2017, Vol. 38
2. 北京碧水源科技股份有限公司, 北京 100084
2. Beijing Origin Water Technology Co., Ltd., Beijing 100084, China
再生水回用是解决城市水资源危机的必然途径[1].作为再生水水源的城市污水处理厂尾水中仍有一定浓度的氮、磷含量，严重影响再生水的品质及其使用价值[2].因此为了确保再生水品质有必要对城市污水处理厂尾水进行深度脱氮除磷处理.然而城市污水处理厂尾水存在C/N比低和工艺实现同步脱氮除磷较为困难等问题[3].
固相纤维素碳源玉米芯因实现了低C/N比尾水深度反硝化脱氮而备受关注[4, 5].然而，单纯以玉米芯作为反应器填料难以实现反硝化脱氮同步高效除磷.有研究表明[3, 6, 7]，硫磺与海绵铁混合而成的硫铁复合填料在低C/N比尾水深度脱氮除磷方面具有独特的优势.将纤维素碳源玉米芯与硫铁复合填料有机结合构造出固相纤维素碳源+硫铁填料脱氮除磷复合系统 (solid carbon source of cellulose and sulfur/sponge iron process，SCSC-S/Fe复合系统)，将实现低C/N比尾水深度反硝化脱氮同步除磷的目的.
温度是影响微生物生命活动的重要因素之一.在一定温度范围内，随温度升高胞内酶活性、细胞膜的流动性逐渐增强，微生物种群数量增多[8].赵文莉等[9]研究发现，作为反硝化滤池滤料的玉米芯表面主要附着纤维素类降解菌和反硝化细菌.玉米芯中的纤维素、半纤维素被纤维素类降解菌分解成小分子有机物，为异养反硝化细菌脱氮提供有机碳源.有研究表明[10, 11]，温度对纤维素降解和反硝化脱氮过程影响较大.目前，关于温度对纤维素类降解菌和反硝化细菌影响差异的研究鲜有报道.因此，了解纤维素类降解菌和反硝化细菌对温度变化的敏感程度，掌握纤维素类物质作为碳源进行反硝化脱氮时的适宜温度，可为更好地利用纤维素碳源提供理论基础.
本研究针对城市污水处理厂低C/N比尾水深度脱氮除磷问题，探究不同温度下SCSC-S-Fe复合系统脱氮同步除磷效果，通过扫描电镜 (SEM) 对初始态玉米芯及反应后不同温度下玉米芯表面微生物附着情况，并结合细菌16S rRNA基因克隆文库来分析玉米芯表面微生物种群特性，分析了温度对反硝化细菌和纤维素降解细菌影响的敏感程度，以期为城市污水处理厂尾水深度脱氮除磷提供技术参考.
1 材料与方法 1.1 实验装置实验装置如图 1所示，SCSC-S/Fe复合系统主要由异养反硝化脱氮滤柱 (A柱) 和硫铁填料脱氮除磷滤柱 (B柱) 组成，均为有机玻璃材质，内径19 cm，高度100 cm，有效容积分别为5 L和5.3 L. A柱填充由尼龙丝网包裹着氢氧化钠处理过的玉米芯，填充高度为45 cm，其中将玉米芯切割成长宽高约为3 cm×1 cm×1 cm的小长方体. B柱上层装有高度为50 cm质量比为2:3的粒径为2~3 mm硫磺和粒径3~5 mm海绵铁复合填料；下层用粒径为5~8 mm的石灰石填装作为过滤层，有效高度为40 cm. A、B柱水流方式分别为上向流和下向流.
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图 1 SCSC-S/Fe实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of SCSC-S/Fe experimental device |
实验用水为在自来水中加入KNO3、KH2PO4模拟城市污水处理厂尾水中的TN和TP含量，并用1 mol ·L-1的HCl调节pH值.该水水质特征为：ρ(NO3--N)33~36mg ·L-1，ρ(TP) 1.4~1.6 mg ·L-1，pH 6.8~7.2.
1.3 实验方法与分析指标反应器采用接种挂膜法启动，接种污泥来自北京某污水处理厂回流污泥，具体参考李素梅等[12]提供的反应器启动方法.待出水水质各项指标趋于稳定后，启动过程完成.控制水力停留时间 (HRT) 为9 h不变，其中A柱的HRT=3 h，B柱的HRT=6 h.实验设定4个温度梯度：15、20、25和30℃.每次变更条件后，稳定一周后再开始对A柱进、出水和B柱出水取样检测，实验稳定运行127 d.当温度20℃和30℃做完后，分别提取反应器中部玉米芯表面生物膜，具体微生物MiSeq高通量测序过程及分析方法参考郝瑞霞等[13]提供的操作步骤和分析方法.检测项目包括进出水NO3--N、NO2--N、NH4+-N、SO42-、TN、TP、TFe、COD和pH值. 表 1列出分析项目与分析仪器.
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表 1 分析项目与仪器 Table 1 Indicators and analysis apparatus |
2 结果与讨论 2.1 不同温度下复合系统脱氮除磷效果 2.1.1 反硝化脱氮效果及分析
图 2为不同温度下该系统NO3--N及TN去除情况.从中可知，温度从15、20、25℃升高30℃时，系统TN平均去除率分别为78.88%、88.62%、90.43%和92.70%；NO3--N去除率变化不明显；系统出水NO3--N浓度从0.8mg ·L-1左右逐渐降低到0 mg ·L-1，出水NO2--N浓度从3.53 mg ·L-1逐渐降低到0.49mg ·L-1左右，NH4+-N浓度从3.23mg ·L-1逐渐降低到2.08 mg ·L-1左右；A柱TN去除量随温度升高逐渐增加，从4.58 mg ·(L ·h)-1增加到6.91 mg ·(L ·h)-1左右, B柱TN去除量变化不明显.数据表明，温度从15℃升高到20℃时，系统TN去除率增加10%，从20℃升高到30℃过程中变化不明显；出水中的氮主要以NO2--N、NH4+-N形式存在；A、B柱共同作用将系统内硝酸盐氮去除，A柱TN去除量随温度升高逐渐增加.
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(a) 系统TN、NO3--N去除率及出水TN浓度; (b) 系统出水NO3--N、NO2--N和 NH4+-N浓度; (c) A、B柱TN去除量 图 2 SCSC-S-Fe复合系统不同温度下硝酸盐及总氮去除情况 Fig. 2 NO3--N and TN removal of SCSC-S-Fe at different temperatures |
SCSC-S/Fe复合系统中存在异养反硝化、硫自养反硝化、氢自养反硝化和零价铁的化学还原作用等脱氮作用.硫自养反硝化、氢自养反硝化和零价铁的还原作用可以有效弥补异养反硝化过程中碳源的不足.有研究表明[14, 15]，在反硝化脱氮过程中，多种脱氮作用混合条件下系统的脱氮能力比单一反硝化作用更强.因此，SCSC-S/Fe复合系统具有高效的反硝化脱氮效率.
2.1.2 除磷效果图 3为该系统在不同温度下除磷情况.从中可知，温度逐渐升高过程中，系统TP平均去除率从15℃的82.95%逐渐升高到30℃的89.15%，出水TP浓度从0.3mg ·L-1降低到0.2mg ·L-1左右；A柱占系统除磷比例的10%，B柱占90%左右.数据表明，SCSC-S/Fe复合系统具有较高的除磷效率，TP去除率随温度升高而增加，系统中的磷主要在B柱内去除.
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(a) 系统TP去除率及出水TP浓度；(b) A、B柱对系统除磷的贡献比例 图 3 SCSC-S/Fe复合系统除磷情况 Fig. 3 Phosphorus removal of SCSC-S/Fe |
为了探究玉米芯表面微生物附着特性及对比其表面反应前后的变化，对初始玉米芯及反应后不同温度的玉米芯表面进行扫面电子显微镜 (SEM) 分析.
根据权晓琴等[16]的研究，玉米芯横截面的显微结构主要由内部的纤维管束和外部表层结构组成，其中纤维管束主要由纤维素和半纤维素组成，而外部表层主要由木质素和纤维素构成. 图 4为初始态玉米芯及内外组织挂膜反应后的扫描电镜图.对比图 4(a)和4(b)可知，30℃时微生物已将玉米芯内部纤维管束分解为细丝状，其周围组织附着大量球状微生物，也有少量的杆状微生物，说明玉米芯纤维管束有利于微生物附着分解.从图 4(c)和4(d)可知，玉米芯表层组织均匀附着球状微生物，将玉米芯表面降解为一些孔洞，30℃时表层附着的微生物和孔洞数量要比20℃时多，30℃时玉米芯表层有些地方已被微生物分解成较大的孔洞.据报道[17, 18]，反硝化细菌和纤维素类降解菌均以杆状、球状微生物为主，本研究中玉米芯表面微生物存在形态与文献报道基本一致.除此之外，对比玉米芯表层和内部组织的生物降解程度可知，玉米芯内部纤维管束结构更易于微生物降解.因此玉米芯作碳源时应将其切割纤维管束暴露出来.
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图 4 反应前后玉米芯扫描电镜图片 Fig. 4 SEM images of corncob before and after denitrification |
为了更好地分析温度对纤维素类降解菌和反硝化细菌敏感程度，分别在20℃和30℃条件下提取玉米芯表面生物膜，运用细菌MiSeq高通量测序技术，分别获得25 827和31 272条优化序列，将优化后的序列在相似性为97%条件下归为一个操作单元 (OTU)，分别得到250和376个OTUs.常用覆盖度指数和样品稀释Shannon曲线来表征样品取样的合理性.覆盖度指数越大表明序列被检测出来的概率越高；稀释曲线随着测序序列越趋向平坦越表明取样合理.本研究样品的覆盖度指数均为0.998 048，样品的稀释曲线如图 5所示，结果表明本研究中样品合理.
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图 5 样品的Shannon曲线 Fig. 5 Shannon curves of sample |
为得到每一种微生物的详细信息，将得到的OTUs与Silva库对比聚类，结合分类学分析方法，分别在门 (phylum) 和属 (genus) 分类水平下聚类分析样本群落特性，其结果如图 6所示.
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图 6 A柱内微生物分布情况 Fig. 6 Distribution of microorganisms in A column |
从图 6(a)可知，样品分类后共得到6种已知菌门，Proteobacteria (变形菌门) 在20℃和30℃条件下均为比例最大的菌门，其相对丰度分别为60%和44.72%，变形菌门中大部分微生物趋向于在厌氧环境下通过分解有机物进行反硝化脱氮过程[19~21]；Bacteroidetes (拟杆菌门) 中大多数细菌可以将纤维素降解成可溶性糖类[9]，其相对丰度分别为19.46%和24.53%；Firmicute (厚壁菌门) 中大多数细菌可以参与污泥反硝化脱氮过程[22]，其相对丰度分别为13.29%和7.31%；Acidobacteria (酸杆菌门) 相对丰度分别为0.31%和3.85%，这类细菌可以将纤维素、半纤维素降解成可溶性糖类和有机酸[23]；Spirochaetae (螺旋菌门) 是一类可以专一降解半纤维素的细菌[9]，其相对丰度分别为1.88%和12.84%；Fibrobacteres (纤维杆菌门) 细菌细胞周质中含有纤维素酶可以分解纤维素，其相对丰度分别为0.56%和2.0%.数据表明，30℃条件下降解纤维素、半纤维素有关的菌属占已知细菌菌属的43.22%，比20℃时高出11.01%；30℃条件下与反硝化有关菌属占已知细菌菌属的52.03%，比20℃下降了21.26%.下文将从细菌属水平更详细地探讨温度对微生物种群特性的影响.
图 6(b)为微生物在属水平特性分布情况，根据现有文献报道具有降解纤维素或反硝化脱氮作用相关的菌属，其功能及所占的比例如表 2所示.玉米芯表面生物膜中与反硝化脱氮有关的主要菌种包括：Rhodocyclaceae (红环菌科)、Dechloromonas菌属、Comamonadaceae (丛毛单胞菌科)、Zoogloea(动胶菌属)、Thauera(陶厄氏菌) 和Blvii28_wastewater-sludge_group菌属[14, 24~27]，在20℃时这些菌属占已知微生物菌属的35.63%，比30℃时所占比例高出7.88%.生物膜中与纤维素降解有关的主要有Treponema_ 2菌属、Paludibacter(沼杆菌属)、Bacteroides(拟杆菌属) 和Spirochaetaceae (螺旋体科)[9, 28~30]，在20℃时其所占比例为已知菌属的4.42%，比30℃时低13.87%.
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表 2 样本中主要菌属的功能及其所占比例 Table 2 Function and proportion of the main genera in sample |
可见，温度从20℃升高到30℃时，反硝化细菌所占已知微生物菌属的比例降低，纤维素类降解菌所占的比例增加，表明降解纤维素类细菌随温度升高比反硝化细菌增长更快，受温度影响更大.
2.3.3 温度对系统内具有除磷作用微生物的影响玉米芯表面附着具有反硝化聚磷作用的Rhodocyclaceae菌科和Dechloromonas菌属，可见A柱依靠生物除磷作用将磷去除，生物除磷作用包括反硝化聚磷作用和微生物生长代谢吸收作用.如表 2所示，在20℃和30℃条件下，Rhodocyclaceae菌科和Dechloromonas菌属所占比例变化不大，分别为20.22%和19.56%.可见，温度从20℃升高到30℃过程中，该系统中具有除磷作用的微生物种群所占比例几乎不变.
2.4 反硝化细菌和纤维素降解细菌对温度的敏感程度从微生物种群特性部分可知，填装玉米芯的A柱存在纤维素类降解菌和反硝化细菌，纤维素类降解菌将纤维素、半纤维素分解成利于异养反硝化细菌利用的可溶性糖类，此过程中产生的有机酸有助于维持体系pH值稳定[31, 32]，出水pH值和COD浓度如图 7所示.
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图 7 A柱pH值及出水COD浓度 Fig. 7 Effluent COD concentration and pH of A column |
为了探究温度对纤维素类降解菌和反硝化细菌的影响程度大小，通过纤维素降解产生的COD与反硝化消耗的COD之间的比例系数η进行分析，即：
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其中纤维素降解产生的COD (COD总) 包括A柱进、出水COD的差值 (ΔCOD) 和反硝化脱氮消耗COD (COD消耗)，即COD总=ΔCOD+COD消耗，以上计算均取每个温度下的平均值.有研究表明[33, 34]，在反硝化系统中异养反硝化脱氮作用大小可以用COD的消耗量来表征，理论上异养反硝化每将1 gNO3--N还原成N2需要消耗2.86 g COD，如果考虑微生物同化产能和氧化消耗的COD，实际上反硝化所需的C/N比在3以上，本研究取C/N比等于3, 其计量关系如公式 (1) 所示.根据图 7中A柱进、出水NO3--N浓度差 (ΔNO3--N) 和公式 (1) 计算出A柱反硝化脱氮过程中COD消耗，进而计算出η值，结果如图 8(b)所示.从中可知，随温度升高η值逐渐增大，表明随温度升高微生物降解纤维素产生的有机物速率大于反硝化脱氮消耗速率，即纤维素类降解细菌比反硝化细菌随温度升高增长更快、受温度影响更大.
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(1) |
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图 8 A柱COD浓度和η值 Fig. 8 Effluent COD concentration and η of A column |
(1) SCSC-S/Fe复合系统能高效地将城市污水处理厂低C/N比尾水中的氮、磷去除.该系统TN去除率随温度升高逐渐增加，温度从15、20、25℃升高到30℃时，TN平均去除率从78.88%增加到92.70%；TP去除率随温度升高增加不明显，保持在82%以上.
(2) 玉米芯中的纤维管束结构易被微生物分解利用，将玉米芯纤维管束结构切割暴露后便于微生物利用.
(3) 温度从20℃升高到30℃时，与反硝化有关的Proteobacteria菌门和Firmicute菌门所占比例分别降低了15.28%和5.98%，同时纤维素、半纤维素降解有关的Bacteroidetes菌门、Acidobacteria菌门、Spirochaetae菌门和Fibrobacteres菌门细菌所占比例增加了11.01%.因此，纤维素类降解细菌比异养反硝化细菌随温度升高增长更快、对温度升高更敏感和受温度影响更大.
(4) 温度从20℃升高到30℃过程中，玉米芯表面与生物除磷作用有关的Rhodocyclaceae菌科和Dechloromonas菌属占已知菌属的比例从20.22%变化到19.56%.可见，在一定范围内，温度变化对固相纤维素碳源的生物除磷过程影响不大.
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