2017, Vol. 38
2. 包头市财政性投资评审中心, 包头 014030;
3. 中国石油长庆油田公司油气工艺研究院, 西安 710055
2. Baotou Financial Investment and Assessment Center, Baotou 014030, China;
3. Oil and Gas Technology Research Institute, Changqing Oil Field Company, Xi'an 710055, China
油田集输系统及废水含盐量高，且为厌氧环境，容易滋生大量的硫酸盐还原菌 (sulfate-reducing bacteria，SRB).该细菌通过硫酸盐还原作用将硫酸盐还原为H2S等硫化物，H2S易对管道及设备造成腐蚀，且危害人体健康，存在很大的安全问题[1]，同时，SRB的代谢产物与水中一些离子沉淀成为污垢，造成二次开采的困难[2].
化学方法是控制SRB的最简单迅速的方法[3]，常用的化学杀菌剂有戊二醛、四羟甲基硫酸磷等，但投加的杀菌剂均具有毒性及较高的环境污染风险[4~6]，同时，长期使用杀菌剂使SRB产生抗药性[7~10]，需要不断改变其浓度或更换药剂，这不仅增加成本，且无法达到预期的处理效果.近年来，微生物抑制SRB的方法受到许多学者关注，即通过投加生物抑制剂，如硝酸盐、亚硝酸盐等促进系统中本源微生物特别是反硝化细菌 (denitrifying bacteria，DNB) 的生长[11]，DNB对SRB的竞争抑制作用[12]会降低SRB活性甚至使其数量减少，使通过硫酸盐还原作用产生的硫化物浓度降低[13].该方法费用少，操作简便，效果明显，对环境影响小，受到广泛的关注和运用.
邵涛等[14]的研究表明，投加硝酸盐、亚硝酸盐和钼酸盐，对油田采出水SRB的生长都有不同程度的抑制作用，而同等浓度的抑制效果表现为亚硝酸钠＞硝酸钠＞钼酸钠；李岩等[15]通过研究SO42-/NO3-比值对反硝化抑制效果的影响，发现当SO42-/NO3-比值为8 :1.2时，反硝化细菌对硫酸盐还原过程的抑制效果最好；Sturman等[16]向油井和气井中注入NO2-来控制酸化的产生，向气井中连续36h注入亚硝酸盐，可以控制采出气中硫化氢处于低浓度达7个月之久.
前人对于亚硝酸钠抑制硫酸盐还原的研究主要集中于抑制剂的选择、抑制剂的投加量和现场应用的效果，对反硝化抑制硫酸盐还原的机制研究较少.本实验在其研究基础上，通过在反应器中增设回流，以增加水流对污泥的水力冲刷，促进反硝化颗粒污泥的形成，实现对反硝化抑制硫酸盐还原工艺的改进，工艺成熟后研究生物量与亚硝酸盐质量比对工艺效果的影响以及工艺的稳定性，对在该工艺条件下形成的反硝化颗粒污泥性状进行研究，以评判该工艺条件是否有利于反硝化颗粒污泥的形成，并通过PCR-DGGE技术研究颗粒污泥内生物群落分布情况，探究反硝化抑制硫酸盐还原的机制，对该工艺的进一步研究起指导作用.
1 材料与方法 1.1 实验装置本研究的实验装置如图 1所示.实验采用的反应器为上流式厌氧污泥床 (up-flow anaerobic sludge bed，UASB)，其内部的厌氧环境及水流流态可很好地模拟油井环境.该实验装置由两个UASB串联而成. UASB-1可为UASB-2提供稳定的S2-浓度；加药箱中为配好的NaNO2溶液，投加至UASB-2中以促进DNB的生长，抑制SRB活性，从而抑制硫酸盐还原产生硫化物的过程.
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图 1 实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of the experimental device |
每天进水40 L，采用连续流以满足系统内生物生长所需要的条件.柱塞泵首先将原水提升进入UASB-1，HRT=6.95 h，随后进入UASB-2，HRT=4.49 h，反硝化抑制期间，向UASB-2中投加NaNO2，加药流量为15.0 mL ·h-1.袁宏林[17]的研究中指出，生物颗粒污泥相比于絮状污泥具有处理效率高、生物密度高、生物相丰富、沉降性能好，有助于后期固液分离等优点，因此，本实验中通过增设回流系统，采用蠕动泵回流部分出水，利用回流产生的强大的水流冲力使污泥与原水充分接触，为颗粒污泥的形成提供水力条件.两个UASB反应器的回流流量均为18 L ·d-1.
1.2 实验用水本研究实验用水均采用人工配水，模拟油田现场水质，原水水质如表 1所示.为保证反应器逐步适应油田高负荷原水，分三阶段对负荷提升.
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表 1 原水水质/mg ·L-1 Table 1 Raw water quality/mg ·L-1 |
1.3 测定项目及方法
COD、NH4+、TP、SO42-、NO2-、S2-的测定均采用文献[18]所规定的国家标准方法. pH：PHS-3精密数显pH计.
SRB菌数测定[19~21]：采用绝迹稀释法，即将待测水样逐级注入测试瓶，经室温静置培养7 d后根据测试瓶阳性反应及稀释倍数计算SRB数量.
DNB菌数测定：DNB的测定采用“多管发酵法”[14, 22, 23].培养基成分：KNO3 2 g，K2HPO4 1.0 g，MgSO4 ·7H2O 0.2 g，KH2PO4 1.0 g，柠檬酸钠5.0 g，溶于1 000 mL蒸馏水，调节pH至7.2.吸取1 mL样品稀释液于灭菌培养基试管中，每个梯度接种3~5管，4~6个梯度，另接种1 mL无菌水作为对照. 25~30℃恒温培养14 d.将有菌液生长的最后3个稀释度中呈阳性反应的试管数作为数量指标.
污泥容积指数 (SVI)：采用自由沉降及重量法测定，具体操作方法见文献[24].
颗粒污泥粒径分布：湿式筛分析法[25].从反应器内取一定量污泥，用水冲洗后使之依次通过孔径为2.4、2.2、2.0、1.8、1.6、1.4、1.2、1.0、0.8、0.6、0.4和0.2 mm的分样筛，将各个分样筛截留的污泥在105℃下烘干、称重，计算不同粒径范围污泥的质量比.
颗粒污泥沉速[26]：通过自由沉淀法测定.取一容积>1L的量筒，测量其高度并加满水，分别取一定量 (20~30个) 的各粒径范围的颗粒污泥加入量筒，测量每个颗粒污泥从量筒顶部沉降到底部所用的时间，利用v=h/t计算沉速，h为量筒顶部到底部的距离，t为从量筒顶部到底部所用时间，然后取其均值作为此粒径范围颗粒污泥的沉速.
样品总DNA提取：DNA通过OMEGA Soil DNA kit试剂盒的操作步骤提取.
PCR-DGGE：针对微生物基因V3区片段的338F (5′-ACTCCTACGGGAGGCAGC-3′)，518R (5′-ATTACCGCGGCTGCTGG-3′)，引物末端带GC夹.实验程序见文献[27].
2 结果与讨论 2.1 反应器启动接种污泥选取自西安市某污水厂厌氧反应池中的絮状污泥.启动过程逐步提升原水SO42-浓度，开始为300 mg ·L-1，31 d提升至900 mg ·L-1，61 d提升至1 500 mg ·L-1. 图 2为反应器启动过程中UASB-2中SO42-浓度变化情况，从中可知，UASB-2进水SO42-浓度比原水中略低，这是由于两反应器为串联，原水先流经UASB-1，在其内原水中营养物质经过少量消耗，而后进入UASB-2，此时各项水质指标相对于原水均有一定程度的降低. UASB-2中SO42-去除率基本呈增加趋势，最终在75 d稳定至93%. 图 3为反应器启动过程UASB-2进水的COD及S2-浓度，其中COD浓度与进水中SO42-浓度类似，均相对于原水有一定程度减少，进水中S2-逐渐增加，并稳定至102 mg ·L-1左右. 图 4为启动过程UASB-2中SRB数量变化情况，从中可知，随着培养时间的增加，UASB-2中SRB数量由2.0×103 CFU ·(100 mL)-1逐渐增加，在75 d稳定至8.0×105 CFU ·(100 mL)-1，表明SRB已完成驯化，反应器成功启动.此时污泥已颗粒化，说明反应器中增设的回流对颗粒污泥的形成起一定的促进作用.
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图 2 启动阶段UASB-2中SO42-变化情况 Fig. 2 Change of SO42- in UASB-2 during start-up |
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图 3 启动阶段UASB-2中进水水质指标 Fig. 3 Changes of water quality in UASB-2 during start-up |
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图 4 启动阶段UASB-2中SRB数量变化 Fig. 4 Change of SRB quantity in UASB-2 during start-up |
反应器启动成功后，于UASB-2中投加NaNO2以促进反硝化颗粒污泥的形成及对SRB的抑制.李岩[10]等人提出，当SO42-/NO3-比值为8 :1.2时，反硝化对硫酸盐还原的抑制效果最好，因此，本实验控制NO2-浓度为222 mg ·L-1.分阶段提升其浓度，最终调至222 mg ·L-1. 图 5、6表征反硝化抑制过程UASB-2中S2-浓度及细菌数量变化情况.
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图 5 工艺的稳定过程UASB-2中硫离子变化情况 Fig. 5 Change of sulfide in UASB-2 during the process stabilizing |
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图 6 工艺的稳定过程UASB-2中细菌数量变化情况 Fig. 6 Change of microbial quantity in UASB-2 during the process stabilizing |
硫离子抑制率表征DNB对硫酸盐还原的抑制程度.由图 5可知，进水硫离子浓度基本稳定于103 mg ·L-1，出水硫离子浓度随培养时间的增加不断降低，其抑制率稳步增加，培养至162 d时，硫离子浓度为18.4 mg ·L-1，S2-抑制率为82%，继续运行，出水S2-浓度及抑制率基本不变，说明此时DNB已适应环境中NO2-浓度，该工艺处于稳定阶段.
图 6反映污泥形成过程中SRB及DNB的数量变化情况，颗粒污泥中SRB数量随培养时间的增加不断减少，同时，DNB数量增加.从中可知，该工艺的稳定过程分3个阶段.反硝化抑制初期细菌浓度变化缓慢，SRB数量由8.0×105 CFU ·(100 mL)-1缓慢降低，DNB数量由7.0×103 CFU ·(100 mL)-1缓慢增加，此时NO2-只是抑制SRB的活性，DNB逐渐适应NO2-浓度，活性逐渐增加；116 d时提升NO2-浓度，进入抑制效果提升期，两种细菌的数量在该时期内变化显著，DNB繁殖速率增加，SRB由于缺乏能量等环境胁迫因素，数量急剧下降；146 d时继续提高NO2-浓度，进入抑制效果平稳期，两种细菌的数量趋于稳定，162 d时，DNB数量增加至最高，为7.3×105 CFU ·(100 mL)-1，SRB数量减至最小，为7.6×104 CFU ·(100 mL)-1，此时，反硝化抑制硫酸盐还原的工艺已稳定，反硝化颗粒污泥已培养成熟.
2.2.2 生物量与亚硝酸盐质量比对工艺效果的影响生物量与亚硝酸盐质量比是影响反硝化抑制效果的重要因素.对培养成熟的反硝化颗粒污泥，在保证系统生物量基本稳定的前提下，改变亚硝酸钠的投加量，从而确定生物量与亚硝酸钠的最优质量比.分别在质量比为1 667、1 200及857这3种情况下，研究系统对S2-抑制率的影响.系统中的污泥量为2 L，测定其SVI为13.3 mL ·g-1，则生物量为150 g，3种质量比时需要的NO2-质量分别为90、125及175 mg.配成浓度为250 mg ·L-1的NaNO2溶液，通过调节NaNO2的加药流量控制UASB-2中加入的NO2-质量，分别调节加药流量为15.0、20.9及29.2 mL ·h-1，原水水质等其他条件均不变.
反硝化颗粒污泥培养成熟后，维持原条件继续培养10 d，继而调节NaNO2的加药流量至20.9 mL ·h-1，培养10 d后，继续调节加药流量至29.2 mL ·h-1，进行10 d的培养. UASB-2进出水的S2-浓度及抑制率见图 7.
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图 7 生物量与亚硝酸盐质量比对工艺效率的影响 Fig. 7 Effect of biomass to nitrite mass ratio on process efficiency |
由图 7可知，质量比为1 667时，S2-的抑制率稳定在83%左右，181 d时增加NaNO2的投加量，调节质量比为1 200，S2-的抑制率逐渐增加，最终稳定至92%，191 d时继续增加NaNO2的量，质量比为857，此时，系统对S2-的抑制率基本保持不变，仍稳定于92%.对比3种情况可知，随着质量比的减小，S2-的抑制率先增加后基本保持不变，主要原因是质量比过高时，系统中NaNO2的量对DNB是不足够的，因此其活性未达到最高，当NaNO2量增加时，DNB的活性增加，1 200的质量比对应的DNB活性最高，因此具有较高的S2-抑制率，随后再增加NaNO2的量并无法使抑制率增加，是因为此时影响反硝化抑制效果的主要因素不是DNB的活性，而是反应过程中的其他因素.因此，控制生物量与亚硝酸盐质量比在1 200左右，即可实现较高的S2-抑制率.质量比过高时，S2-的抑制率相对较低，而过低的质量比不仅无法保证抑制率的增加，且造成NO2-投加成本的增加，因此，1 200是较合适的质量比.
对181~190 d的结果进行分析可知，184 d时S2-抑制率达到92%，继续培养时抑制率并未降低，基本稳定于92%，说明该工艺对硫酸盐的抑制效果具有一定的稳定性.实际应用中，通过控制生物量与亚硝酸盐的比例，使工艺效果保持最优.
2.2.3 反硝化颗粒污泥性状图 8为反硝化颗粒污泥形态.从中可知，该工艺条件下形成的反硝化颗粒污泥呈棕褐色，基本呈椭球形和球形，表面光滑且密实，说明该工艺条件适合颗粒污泥的形成，并对其形成过程有促进作用. 图 8中显示，形成的反硝化颗粒污泥大部分的粒径在1.0~1.6 mm，与图 9中的粒径分布测定结果一致.
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图 8 反硝化颗粒污泥外观 Fig. 8 Appearance of denitrified granular sludge |
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图 9 颗粒污泥粒径分布及沉速 Fig. 9 Particle size distribution and settling velocity of granular sludge |
Pereboom等[28]及赵霞等[24]提出，研究反应器内颗粒污泥的粒径分布可以很直观地反映出反应系统条件对颗粒污泥产生的影响，进而对反应体系作出调整.通过对颗粒污泥的沉速研究，可了解颗粒污泥的沉降性能，且对其反硝化抑制效率有一定的表征作用. 图 9显示的是UASB-1颗粒污泥的粒径分布、UASB-2污泥的粒径分布及沉速，其中UASB-1中的污泥取自反应器启动90 d时，UASB-2中的污泥取自反应器启动170 d时，测其粒径分布，并对UASB-2中不同粒径范围的颗粒污泥在清水中的静沉速进行测量.
图 9中显示，UASB-1中的颗粒污泥粒径多分布在1.0~1.4 mm，占总泥量的42.5%，计算得平均粒径为1.17 mm；UASB-2中的颗粒污泥粒径多分布在1.2~1.6 mm，占总泥量的40.5%，计算得平均粒径为1.21 mm.对比两反应器中的污泥粒径可知，UASB-2中污泥粒径大于UASB-1，说明反硝化抑制硫酸盐还原过程使污泥粒径略有增加. UASB-2中污泥沉速随着粒径增加而增大，但当粒径过大，即大于2.2 mm后沉速增长不明显，这是由于过大的粒径会导致污泥内部缺乏营养或能量形成孔隙，颗粒密度因此减小，同时孔隙内容易容纳产生的气体，使污泥的沉降性能变差，这与Wang[29]等的研究结果一致；颗粒污泥的平均沉速为47.6 m ·h-1，说明该污泥具有较好的沉降性能.对比粒径分布与污泥沉速结果可知，83%的颗粒污泥其沉速在20~70 m ·h-1之间，该沉速范围内的颗粒污泥粒径分布于0.4~1.8 mm之间；9.5%的颗粒污泥沉降性能很好，沉速大于70 m ·h-1，最大沉速可达83 m ·h-1，其粒径介于1.8~和2.2 mm之间；7.5%的颗粒污泥的沉降性较差，沉速为20 m ·h-1. Schmidt[30]等的研究结果表明，厌氧颗粒污泥的粒径一般介于0.5~5 mm，沉速在20~70 m ·h-1内属于良好污泥，本研究形成的颗粒污泥粒径尺寸与其他厌氧颗粒污泥基本相当，沉速相对于其他厌氧颗粒污泥较高，沉降性能好，说明该工艺的运行效能好，可实现较高的硫酸盐还原抑制效果.
2.3 微生物特性分析PCR扩增实验采用的引物为针对细菌16S rDNA的V3区基因的通用引物338F-518R，扩增后的产物进行变性梯度凝胶电泳 (DGGE) 分析，电泳结果如图 10(a)所示，通过软件Quantity One绘制泳道间相似性示意图，结果如图 10(b)所示.
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① 代表UASB-1中的颗粒污泥，② 为UASB-2中的颗粒污泥 图 10 DGGE及泳道相似分析 Fig. 10 Results of DGGE and lane similarity analysis |
根据变性梯度凝胶电泳的分离原理，泳道内的每个条带代表一种可能的细菌，因此条带越多说明生物菌种越多，条带越亮则该种细菌丰度越高.由图 10(a)可知，UASB-1颗粒污泥泳道中有18条条带，4条亮条带，UASB-2颗粒污泥中有14条条带，3条亮条带.说明经反硝化抑制后，污泥中的菌群结构发生了较大改变.对比UASB-1与UASB-2颗粒污泥电泳结果，经反硝化抑制作用后，微生物种属由18种减少至14种，优势菌属由4种减少至3种，说明反硝化抑制硫酸盐还原过程会降低微生物多样性. 图 10(b)结果表明，UASB-1与UASB-2中微生物种群相似性为62.6%，说明反硝化抑制过程对微生物种群结构有较大改变.
将电泳泳道中的7条亮条带割胶回收，并进行克隆，每条条带选择其阳性克隆子进行测序，所测序列与GenBank数据库比对，结果见表 2.各条带分别命名为Band1~Band7.
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表 2 回收条带的测序结果分析比对 Table 2 Analysis of sequencing results of the recovered bands |
UASB-1中的优势条带为Band1、3、4、7，其对应的最相似菌种分别为Uncultured Desulfobulbus sp.、Desulfobulbus propionicus DSM 2032、Uncultured sulfate-reducing bacterium和Desulfovibrio carbinolicus strain DSM 3852，几种菌具有硫酸盐还原的功能基因，故UASB-1中的4种优势菌种均为SRB. UASB-2中的优势条带为Band2、5、6，对应最相似菌种为Uncultured Sulfurimonas sp.、Uncultured sulfate-reducing bacterium和Desulfovibrio burkinensis，其中Uncultured sulfate-reducing bacterium与Desulfovibrio burkinensis具有硫酸盐还原基因，均属于SRB；Uncultured Sulfurimonas sp.归于硫微螺菌属，是一种典型的反硝化细菌，故UASB-2中的优势菌属包括两种SRB及一种DNB，据其条带亮度可知，DNB数量远远高于SRB.对比UASB-1及UASB-2中优势菌种组成，可知SRB优势菌种由4种减少至2种，且其占总菌丰度明显降低，新增一种DNB，丰度很高，说明反硝化抑制硫酸盐还原促使优势菌群由SRB逐渐演变为DNB，微生物种群结构发生明显变化.
两反应器中共有5种SRB，其中Band4与Band5对应同一种.其中，除Band4/5对应的菌种不能确定其所属科目外，其余均属于Δ-变形菌纲，Uncultured Desulfobulbus sp.和Desulfobulbus propionicus DSM 2032归于脱硫叶菌科、脱硫叶菌目、脱硫叶菌属，Desulfovibrio burkinensis及Desulfovibrio carbinolicus strain DSM 3852归于脱硫弧菌科、脱硫弧菌目、脱硫弧菌属.经反硝化抑制后，SRB原有菌种即Band1、3、7对应菌种消失说明反硝化对以上几种SRB的抑制作用显著，迫于环境压力，几种细菌的生长繁殖完全受限，最终消亡. Band4/5对应菌种经反硝化抑制后，虽仍为优势菌种，但数量明显减少，说明该菌种对该环境有一定的适应性. Band6为反硝化抑制后的新增菌种，虽为优势菌种，但其条带不是很亮，说明数量不多，该菌与Band4/5对应菌种有共性，它们均可适应该环境，但经反硝化抑制后，硫离子浓度很小，说明体系中存在的SRB并未进行硫酸盐还原过程产生硫离子，即以上两种SRB虽存在于系统中，但其活性被抑制，基本不进行硫酸盐还原过程，因此对体系无害.
反硝化抑制过程的主要功能菌为Band2对应菌种，即Uncultured Sulfurimonas sp.，该菌种归于硫微螺菌属、螺杆菌科、弯曲 (杆) 菌目、变形菌纲、变形菌门. Takai等[31]的研究表明，该类细菌是一种典型的化能自养型反硝化细菌，厌氧环境中可利用硫类物质作为电子供体，将投加的硝酸盐/亚硝酸盐作为电子受体进行生化反应，产生能量维持自身生长繁殖；以上几种SRB以碳源等营养基质为电子供体，以硫酸盐、亚硫酸盐等硫类物质为电子受体进行硫酸盐还原反应，产生的能量维持自身生长.因此，当亚硝酸盐加入体系中，促进DNB利用硫类物质过程的进行，DNB在电子的竞争中占优势，硫酸盐还原反应的发生受限，SRB无法获取能量以满足自身生长，逐步消亡，减少硫化物的产生，硫酸盐还原过程得到抑制.
3 结论(1) 添加NaNO2可促使反应体系中反硝化细菌 (denitrifying bacteria，DNB) 的活性明显增加，DNB对硫酸盐还原菌 (Sulfate-reducing bacteria，SRB) 的竞争抑制作用导致SRB数量由8.0×105 CFU ·(100 mL)-1减少，稳定至7.6×104 CFU ·(100 mL)-1，同时，硫酸盐还原过程被抑制，硫离子的抑制率不断增加，最终稳定至82%.
(2) 生物量与亚硝酸盐的质量比为1 200时，反应体系对S2-的抑制率最高，可达92%，实现较好的硫酸盐还原过程抑制效果，且该工艺对其抑制率可保持在92%左右，具有较好的稳定性.
(3) 形成的反硝化颗粒污泥为棕褐色，基本为椭球形和球形，表面光滑且密实.反硝化抑制前，颗粒污泥的粒径多分布于1.0~1.4 mm，平均粒径为1.17 mm，经反硝化抑制后，粒径多分布在1.2~1.6 mm，平均粒径为1.21 mm，反硝化抑制过程促进污泥粒径及沉速的小幅增加；形成的反硝化颗粒污泥平均沉速为47.6 m ·h-1，沉降性能较好.
(4) 对反硝化颗粒污泥中微生物进行PCR-DGGE分析，结果表明，反硝化抑制作用使微生物多样性降低，且其优势菌群由SRB逐渐演变为DNB；反硝化抑制使SRB菌属减少，丰度降低，反硝化抑制后，UASB-2中存在两种SRB优势菌属，一种为原有菌种，其数量相对于反硝化前明显减少，另一种为新增菌种，这两种SRB虽为优势菌种，但其活性被抑制，基本不进行硫酸盐还原反应，故其存在对该体系不会有太大影响；反硝化抑制过程的主要功能菌为Uncultured Sulfurimonas sp.，是一种自养型反硝化细菌，与SRB进行抢夺电子竞争并占优势，抑制硫酸盐还原过程及SRB生长繁殖，从而抑制硫化物的产生.
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