2017, Vol. 38
2. 重庆大学三峡库区生态环境教育部重点实验室, 重庆 400045
2. Key Laboratory of Three Gorges Reservoir Region's Eco-Environment, Ministry of Education, Chongqing University, Chongqing 400045, China
氮是导致水体富营养化的重要原因之一[1].提升废水处理与城市黑臭水体中 (氨) 氮的削减, 已成为我国现阶段水处理领域与水体整治工作的关键问题[2, 3].目前, 许多城镇污水处理厂总氮处理效率欠稳定, 提标难度大的情况普遍存在.另一方面, 由于硝化菌世代周期长, 增殖速率缓慢, 对外界环境条件的变化敏感, 对于寒冷地区相对较低的水温或工业废水相对复杂的水质, 氨氮硝化过程不理想仍然是生物脱氮过程的制约因素[4].如何进一步强化出水中氨氮与总氮的去除, 应对日益严格的氮排放标准, 是现阶段水环境氮负荷削减的紧迫任务.
现阶段污水三级处理或深度处理中强化 (氨) 氮去除的常规单元主要为:曝气生物滤池 (BAF)、生物膜反应器 (MBR)、移动床生物膜反应器 (MBBR) 等[5, 6], 但其存在着不同程度的局限性, 如投资高, 运行管理复杂, 在填料选择优化、运行能耗与技术管理等方面尚待明确等[7, 8].近年来兴起的包埋固定化技术应用于水处理领域已有较多研究报道[9, 10], 结果表明, 该技术在维持较高的微生物浓度[11], 增强固定附着微生物的高效性和耐受性具有优势[12]. Qiao等[13]对活性污泥进行包埋, 针对水中低浓度氨氮 (40 mg·L-1) 强化去除的研究表明, 其氨氮去除率为90%.有研究者[14]采用聚丙烯包埋栅藻用于处理城市污水厂氨氮浓度为3.8~7.6 mg·L-1的二级出水, 去除率约43%.另一方面, 包埋颗粒中的微生物特性对探讨污染物降解过程机制与工艺优化具有重要意义, 现状研究主要针对包埋颗粒内某一特定类型菌株 (硝化菌、反硝化菌以及厌氧氨氧化菌等) 的种属鉴定与特性分析[15~17], 对于包埋活性污泥的微生物群落多样性分析的研究甚少.
本研究采用课题组研发的改性包埋载体制备活性污泥包埋颗粒, 结合深度脱氮的水质特征, 针对不同氨氮 (总氮) 浓度的模拟废水, 进行了包埋颗粒硝化与脱氮特性实验, 并探究改性包埋颗粒内外微生物群落构成的多样性及其与初始包埋污泥微生物种群构成的差异, 旨在为污泥包埋固定化技术在水处理领域的应用提供理论指导.
1 材料与方法 1.1 包埋颗粒的制备 1.1.1 包埋活性污泥的培养驯化以重庆市某城镇污水处理厂生化池的活性污泥作为接种活性污泥, 采用学生宿舍排放的新鲜生活污水并适当添加葡萄糖、奶粉、淀粉、NaHCO3、NH4Cl和NaH2PO4等, 控制进水氨氮浓度为40~50 mg·L-1, COD为150~200 mg·L-1, pH为7.5~8.5, 以间歇方式进行污泥硝化特性的驯化培养.污泥间歇培养15 d后, 其氨氧化速率达0.061 6 mg·(g·min)-1, 污泥的硝化性能良好, 可将污泥离心后待用.
1.1.2 包埋颗粒的制备取聚乙烯醇 (PVA:1750±50)、海藻酸钠 (SA)、纳米氧化铝, 以体积分数分别为10%、0.8%、0.5%均匀混合进行超声处理后, 与体积分数为10%的驯化后污泥混合, 滴入含2%氯化钙的饱和硼酸溶液中, 形成球形颗粒 (φ=3 mm) 于4℃冰箱中放置30 min交联固化后, 颗粒置于0.5 mol·L-1的Na2SO4溶液中储存2 h[18], 颗粒取出用生理盐水清洗, 去离子水中4℃保存.
1.1.3 模拟废水模拟废水的主要成分如表 1所示, 配制为初始氨氮浓度范围为5~40 mg·L-1, TN浓度为10~45 mg·L-1, COD浓度为80~100 mg·L-1.
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表 1 模拟废水组分 Table 1 Components of synthetic wastewater |
1.2 实验装置与测试方法
将制备的改性包埋颗粒以10%的体积填充率分别投入初始氨氮浓度分别为5、15、25、40 mg·L-1的模拟废水中, 采用系列玻璃容器以间歇方式运行, 批次进水量0.5 L, 曝气6 h, 静置15 min后排上清液, 反应系统内溶解氧DO控制在2~4 mg·L-1, pH为7.5~8.5, 室温为10~15℃.各周期结束后分别测定各反应器内NH4+-N、NO2--N、NO3--N、TN、COD浓度.各组实验均设置3个平行实验.采用未包埋污泥的空白颗粒进行对照实验, 其NH4+-N、TN去除效果甚微, 结果分析中予以忽略.
检测方法如下, NH4+-N :纳氏试剂光度法; NO2--N:N-(1-萘基)-乙二胺光度法; NO3--N、TN:紫外分光光度法; DO:LDO便携式溶解氧仪, 哈希, 美国; pH:雷磁PHS-3C, 精科, 上海; COD:DRB200COD消解器, DR1010COD测定仪, 哈希, 美国; SEM:S-3400N扫描电子显微镜, 日立, 日本, 其样品预处理参照文献[13].
1.3 微生物种群多样性分析 1.3.1 DNA提取将样品在冰上融化后, 分别对包埋颗粒与污泥样品进行前处理.颗粒样品转移至15 mL离心管中, 加入5~8 mL灭菌后的双蒸水, 振荡5 min的液体, 离心获得颗粒外部微生物检测样; 再将清洗振荡后的颗粒样品充分研磨均匀得到颗粒内部微生物检测样.将污泥样品充分混匀并离心得到污泥微生物检测样.分别取2 μL上述样品进行检测, 使用试剂盒PowerLyzer PowerSoil DNA Isolation kit (MO Bio Laboratories, Inc., Carlsbad, CA) 对DNA进行提取, 提取后的DNA通过Nanodrop 2000 (Nanodrop Technologies, Wilmington, DE) 测定核酸浓度和纯度.
1.3.2 PCR扩增PCR扩增采用带有条形码的特异引物, 分别为338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′) 和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′), 反应体系为20 μL, 包括10 ng的模板DNA, 各0.8 μL的引物 (5 μmol·L-1), 2 μL的dNTPs, 0.4 μL的FastPfu聚合酶以及4 μL的5×FastPfu缓冲液. PCR扩增步骤为: 95℃预变性3 min; 94℃变性30 s (27个循环), 55℃退火30 s, 72℃延伸45 s (27个循环); 最后72℃延长10 min.全部样本按照正式试验条件进行, 每个样本3个重复, 将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖凝胶电泳检测, 使用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒 (AXYGEN公司) 切胶回收PCR产物, Tris-HCl洗脱; 2%琼脂糖电泳检测.参照电泳初步定量结果, 将PCR产物用QuantiFluorTM-ST蓝色荧光定量系统 (Promega公司) 进行检测定量.利用PCR扩增进行文库模板的富集, 构建测序文库, 然后在Illumina MiSeq PE300平台上进行测序, 测序在上海美吉生物医药科技有限公司进行.
2 结果与讨论 2.1 包埋颗粒处理氨氮废水的脱氮效能分析 2.1.1 氨氮与总氮的去除特性不同初始氮浓度的SBR反应器连续运行30个周期, 进、出水中各形态氮的变化如图 1所示.
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(a) 硝化特性; (b) 总氮去除特性; Ⅰ. NH4+-N =5 mg·L-1, TN0=10 mg·L-1; Ⅱ. NH4+-N =15 mg·L-1, TN0=20 mg·L-1; Ⅲ. NH4+-N =25 mg·L-1, TN0=30 mg·L-1; Ⅳ. NH4+-N =40 mg·L-1, TN0=45 mg·L-1 图 1 包埋颗粒处理模拟废水各形态氮的变化 Fig. 1 Changes in various forms of nitrogen of the embedding beads in the synthetic wastewater |
由图 1(a)可知, 当初始氨氮浓度为5~40 mg·L-1时, 颗粒的反应周期随着初始浓度的增加而增大, 分别在第2、12、16、27个周期氨氮去除率达到稳定, 稳定期最大氨氮去除负荷分别为9.63、25.08、42.65和59.58 mg·(L·h)-1.初始氨氮浓度为5~25 mg·L-1时, 稳定期出水氨氮去除率接近100%, 初始氨氮浓度为40 mg·L-1时, 稳定期出水氨氮去除率为89.24%.
图 1(b)中, 各初始浓度条件下, 稳定期出水TN浓度范围为7.01~38.34 mg·L-1, 去除率范围为22.25%~43.74%, 最大总氮去除负荷为7.78~23.18 mg·(L·h)-1.系统中TN的去除主要是微生物增殖同化消耗以及包埋污泥中反硝化过程.在初始TN浓度低于30 mg·L-1时, TN去除效能良好, 稳定期TN的最大去除率分别为42.38%、42.28%和44.93%, 高于传统生物好氧系统中的总氮去除率.尽管系统属于好氧环境, 但由于颗粒形成从外到内的DO浓度梯度及一定的缺氧微环境, 可能导致同时硝化反硝化现象发生.当初始总氮浓度为45 mg·L-1时, 稳定期TN的去除率仅为26.99%, 系统中的有机碳源、pH、碱度和溶解氧等均是可能的影响因素[19], 较低的C/N比导致异养反硝化菌生长所需营养不足, 对初始TN浓度较高时应适当补充碳源.
2.1.2 硝化特性分析当初始氨氮浓度为5 mg·L-1 [图 1(a)中Ⅰ], 第2个周期出水未有NO2--N检出; 初始氨氮浓度增加至40 mg·L-1时[图 1(a)中Ⅱ~Ⅳ], 出水NO2--N呈现先升高后下降的趋势, 其中初始氨氮浓度为15 mg·L-1和25 mg·L-1时, 稳定期时出水中NO2--N均能完全转化为硝酸盐; 初始氨氮浓度为40 mg·L-1时, NO2--N最高达到21.23 mg·L-1, 稳定期出水中NO2--N为11.65 mg·L-1, NO2--N存在明显积累.其原因主要由于系统中低溶解氧浓度和游离氨 (FA) 的存在[20, 21]. Anthonisen等[22]研究表明, FA对氨氧化菌 (AOB) 的抑制浓度为10~150 mg·L-1, 对亚硝酸盐氧化菌 (NOB) 的抑制浓度为0.1~1.0 mg·L-1.实验条件下, 初始氨氮浓度为40 mg·L-1时, 稳定期出水中FA为0.79 mg·L-1, 对NOB的活性存在抑制; 另一方面, 受DO在颗粒中的扩散限制, 其内部形成低溶解氧环境, 由于AOB的氧利用能力较NOB强, NOB的竞争生长会受到抑制[23], You等[24]也发现, 相比于NOB, AOB能提供更多的能量用于细胞生长繁殖, 尤其是初始氨氮浓度较高时, 亚硝酸盐积累现象表现得较为明显.
2.2 微生物特性 2.2.1 SEM观察图 2为稳定期包埋颗粒的切面与表面的SEM图.
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(a) 稳定期包埋颗粒的切面; (b) 稳定期包埋颗粒的表面; 放大倍数为10 000× 图 2 包埋颗粒扫描电镜图 Fig. 2 SEM images of embedding beads |
由图 2可知, 稳定期包埋颗粒内具有良好的孔隙度, 活性污泥以团状形式负载在孔道内, 形成了致密的网状结构, 有利于氧气和营养物质的传输.颗粒表面凹凸不平, 具有明显的生物膜附着, 颗粒表面富集有球状菌、杆状菌等, 充分表明包埋颗粒已成为微生物的良好载体.由于颗粒内外的溶解氧浓度梯度, 使得好氧菌易于分布在颗粒表层及浅表层, 同时, 微生物细胞分泌的高蛋白黏附分子以及多糖等胞外聚合物 (EPSs) 疏松地附着在细胞壁表面, 也能够有助于发生基质的吸附效应. Qiao等[13]通过SEM发现在颗粒的表面有较多丝状和杆状的细菌富集. Bae等[23]对PVA包埋颗粒的ESEM观测到, 载体表面细菌聚合物主要是由细菌和胞外聚合物 (EPSs) 组成, EPSs能帮助AOB更好地附着, 并稳定地进行亚硝化反应.
2.2.2 微生物种群多样性分析通常采用Chao和Ace来计算菌群丰度, 采用Simpson和Shannon指数表征菌群的α-多样性. Coverage为各样本文库的覆盖率, 其数值越高, 则样本中序列被测出的概率越高.
表 2为初始包埋活性污泥与包埋颗粒的α-多样性指数分析.从中可知, 每个样品获得23 799个序列, 覆盖率均为0.99以上, 数据可信度高.多样性指数分析结果表明, 包埋活性污泥的菌群丰度及多样性指数均高于稳定期包埋颗粒的菌群丰度及多样性指数, 这主要是微生物生存环境条件差异的选择结果.氨氮浓度分别为5 mg·L-1、40 mg·L-1条件下, 包埋颗粒内部的菌群丰度和多样性指数相当, 表明了包埋固定化有利于微生物优势菌属的选择.同时, 包埋颗粒外部仍然具有较好的菌群丰度和多样性, 说明包埋颗粒在水处理中可成为良好的微生物载体, 且较5 mg·L-1初始氨氮浓度, 在40 mg·L-1氨氮浓度条件下, 包埋颗粒外部的菌群数更丰富.
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表 2 微生物的α-多样性指数分析1) Table 2 Alpha diversity indices of microbial communities |
2.2.3 微生物群落构成特性
图 3为不同氨氮浓度条件下, 包埋颗粒内外微生物群落构成在纲水平下的变化.
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图 3 包埋颗粒的微生物群落变化 (分类为纲) Fig. 3 Changes in microbial community structure of embedding beads (class level) |
根据图 3所示, 纤维黏网菌纲 (Cytophagia) 和芽孢杆菌纲 (Bacilli) 在包埋颗粒外部的相对丰度较高, 丰佑菌纲 (Opitutae) 和酸杆菌纲 (Acidobacteria) 则在颗粒内部的相对丰度较高, 这是由于包埋颗粒内外存在溶氧梯度, 导致包埋颗粒内外微生物群落构成特性的差异.观察不同氨氮浓度条件下包埋颗粒的微生物群落构成, 发现β-变形菌纲 (β-Proteobacteria) 在5 mg·L-1氨氮浓度下的包埋颗粒中占优 (分别为45.62%和50.58%), γ-变形菌纲 (γ-Proteobacteia)、δ-变形菌纲 (δ-proteobacteria) 和黄杆菌纲 (Flavobacteria) 则在40 mg·L-1氨氮浓度下的包埋颗粒内部和外部相对丰度较高, 分别为10.91%和15.07%、10.22%和8.33%、2.68%和1.56%.有研究表明[25, 26], γ-变形菌主要参与碳和氮的氧化, β-变形菌通常为好氧或兼性好氧菌, 能以有机物作为电子供体, 是污水处理过程中有机物降解的主要参与者, 且β-变形菌在活性污泥系统的脱氮反应器中比较丰富, 因此包埋颗粒中微生物群落的变化可能与系统中C/N比有关.
2.2.4 功能微生物分析传统生物脱氮过程分为硝化作用和反硝化作用, 其中硝化作用中起作用的微生物为AOB和NOB, 主要为自养菌, 而反硝化菌主要是异养型微生物.包埋颗粒功能微生物的相对丰度见表 3所示.
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表 3 功能微生物的相对丰度 Table 3 Relative abundance of functional microorganisms |
实验条件下, 包埋颗粒中存在的AOB为Nitrosomonadaceae_uncultured和Nitrosomonas, 均属于β-变形菌纲.其中, Nitrosomonas在40 mg·L-1氨氮浓度下的包埋颗粒中占优, 从菌属特征层面证实了上述实验中出现的亚硝酸盐积累现象.而NOB主要是Nitrospira, 属于硝化螺旋菌门, 其在包埋颗粒中的相对丰度较低, 主要是因为包埋颗粒内外存在DO浓度梯度, 在低溶解氧环境下, NOB的生长会受到抑制.同时, 在5 mg·L-1氨氮浓度下的包埋颗粒内外均发现了Arthrobacter[27]和Alcaligenaceae_uncultured[28]这两种异养硝化菌, 其相对丰度均高于40 mg·L-1氨氮浓度下的包埋颗粒, 这主要是因为在5 mg·L-1氨氮浓度条件下的C/N比较高 (8~10), 异养硝化菌在竞争中占优, 导致自养硝化菌生长受到抑制, 而40 mg·L-1氨氮浓度下的C/N较低 (1.78~2.22), 异养菌生长受到一定程度的抑制.另一方面, 有研究表明[28], Alcaligenaceae_uncultured同时具备好氧反硝化特性.包埋颗粒中存在的反硝化菌主要有Comamonadaceae _ unclassified、Thauera、Rhodocyclaceae _ unclassified、Hydrogenophaga、Acidovorax等.其中, Comamonadaceae_unclassified被报道具有异养硝化-好氧反硝化能力[29, 30].本实验中, 氨氮初始浓度为5mg·L-1条件下, C/N较高 (8~10), 且包埋颗粒中Comamonadaceae_unclassified的相对丰度可观, 推测体系中可能存在异养硝化或好氧反硝化现象, 对体系中TN的去除具有强化促进效应.
3 结论(1) 采用改性聚乙烯醇-海藻酸钠制备包埋颗粒, 处理初始氨氮浓度为5~40 mg·L-1, C/N比为1.78~10的模拟废水, 稳定期包埋颗粒最大氨氮去除负荷为9.63~59.58 mg·(L·h)-1, 氨氮去除率达到89%~100%, 总氮去除率为22.25%~44.93%.
(2) 包埋颗粒内部具有致密的网状结构, 各孔道内均有良好的活性污泥微生物附着生长, 且在包埋颗粒表面有大量球状菌、丝状菌附着, 也成为微生物的良好载体.微生物特性实验表明, 较新鲜包埋污泥, 包埋颗粒的微生物多样性得到保持, 且包埋颗粒内微生物优势菌属特征显著.
(3) 包埋颗粒内大量的硝化和反硝化菌属生长良好, 为深度处理的强化脱氮提供了微生物学基础.包埋颗粒中具有Alcaligenaceae_uncultured、Comamonadaceae_unclassified等菌属, 推测颗粒内可能存在异养硝化-好氧反硝化菌属, 拓展了包埋系统中非传统的脱氮途径.
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