clone library and archaeal clone library |
2.3 微生物群落的组成 2.3.1 细菌群落的组成
酸化相和产甲烷相中最主要细菌门类都是厚壁菌门 (Firmicutes)，相对丰度分别达到90.3%和94.7%.此外，酸化相还有8.6%和1.1%的细菌分别属于变形菌门 (Proteobacteria) 和纤维杆菌门 (Fibrobacteres)；产甲烷相有2.1%的细菌属于菌门OP9，还有3.2%的细菌不属于目前已知的任何细菌门类，即unassigned.
酸化相和产甲烷相的数量占优的厚壁菌门细菌全都属于梭菌纲 (Clostridia)，但在目水平上的组成存在较大差异，优势菌目分别为热厌氧杆菌目 (Thermoanaerobacterales) 和梭菌目 (Clostridiales)，相对丰度分别为79.8%和62.1%.酸化相和产甲烷相在优势菌目及低丰度菌门上的明显差异，表明在两相中的生物转化过程可能不同.为了更细致地了解具体的转化过程，在属水平上分析了两相的细菌组成 (图 2).
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(a) 超高温酸化相和 (b) 高温产甲烷相；分离出来的扇区代表能够确定菌属分类 图 2 超高温酸化相和高温产甲烷相的细菌组成 (属水平) Fig. 2 Bacterial composition of hyperthermophilic acidogenesis phase and thermophilic methanogenesis phase (genus level) |
(1) 超高温酸化相的细菌群落组成
超高温酸化相的细菌组成见图 2(a).优势菌纲厚壁菌门梭菌纲细菌 (相对丰度达到90.3%) 都能确定菌属分类，分别为热厌氧杆菌目的菌属Coprothermobacter、Thermosediminibacter和Moorella(相对丰度分别为67.7%、10.8%和1.1%)，以及梭菌目的菌属Caldicoprobacter和Tepidimicrobium(相对丰度分别为8.6%和2.2%).其余的细菌则不能确定菌属分类.
菌属Coprothermobacter只有一个菌种，即C. proteolyticus (解蛋白嗜热粪杆菌)，它的最适温度是65℃，能够分解蛋白质产生乙酸、H2和CO2或乙酸和乙醇[26].这类菌已经在多个高温污泥厌氧消化器中被发现，在一个两相厌氧消化系统的热酸化反应器中相对丰度也达到23%[27].蛋白质是本系统进样原泥的主要有机成分，占53.6%，它的分解非常重要.经过超高温酸化相处理，蛋白质浓度降低约30%.蛋白质降解产生的氢和氨氮，也可能对后续的产甲烷相产生重要影响：一方面，氢能促进氢营养型产甲烷菌的生长；另一方面，氨氮浓度从原泥的522 mg·L-1升高到酸化相污泥的1 858 mg·L-1，可能抑制乙酸营养型产甲烷菌的生长[25].
Thermosediminibacter、Caldicoprobacter、Tepidimicrobium和Moorella都能有效利用多种单糖和寡糖，主要产生乙酸或CO2和H2.其中Thermosediminibacter的一些种还能利用酪蛋白的水解产物，Tepidimicrobium的一些种能降解纤维素.
(2) 高温产甲烷相的细菌群落组成
高温产甲烷相的细菌群落组成见图 2(b).优势菌目厚壁菌门梭菌纲梭菌目细菌 (相对丰度62.1%) 都能确定菌属分类，包括Clostridium、Syntrophomonas和Caldicoprobacter，相对丰度分别为46.3%、9.5%和6.3%.梭菌纲细菌中还有一些不能确定菌属分类，它们分属于菌目Natranaerobiales、Thermoanaerobacterales和SHA-98，相对丰度分别为15.8%、8.4%和7.4%，还有1.1%的细菌甚至不能确定菌目分类.低丰度的OP9菌门细菌 (2.1%) 都不能确定菌属分类.
本系统中的Clostridium细菌大多接近于C. thermocellum，这种菌在55~60℃条件下能够有效利用纤维素、纤维二糖、葡萄糖、果糖和山梨糖等[28].此外，Caldicoprobacter菌也能利用简单糖类产生乙酸或CO2和H2.
菌属Syntrophomonas的一些种与氢营养型产甲烷菌Methanospirillum sp.共同培养时，可以利用碳原子数目为4~18个的直链饱和脂肪酸，其中碳原子数为偶数的脂肪酸将被转化为乙酸和甲烷，碳原子数为奇数的脂肪酸将被转化为丙酸和甲烷[29].长链脂肪酸 (LCFAs) 可能会吸附在厌氧微生物的细胞壁/膜上，抑制微生物活性，阻碍厌氧消化过程[30]. LCFAs的降解不但可以减轻抑制，还可以提供更多基质给产甲烷菌，对厌氧消化有利.
本系统中的嗜盐碱厌氧菌目 (Natranaerobiales) 细菌丰度较高，但与已知的菌种相似度较低.目前已知的嗜盐碱厌氧菌基本都耐盐耐热耐碱，菌种仅2类：Natranaerobius thermophiles和Natranaerobaculum magadiense，前者能够利用多种糖类、肽类和氨基酸等，发酵蔗糖主要产生乙酸和甲酸[31]，后者则只能利用肽类，不能利用多糖[32].
2.3.2 古菌群落的组成系统的古菌组成见图 3，菌属Methanothermobacter的优势十分明显，在超高温酸化相和高温产甲烷相中的相对丰度分别为93.0%和100%，超高温酸化相中还有少量的Methanospirillum、Methanosarcina和Methanosaeta.在检出的这4个菌属中，一般被认为Methanosaeta是严格乙酸营养型产甲烷菌；Methanosarcina一般利用乙酸产甲烷，但其中一些种类既可利用乙酸也能利用H2/CO2；Methanothermobacter和Methanospirillum是典型的氢营养型产甲烷菌[33].由于本系统中检出的甲烷几乎都在高温产甲烷相，Methanothermobacter在其中的相对丰度为100%，可以推断本系统中甲烷化过程主要都是通过氢营养型产甲烷菌完成的.在Tang等[34]的干式高温甲烷化消化器中也有类似的结果，检出的古菌90%为氢营养型产甲烷菌，其余的为混合营养型的Methanosarcina，并没有严格乙酸营养型的Methanosaeta.与本系统中氢营养型产甲烷菌绝对占优不同，多数污泥传统厌氧消化系统中占优势的是乙酸营养型产甲烷菌[33]；甚至在戴晓虎等[11]和Liu等[19]的单级中温污泥高固厌氧消化系统中，主要的产甲烷菌都是Methanosarcina，且乙酸裂解产甲烷被认为是主要的甲烷化途径.不过，值得注意的是，Methanosarcina的一些种既能利用乙酸又能利用H2/CO2[33].
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(a) 超高温酸化相和 (b) 高温产甲烷相 图 3 超高温酸化相和高温产甲烷相的古菌组成 (属水平) Fig. 3 Archaeal composition of hyperthermophilic acidogenesis phase and thermophilic methanogenesis phase (genus level) |
本系统中的古菌组成以及产甲烷代谢途径，可能是由基质和运行条件导致的.首先，高固体原泥中含有大量蛋白质，再加上超高温酸化相的高温和分相作用，显著刺激了蛋白质分解菌Corprothermobacter spp.的生长，大量蛋白质被降解，氨氮浓度升高，可能抑制乙酸营养型产甲烷菌的生长，而且这种抑制作用在高温产甲烷相中可能会更加严重，因为其中较高的pH和温度，会使铵离子转化为抑制作用更强的游离氨[22].此外，高温产甲烷相的SRT仅12.5 d，较短的SRT也有利于氢营养型产甲烷菌成为优势菌[33].
3 结论强化两相高固厌氧消化工艺能够有效地处理剩余污泥.酸化相和产甲烷相都存在降解简单糖类的细菌，但其他细菌组成不同，酸化相存在大量降解蛋白质/氨基酸的细菌；产甲烷相则主要是降解纤维素等多糖的细菌，也有一定量的长链脂肪酸细菌.两相古菌组成都较为单一，尤其是在产甲烷相检出的古菌都属于Methanothermobacter，表明系统中的甲烷化主要通过氢营养途径进行.
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