2017, Vol. 38
2. 东华大学环境科学与工程学院, 上海 201620
2. College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China
随着我国环境问题的日益凸现，工业废水和生活污水厌氧生物处理技术受到越来越多关注[1~3].与好氧生物处理技术相比，厌氧生物处理技术具有占地面积小、污泥产率系数低、运行费用少和可回收能源等优点[4].随着第三代高效厌氧反应器的发展，厌氧生物处理技术在废水处理领域已经得到了广泛应用，并取得了良好的应用效果[5].
一般来讲，厌氧反应器处理高浓度有机废水具有天然优势，较高的污泥浓度可以保证反应器在高容积负荷条件下稳定运行，高浓度有机物为微生物提供了充足的代谢基质，产生的大量甲烷气体同时有利于促进系统内的传质作用[6~8].但对于处理污染物浓度较低的城市生活污水，厌氧反应器的容积负荷和污泥负荷均明显降低，在低负荷条件下，厌氧反应器的运行特征和微生物代谢特性均可能发生较大改变，如低基质浓度条件下颗粒污泥由于营养物质的匮乏是否会出现解体和絮状化，进而反应器对污染物去除效率是否会明显降低等这些不确定性，意味着实现厌氧反应器高效率处理城市生活污水依然具有较大的挑战性[9, 10].
本实验采用自主研发的强化循环厌氧反应器 (SCAR) 处理模拟城市生活污水，在稳定的上升流速 (Vup) 条件下，研究厌氧生物处理城市生活污水的可行性和反应器的运行特性. SCAR反应器在空间上将反应器分为主体反应区和精细反应区，并通过外循环作用改善反应器的传质作用.本实验考察了HRT对反应器处理效能的影响，探讨反应器运行过程中颗粒污泥的粒径分布、SMA和辅酶F420及EPS等污泥性状的变化特征，并借助高通量测序技术分析反应器不同时空条件下微生物菌群结构分布特点及其演变过程.本实验结果可为验证厌氧生物处理城市生活污水的可行性提供依据，有利于拓展厌氧生物处理的应用领域，以期为城市生活污水处理带来高效、低能耗、低占地面积的新途径.
1 材料与方法 1.1 实验用水本实验使用的模拟城市生活污水，COD浓度在450 mg·L-1左右，氨氮和总氮浓度分别为28 mg·L-1、57 mg·L-1左右，总磷5 mg·L-1左右；配制生活污水的主要成分如下 (mg·L-1)[1, 11, 12]：蔗糖，200；马铃薯淀粉，100；奶粉，30；蛋白胨，100；豆油，10；牛肉汁，30；尿素，5；NH4Cl，100；K2HPO4，20；CaCl2，5；FeSO4·7H2O，5.8；MgSO4·7H2O, 6，同时加入适量的微量元素.为了使模拟生活污水具有一定的pH缓冲能力，加入适量的NaHCO3.
1.2 接种污泥本实验接种泥取自某造纸厂IC反应器中的厌氧颗粒污泥.污泥的平均粒径为2.19 mm，MLSS为48.45 g·L-1，MLVSS/MLSS为0.79，沉降性能良好.在反应器启动前，接入28 L的接种污泥，约占反应器总容积的2/5.
1.3 实验装置与运行程序本实验装置如图 1所示.
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图 1 SCAR处理生活污水流程示意 Fig. 1 Schematic diagram of the SCAR system treating municipal wastewater |
SCAR由有机玻璃加工而成，直径0.2 m，高2.0 m，有效容积70 L.反应器自下而上设5个取样口，各个取样口距离反应器底端距离分别为25、60、100、140和170 cm，分别命名为A号、B号、C号、D号、E号取样口.生活污水经计量泵从底部进入反应器，通过反应器主体反应区和精细反应区处理后由出口排出；外循环污水通过恒温水浴箱加热，维持反应器内部温度在30℃±1℃；三相分离器分离排出的气体经湿式气体流量计计量后排放.
反应器共运行120 d，由100 d运行阶段和20 d恢复阶段组成.实验过程中，关闭反应器的内循环，只通过外循环泵控制系统的循环量，维持污水在反应器中的上升流速 (Vup为空塔速度) 为4 m·h-1的条件下运行，并以缩短HRT的方式逐步提高反应器容积负荷[4, 5, 12, 13].
1.4 分析项目及方法COD、MLSS、MLVSS的测定采用标准方法[14]；辅酶F420：紫外分光光度法[15]；产甲烷活性 (SMA) 采用史氏发酵法[12]；颗粒污泥粒径分布采用筛分法[16]；挥发性脂肪酸 (VFAS) 测定采用气相色谱法测定 (气相色谱仪：gc7890，15 m×0.53 mm FFAP)，测样前甲酸酸化 (pH < 2)；厌氧颗粒污泥的胞外聚合物 (EPS) 采用热提法进行提取[17]，多糖含量采用蒽酮-硫酸法测量[18]，蛋白质含量采用BCA法测量[19].
采用高通量测序技术进行基因组测序.首先采用E. Z. N. ATM Mag-Bind Soil DNA Kit (OMEGA) 提取总DNA.利用Qubit2.0 DNA (Life) 检测试剂盒对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应应加入的DNA量.扩增对象为16S rDNA 的V3-V4区.细菌PCR扩增所用的引物为通用引物341F-805R；古菌通过巢式PCR扩增，第一轮扩增所用引物为M-349F，GU1ST-1000R，第二轮PCR所用的引物为通用引物349F-806R. PCR实验结束后，其产物进行琼脂糖电泳检测，然后用磁珠法进行纯化回收.最后利用Qubit2.0 DNA检测试剂盒对回收产物精确定量，按照1:1的等量混合后取样上机测序，测序由上海生工生物工程公司完成.对测序结果进行分析处理，首先通过Barcode (标签序列) 区分样品序列，并对各样本序列进行质量控制，去除非靶区域的序列及嵌合体.然后基于97%相似度下进行OTU (操作分类单元) 聚类，获取每一个OTU的代表性序列，通过RDP分析进行物种注释，计算每个样本在不同分类等级下的相对丰度.最后绘制物种丰度图.
2 结果与讨论 2.1 不同负荷条件下SCAR的处理效能SCAR中接种厌氧颗粒污泥，在HRT=15 h、反应器容积负荷为0.7 kg·(m3·d)-1条件下启动反应器.反应器启动后的前20 d内，反应器对污染物的去除效率随时间基本呈现高低起伏，但总体上呈逐渐增加趋势，至20 d时污水COD去除效率基本稳定在75%左右，另外反应器出水中仅含少量VFAs，实现了对SCAR的启动运行.
通过改变HRT，将SCAR的容积负荷分4个阶段逐渐由0.7 kg·(m3·d)-1提升至0.89、1.18、1.77及2.7 kg·(m3·d)-1，对应HRT分别为12、9、6和4 h.由图 2(a)可见，在HRT分别为12、9和6 h时，每次提高容积负荷后的1~3 d内，由于代谢底物量的增加和负荷改变对微生物空间相对位置的扰动，反应器对污水COD去除效果变差，但随着反应器的运行，微生物逐渐适应了新的负荷条件，污水COD去除率逐渐回升.而随着HRT的缩短，减少了代谢底物的生化反应时间，反应器对污水COD的平均去除率会有所降低，但下降幅度较小，反应器对COD平均去除率基本可以维持在75%以上.随着污水HRT降低至4 h，在此条件下运行的20 d内，反应器出水平均COD由107 mg·L-1提高到209 mg·L-1，COD去除率由75.3%降低到50.8%，而且出水中一直含有大量VFAs，这说明较短的HRT无法满足厌氧酸化作用生成的有机酸类物质进行充分碱性发酵所需的反应时间.随后将HRT调至12 h，反应器运行状况迅速好转，COD去除率很快回升到75%左右.由此可见，在保证代谢基质充分生物降解时间条件下，SCAR反应器对一定范围内变化的容积负荷具有良好的适应能力；本实验条件下，HRT=6 h可以保证SCAR对生活污水具有良好的处理效率.
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(a) 进出水COD、COD去除率、进水负荷；(b) 挥发性脂肪酸 图 2 SCAR在不同HRT条件下的处理效果和运行状况 Fig. 2 Performance of SCAR under different HRT conditions |
在有机物厌氧生物降解过程中，VFAs的产生主要和进水水质、反应器类型以及HRT等有关[20].由图 2(b)可见，随着反应器HRT的减小和容积负荷的提高，反应器出水中的VFAs含量也相应增加，分析其原因有二，其一是代谢底物量的增加，其二是碱性发酵时间的缩短；HRT为15、12、9和6 h时，反应器可以实现对生成有机酸的充分代谢，但HRT为4 h时，VFAs开始出现明显积累，尤其乙酸含量的增加特别明显.这表明，较短的HRT可以充分完成对生活污水代谢底物的水解酸化过程，但是实现充分的碱性发酵作用必须要保证一定的代谢反应时间，产甲烷的碱性发酵过程是厌氧反应的限制阶段[21].在图 2(b)还可以看见，在充足的HRT条件下 (HRT不小于6 h)，反应器出水中均有乙酸或者丁酸出现，而未检测出丙酸和戊酸.根据甲烷细菌代谢底物类型的不同，可以将产甲烷生化代谢分为还原CO2途径、乙酸途径和甲基营养途径[22]；由此可以推测碱性发酵过程中酸类物质的可能代谢途径：丙酸通过裂解生成甲基和乙酸，而戊酸裂解生成甲基和丁酸，而生成的甲基和部分乙酸进入乙酸途径被代谢，从而造成了系统中乙酸和丁酸的少量累积.
2.2 不同负荷条件下SCAR反应器颗粒污泥的特性 2.2.1 各阶段污泥的粒径分布和污泥浓度的比较粒径分布是反映厌氧颗粒污泥特性的重要参数之一，粒径大小影响着微生物分布状况与有机物的传质效果，也可以反映出污泥的营养状况[3]；SCAR运行期间反应器主体反应区颗粒污泥粒径 (φ) 分布和污泥浓度随HRT的变化情况见图 3.
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图 3 SCAR运行过程中的粒径分布和污泥浓度的变化情况 Fig. 3 Particles size distribution and sludge concentration of the SCAR system during the operation process |
在接种的颗粒污泥中，φ>1 mm的颗粒污泥比例占90%，φ>2 mm的颗粒污泥比例占60%；在HRT=12 h运行阶段，φ>1 mm的比例降至80%，φ>2 mm的比例下降至47%；HRT=6 h时，φ>1 mm的比例回升至81%，粒径在1~2 mm间的颗粒污泥已经由接种时的30%提高至44%；HRT=4 h时，φ>1 mm的比例已经提高至86%，其中φ1~2 mm的污泥已经占了52%，而且φ < 1 mm的比例相比前一个周期也降低了5%.整个实验期间，颗粒污泥粒径变化的基本趋势是小颗粒 (φ < 1 mm) 与大颗粒污泥 (φ>2 mm) 逐渐减小，而中间粒径污泥 (φ在1~2 mm之间) 的量逐渐增多.反应器运行前期接种泥粒径较大，低浓度的生活污水提供的营养不足，大颗粒污泥因为得不到充分代谢底物容易在内部形成空腔，进而破碎形成较小粒径污泥；营养物质进入小粒径颗粒污泥时阻力相对较小，小颗粒污泥容易成长，而更加细小污泥在较高上升流速 (Vup) 条件下也容易被洗出，这些综合作用造成了中间粒径颗粒污泥比例的增加.
随着容积负荷提高，反应器污泥浓度变化和φ>1 mm颗粒污泥变化趋势一致.在反应器启动阶段，主体反应区接种泥浓度为52.19 g·L-1，在进水负荷较低条件下，微生物负荷较低，内源呼吸作用处于主导地位，反应器运行10 d后污泥浓度急剧下降至45.34 g·L-1，在HRT=9 h阶段反应器污泥浓度最低下降到39.29 g·L-1.但HRT=6 h时，随着污泥负荷的增加，系统微生物量呈现增加状态，污泥浓度回升至46.15 g·L-1.在本实验条件下，HRT=6 h可以确保SCAR系统污泥具有良好的稳定性，同时实现对污染物具有较高的去除效率.
2.2.2 颗粒污泥SMA与辅酶F420的比较辅酶F420和产甲烷活性 (SMA) 是衡量产甲烷菌数量和活性的重要指标[15, 23]；不同HRT条件下反应器主体反应区 (A区) 和精细反应区 (D区) 污泥的辅酶F420和SMA变化情况见图 4.
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图 4 不同停留时间下颗粒污泥的产甲烷活性和辅酶F420含量 Fig. 4 Variation of specific methanogenic activity and coenzyme F420of granular sludge with HRT |
由图 4可见，反应器启动运行后，在适应期主体反应区 (A区) 和精细反应区 (D区) 微生物辅酶F420和SMA均出现降低.而随着反应器的运行，微生物逐渐适应了新环境，随着HRT的减少和容积负荷的增加，辅酶F420和SMA基本是逐渐增加趋势 (除HRT由6 h缩短至4 h时，精细反应区的辅酶F420有所降低；可能是反应时间太短，来不及反应的酸性物质累积对辅酶F420产生了抑制作用).一方面，污泥负荷的增加为微生物代谢提供了更多的代谢基质，促进了颗粒污泥活性的提高，另一方面，颗粒污泥粒径的变化也同样影响着污泥活性，适当的粒径分布既可以保证产甲烷细菌的固定化状态，也有利于代谢基质和厌氧代谢产物向颗粒污泥内部和外部的输送.在图 4中，反应器上部 (D区) 的SMA和辅酶含量显著高于底部 (A区)，精细反应区的设置强化了反应器的产甲烷作用.
2.2.3 各阶段颗粒污泥的EPS比较胞外聚合物 (EPS) 是由微生物分泌的一种复杂高分子混合物，主要成分是多糖 (PS)、蛋白质 (PN)、核酸等大分子物质.对于厌氧颗粒污泥而言，EPS在颗粒污泥的形成和维持颗粒污泥结构稳定性方面起着重要作用[24].实验期间，反应器稳定运行时不同HRT条件下厌氧颗粒污泥EPS[包括黏液层EPS (S-EPS)、松散附着EPS (LB-EPS)、紧密黏附EPS (TB-EPS)]含量状况见图 5.
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图 5 接种污泥和反应器不同HRT条件下污泥EPS的含量 Fig. 5 EPS content in the inoculum and granules of SCAR at different HRT |
由图 5可见，反应器启动运行后，颗粒污泥EPS含量较接种污泥出现较大幅度降低，随着反应器容积负荷的提高，颗粒污泥EPS含量基本呈现增长态势，特别是TB-EPS增长明显.在HRT=15 h运行条件下，污泥负荷低，在微生物营养严重不足条件下，3种EPS均可以作为营养源供给微生物的新陈代谢作用，此时反应器中颗粒污泥的EPS含量与接种泥相比明显减少，其中TB-EPS含量下降到最低的4.48 mg·g-1；污水较大上升流速形成的水力冲刷也为EPS的流失提供了条件.随着反应器污泥负荷逐渐增大，颗粒污泥S-EPS、LB-EPS、TB-EPS浓度均不断增加，营养条件的改善是颗粒污泥EPS浓度增加的主要原因.
TB-EPS位于颗粒污泥内部，对于维系细胞间良好黏附能力和保证颗粒污泥稳定性作用明显[25].随着容积负荷的增加，TB-EPS含量较HRT=15 h时的4.48 mg·g-1有明显增长，在HRT=4 h时提高至10.19 mg·g-1.颗粒污泥的稳定性同时也受到EPS中PN和PS比值的影响[24~26]，在反应器运行的前4个阶段 (HRT为15、12、9和6 h)，随着污泥负荷的不断提高，EPS中蛋白质含量逐渐上升，多糖含量变化并不明显，PN/PS比值逐渐增高，这4个运行阶段中颗粒污泥性状逐渐改善；当HRT=4 h时，EPS中多糖含量显著增加导致PN/PS的比值明显降低，其中TB-EPS中PN/PS的比值由HRT=6 h时的4.36下降到1.27，此时的反应器运行效果明显变差.在HRT=4 h条件下，LB-EPS含量增加特别明显，由HRT=6 h时的2.07 mg·g-1提高至5.38 mg·g-1，较丰富的营养物质使微生物代谢能力增强，分泌出更多的EPS，但是LB-EPS中多糖含量的增加，多糖的亲水特性不利于颗粒污泥的沉降，使细小污泥易于被水流带出反应器[25, 26].
2.3 不同负荷条件下微生物群落的高通量测序分析为了探究容积负荷对反应器中微生物群落分布的影响，分别对反应器接种污泥HRT=12 h及HRT=6 h条件下反应器的主体反应区和精细反应区污泥样本进行高通量测序分析，结果如图 6、图 7；图 8为HRT=12 h和HRT=6 h条件下，反应器不同高度处的乙酸浓度.
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A1:HRT=12 h, A区；D1:HRT=12 h, D区；A2:HRT=6 h, A区；D2:HRT=6 h, D区 图 6 细菌门的相对丰度 Fig. 6 Relative abundance of bacterial phyla |
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A1:HRT=12 h, A区；D1:HRT=12 h, D区；A2:HRT=6 h, A区；D2:HRT=6 h, D区 图 7 古菌属的相对丰度 Fig. 7 Relative abundance of archaeal genera |
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图 8 SCAR不同高度下的乙酸含量 Fig. 8 Variations of acetic acid along the height of SCAR |
由图 6可见，在接种污泥的细菌门水平菌群分布中，主要有绿弯菌 (Chloroflexi)、拟杆菌 (Bacteroidetes)、厚壁菌 (Firmicutes)、变形菌 (Proteobacteria) 等优势菌，随着水力停留时间的改变，这些细菌始终保持优势地位.通常认为优势细菌的相对丰度会随反应器的空间位置及负荷的升高而改变，如Ambuchi等[27]研究EGSB (expanded granular sludge bed) 处理制糖废水时发现在反应器的底部和上部的主要优势菌种分别是绿弯菌 (Chloroflexi) 和厚壁菌 (Firmicutes)；而Liao等[28]研究EGSB处理高氮废水时主要优势菌种为变形菌 (Proteobacteria).本研究中，当HRT由12 h缩短至6 h时 (图 6中)，反应器主体反应区的绿弯菌 (Chloroflexi) 优势在减弱，相对丰度由开始的28.89%降低16.49%，而变形菌 (Proteobacteria) 的优势在增强，相对丰度由开始的17.96%提高至26.43%，反应器精细反应区菌群分布也有相同变化趋势.可能的原因有二，其一是绿弯菌 (Chloroflexi) 是严格厌氧细菌，随着进水流量的增加，进水中少量溶解氧可能对绿弯菌 (Chloroflexi) 产生抑制作用，但对于变形菌门细菌来说，兼性环境对其生长有促进作用[29]；其二是实验条件下变形菌 (Proteobacteria) 较绿弯菌 (Chloroflexi) 世代时间短，在较充分营养条件下实现了更多增殖.
反应器接种污泥中古菌的优势菌分布较广，在古菌的属水平分布中，主要有甲烷鬓菌属 (Methanosaeta sp.，相对丰度为36.2%)、甲烷绳菌属 (Methanolinea sp., 相对丰度为29.1%)、甲烷八叠球菌属 (Methanosarcina sp.，相对丰度为9.7%)、第七产甲烷古菌属 (Methanomassiliicoccus，相对丰度为4.2%)、甲烷杆菌属 (Methanobacterium，相对丰度为4.9%) 以及其它一些菌属.实验期间，甲烷鬓菌属 (Methanosaeta sp.) 和甲烷绳菌属 (Methanolinea sp.) 一直为主要优势菌种，二者相对丰度之和大于50%，甚至超过80%. Chelliapan等[21]的研究也显示厌氧反应器的容积负荷范围为0.86~1.86 kg·(m3·d)-1时甲烷鬓菌是反应器运行过程中的主导微生物.甲烷鬓菌 (Methanosaeta) 是一种典型的乙酸营养型细菌，对厌氧反应器的稳定运行起着重要作用[1, 30~33].当HRT=12 h，进水容积负荷较低，营养不足，反应器上部乙酸含量较少，甲烷鬓菌属 (Methanosaeta) 很难利用到乙酸底物，相对丰度降至16.08%，优势逐渐减弱，当HRT=6 h，容积负荷提高，反应器上部的乙酸含量明显增加，甲烷鬓菌属 (Methanosaeta) 又恢复成为绝对的优势菌种 (相对丰度为75.58%). Siggins等[34]研究EGSB反应器处理三氯乙烯废水发现，VFA (主要是乙酸) 出现积累时甲烷鬓菌 (Methanosaeta) 是主导微生物.在图 8中，两种负荷条件下SCAR反应器主体反应区的乙酸含量均较高 (均超过80 mg·L-1)，主体反应区内甲烷鬓菌属 (Methanosaeta) 相对丰度在两种负荷条件下几乎相同，而精细反应区的乙酸含量差别较大，在2 m高度处、HRT=12 h条件下乙酸仅为约15 mg·L-1，而HRT=6 h条件下乙酸浓度约为40 mg·L-1，对应着后者条件下精细反应区内甲烷鬓菌属 (Methanosaeta) 相对丰度远高于前者，由此可见，当乙酸浓度小于某一浓度时 (本实验为15 mg·L-1)，甲烷鬓菌属 (Methanosaeta) 相对丰度会产生巨大变化. Wang等[35]研究EGSB处理养猪废水时容积负荷提高到10 kg·(m3·d)-1，乙酸营养型产甲烷菌才能转化成氢营养型产甲烷菌.但本研究中，甲烷绳菌属 (Methanolinea) 属于氢营养型产甲烷菌[30]，较低负荷条件下反应器产生的乙酸量较少，乙酸营养型产甲烷鬓菌 (Methanosaeta) 很难占据主导地位，氢营养型甲烷绳菌优势地位明显.
不同负荷条件下、反应器不同反应区菌群分布的差异，说明反应器在空间上实现了微生物功能分区，即微生物相分离[36]；结合图 4中反应器主反应区产甲烷活性 (SMA) 和辅酶F420低于上部精处理区的现象，证明了厌氧反应器设置精处理区的重要性和必要性.
3 结论(1) SCAR处理生活污水，污水在反应器中的上升流速为4 m·h-1，在30℃条件下连续运行.随着反应器容积负荷的提高，颗粒污泥产甲烷活性 (SMA) 和辅酶F420活性均增加，而且反应器上部厌氧污泥活性明显高于底部.在HRT=6 h、容积负荷为1.77 kg·(m3·d)-1条件下，COD去除率能达到75%以上，颗粒污泥性状良好；当HRT缩短至4 h，反应器出水中VFAs出现积累，水质恶化.
(2) 随着容积负荷的提高，颗粒污泥的平均粒径有逐渐变小趋势，但φ1~2 mm的污泥比例逐渐增多，粒径分布最终趋于稳定.颗粒污泥胞外聚合物 (EPS) 含量不断增加，尤其是TB-EPS增加明显，较充分的营养条件和对污染物良好的去除效率，使EPS中的蛋白质 (PN) 含量显著增加.
(3) 污泥样品的高通量测序分析表明，容积负荷的改变不仅影响着微生物菌落的结构分布，而且也改变着不同微生物在反应器的空间分布.随着污泥负荷的增加，细菌门水平菌群分布中绿弯菌 (Chloroflexi) 的优势地位在减弱，变形菌 (Proteobacteria) 的优势地位在增强，而古菌的菌群分布中甲烷绳菌属 (Methanolinea sp.) 优势位置逐渐减弱，甲烷鬓菌属 (Methanosaeta sp.) 优势地位逐渐增强.
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