2017, Vol. 38
2. 河南生态环境损害司法鉴定中心, 郑州 450011
, SI Xiao-wei1,2 , WANG Wan-feng1 , WANG Chun-feng1 , WANG Zi-ying1 , ZHANG Qin-wen1 , WANG Wan2
2. Judicial Authentication Center of Ecological Environmental Damage of Henan, Zhengzhou 450011, China
磺胺类药物是以对位氨基苯磺酰胺为基本结构的一类衍生物，由于其价格低廉，对各种细菌具有广谱抗药性，因此，是使用范围很广的一类药物[1, 2]，其主要通过抑制细菌的二氢叶酸合成酶，使其不能充分利用对氨基苯甲酸合成四氢叶酸，从而影响DNA的合成[3].由于磺胺类药物不能被完全代谢，大部分随粪便和尿液排出体外.因此，磺胺类药物母体或代谢产物会通过粪尿等形式进入土壤[4, 5].
对于环境中残留污染物的量及其所产生的生态毒性效应是环境科学普遍关注的问题之一.传统的化学法只能分析环境中污染物的形态和含量，而与传统化学分析法相比，生物测试法能更直观地反映污染物对生物体的毒性效应，进一步揭示产生毒性效应的作用机制[6].作为生物测试法之一的发光细菌检测法，由于具有高效和廉价的特点，通常作为生物毒性检测的首选方法.
根-土界面是污染物进入植物体的门户，是联系土壤和植物的重要纽带，由于植物根系的存在，该区域土壤的物理、化学和生物性质等与土体存在很大差异，影响土壤中污染物的化学行为[7, 8].土壤中磺胺类药物的残留形态可分为水溶态、有机溶剂可提取态和结合态，前两者的生物活性较高，可对环境和生物产生直接影响，后者生物活性较低，因此，不同形态的磺胺类药物可能产生不同的环境效应和生态毒性[9].本研究中采用化学分析和发光细菌检测相结合的方法，分析磺胺类药物在作物根-土界面的形态转化及生态毒性变化，以期为土壤中磺胺类药物残留污染对人体健康和生态环境的影响作出综合评价.
1 材料与方法 1.1 试验材料 1.1.1 供试土壤土壤采自河南师范大学生物园表层土 (0~20 cm)，属于未受任何化学品污染的洁净土壤，15~20℃风干，过1 mm筛后备用.土壤样品的基本性质如下：pH 6.31；阳离子交换量12.26 cmol·kg-1；TP (总磷)0.04 mg·kg-1；TK (总钾)0.18 mg·kg-1；有机质1.65%；黏粒13.4%；粉粒24.2%.
1.1.2 药品与试剂磺胺嘧啶 (Sulfadiazine, SD)、磺胺间甲氧嘧啶 (Sulfamonomethoxine, SMM) 和磺胺甲唑 (Sulfamethoxazole, SMZ) 标准品 (白色结晶，纯度为99.0%，美国Sigma公司)；荧光胺 (纯度>99.0%，Alfa Aesar公司)；甲醇、乙腈、丙酮 (色谱纯，美国Fisher公司)；试验用水为高纯水.
1.1.3 仪器Waters高效液相色谱仪；Waters 2475荧光检测器 (Waters, Singapore)；Waters 1525 Binary溶剂输送泵 (Waters, Singapore)；DXY-2型生物毒性测试仪 (南京土壤研究所).
1.1.4 检测生物明亮发光杆菌T3小种 (Photobacterium phosphoreum T3) 冻干粉 (南京土壤研究所) 安剖瓶包装，每瓶0.5 g，于2~5℃冰箱内保存，有效期为6个月.使用前按照GB/T 15441-1995进行发光细菌的复苏，复苏液置于盛有冰块的保温瓶中，2 min后即可复苏发光.
1.2 试验方法 1.2.1 土壤处理方法称取一定量尿素和磷酸二氢钾拌入土壤做底肥，基肥量为N 0.15 g·kg-1，P2O5 0.15 g·kg-1，K2O 0.1 g·kg-1，混匀后放置3 d.配制一定浓度的磺胺嘧啶、磺胺间甲氧嘧啶和磺胺甲唑溶液，将其均匀拌入土壤中，使得每种磺胺类药物在土壤中初始含量分别为0、2、5、10 mg·kg-1，混合、放置5 d后测定土壤中药物的实际含量.磺胺嘧啶的实测含量分别为1.89、4.25和6.73 mg·kg-1，磺胺间甲氧嘧啶的实测含量分别为2.07、3.90和7.74 mg·kg-1，磺胺甲唑的实测含量分别为1.64、2.86和6.71 mg·kg-1.将土壤盛装于根际箱中，每箱1 kg.根-土界面被分为多个不同的空间：种植植物的中央区域1 cm为根际区，再以此为中心间隔1 cm为近根区，3 cm以外为远根区，两侧被分为两层，隔板是覆盖300目尼龙网的有机玻璃框.
玉米种子浸泡于0.5%的次氯酸钠溶液中消毒20 min后，用去离子水冲洗干净，播种于根际箱中.每箱播种10粒，出苗后，保苗5株.培养期间保持土壤含水量在田间最大持水量的60%，3次重复.采用破坏法取样，在种植10 d后取两侧不同剖面的土样，混匀，测定其残留的磺胺类药物3种形态的含量.
1.2.2 土壤样品提取方法形态分为水溶态、有机溶剂可提取态和结合态，参照Mordaunt等[10]采用的连续振荡提取法提取.水溶态采用0.01mol·L-1的CaCl2溶液作为提取液，有机溶剂可提取态分别用甲醇、乙腈、丙酮和二氯甲烷依次提取，结合态参照曾跃春等[11]的提取方法，在以上过程提取后的残渣中加入2 mol·L-1 NaOH作为提取液进行提取.
1.2.3 HPLC检测方法与质量控制安捷伦C18快速分离柱 (150 mm×4.6 mm, 3.5 μm)，C18保护柱 (12.5 mm×4.6 mm, 5 μm)；流动相为0.5%冰乙酸和乙腈，采用梯度洗脱：0min，乙腈:0.5%冰乙酸=30 :70；10 min，乙腈:0.5%冰乙酸=55 :45；激发波长：405 nm，发射波长：495 nm；进样量20 μL；流速：1 mL·min-1；柱温：35℃.配制浓度范围为0.05~5 mg·L-1混合标准溶液，样品衍生化后供HPLC测定，并绘制标准曲线，相关系数R2均大于0.999 0.采用加标法测定回收率和检测限，在0.5~10 mg·kg-1添加浓度下平均回收率为86.5%~94.6%，变异系数小于6.4%，检测限为1.0~2.3 μg·kg-1.
1.2.4 明亮发光细菌毒性测试明亮发光细菌活性检测采用3%无菌NaCl溶液配制质量浓度梯度为0.02、0.04、0.06、0.08、0.10、0.12、0.14、0.16、0.18、0.20、0.22、0.24mg·L-1的HgCl2溶液，于4℃保存并不超过24 h，按照GB/T 15441-1995进行发光细菌毒性的测试.
测定不同形态磺胺类药物对明亮发光细菌的毒性时，以处理含量为0 mg·kg-1的土壤样品为对照，分别按照1.2.2节中的提取方法对不同形态磺胺类药物进行提取，并按照GB/T 15441-1995进行发光细菌毒性的测试.
1.2.5 相对发光强度及相对毒性抑制率的计算
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环境中磺胺类药物的污染均为一种以上药物的复合污染[12]，因此，在本试验研究中，特选取了在环境中检出率较高的3种磺胺类药物作为供试药物，并以混合物的形式添加在土壤中，以便更真实地模拟土壤环境中磺胺类药物的污染情况.土壤中磺胺类药物的形态可分为水溶态、有机溶剂可提取态和结合态这3种.由图 1可知，当培养天数为10 d时，在同一含量作用下，根际区水溶态的含量最高，近根区次之，远根区最低.例如，在10 mg·kg-1的处理作用下，根际区、近根区和远根区水溶态的含量分别为8.171、5.618和5.072 mg·kg-1.这可能是由于根际区植物根系分泌物对根系区周围土壤有一定的活化作用[13, 14]，有利于药物水溶态的形成，因此，根际区水溶态含量较近根区和远根区高.
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图 1 不同根-土界面3种形态磺胺类药物的残留含量 Fig. 1 Contents of 3 sulfonamides residues on different root-soil interface |
对于有机溶剂可提取态和结合态，当培养天数为10 d时，在同一含量作用下，其在远根区的残留含量高于近根区和根际区.例如，在2 mg·kg-1的处理作用下，根际区、近根区和远根区有机溶剂可提取态的含量分别为0.665、0.744和0.898 mg·kg-1；结合态的含量分别为0.001、0.017和0.021 mg·kg-1.这可能是由于非根际区距根系较远，土壤的生物活性较低[15, 16]，药物被土壤中有机质或黏土矿物吸附或截留捕获，形成较为稳定的有机溶剂可提取态，其进一步转化为水溶态量较少以保证自身的稳定性，因此，远根区有机溶剂可提取态的含量较高.结合态是磺胺类药物随着时间与土壤有机质、氧化物等组分之间不断通过化学键合、物理镶嵌等作用形成的[17]，因此，当培养天数为10 d时，不同根-土界面所形成的磺胺类药物结合态的量均较低.另外，植物根系区土壤的生物较高，不利于结合态的形成，因此，结合态在根际区的形成量最低.
综上所述，根际区土壤中磺胺类药物主要以水溶态的形式存在，其含量约占3种形态总量的60.6%~79.4%，其次是有机溶剂可提取态，约占3种形态总量的17.3%~39.3%，结合态的含量最低，仅占3种形态总量的0.1%~3.3%；而在远根区，土壤中磺胺类药物主要以有机溶剂可提取态的形式存在，其含量约占3种形态总量的50.0%~65.5%，其次是水溶态，约占3种形态总量的31.5%~45.0%，结合态的含量最低，仅占3种形态总量的1.3%~5.1%；近根区土壤中磺胺类药物的主要存在形态是水溶态和有机溶剂可提取态，其含量分别约占3种形态总量的45.0%~51.8%和45.6%~53.9%.由此可见，根际环境对外来污染物的形态分布产生重大影响.
此外，由图 1可知，在同一根-土界面，高含量处理作用下土壤中3种形态磺胺类药物的含量均高于低含量处理作用下的含量.例如，在2、5和10 mg·kg-1的处理作用下，根际区水溶态的含量分别为1.025、2.837和8.171 mg·kg-1；有机溶剂可提取态的含量分别为0.666、1.245和1.781 mg·kg-1；结合态的含量分别为0.001、0.070和0.340 mg·kg-1.
2.2 根-土界面磺胺类药物3种形态对发光细菌的毒性效应如图 2，当培养天数为10 d时，水溶态和有机溶剂可提取态对明亮发光细菌均表现为毒性抑制作用.根际区水溶态对明亮发光细菌的相对毒性抑制率大于近根区和远根区，在10 mg·kg-1的含量作用下，根际区、近根区和远根区水溶态对发光细菌的相对毒性抑制率分别为3.60%、0.87%和0.72%.而远根区有机溶剂可提取态对发光细菌的毒性抑制作用较根际区和近根区稍强.例如，在2 mg·kg-1的处理作用下，根际区、近根区和远根区有机溶剂可提取态对发光细菌的相对毒性抑制率分别为0.51%、0.84%和0.91%.由图 1可知，水溶态和有机溶剂可提取态对发光细菌的相对毒性抑制率与其含量有关，含量越高，对发光细菌的毒性抑制作用越明显，线性相关系数R2>0.7.吴淑杭等[18]以明亮发光杆菌作为毒性测试物种，研究了18种农药的急性毒性，结果表明，不同农药对发光细菌的急性毒性在一定浓度范围内与其浓度呈正相关.
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图 2 不同根-土界面3种形态磺胺类药物对明亮发光细菌的相对毒性抑制率 Fig. 2 Relative inhibition rates of 3 sulfonamides residues to Photobacterium phosphoreum T3 on different root-soil interface |
由图 1和2可知，根际区和近根区水溶态的含量较有机溶剂可提取态高，但其对发光细菌的毒性却低于有机溶剂可提取态.通过计算磺胺类药物两种形态的IC50值可知，磺胺类药物有机溶剂可提取态的IC50值为62.547 mg·kg-1，水溶态的IC50值为109.448 mg·kg-1.例如，在5 mg·kg-1的处理作用下，根际区水溶态含量约是有机溶剂可提取态的2.3倍，而毒性却只是有机溶剂可提取态的9/10；在2 mg·kg-1的处理作用下，近根区水溶态含量约是有机溶剂可提取态的1.1倍，而毒性却只是有机溶剂可提取态的2/5.一方面可能是由于磺胺类药物有机溶剂可提取态含有磺胺类药物在降解过程中产生的毒性强于其母体化合物的中间产物[19]，例如乙酰化代谢产物，仍然保持较高的毒性[2]，所以其对发光细菌的毒性强于水溶态；另一方面可能是由于磺胺类药物的水溶态含有少量来自提取液的低浓度无机离子Ca2+，有研究表明，该离子会对发光细菌产生一定的刺激效应，这会导致发光细菌毒性测试结果偏低[20].
有研究表明，当溶液中有机污染物的浓度较低时，发光细菌的呼吸作用会增强，荧光酶分泌增多，以此来抵抗外界的刺激作用，从而维持自身体内的代谢平衡，发光细菌的相对发光强度会大于100%，相对毒性抑制率为负值，对药物表现出一定的激活作用[21, 22].由图 1和图 2可见，结合态的含量较低，对发光细菌均表现为激活作用.在2 mg·kg-1的处理作用下，根际区结合态的含量较近根区和远根区的小，因此，其对发光细菌的激活作用也较近根区和远根区弱，结合态含量与其对发光细菌的毒性激活作用呈良好的线性负相关关系 (R2>0.9).在5 mg·kg-1的处理作用下，根际区结合态的含量 (0.070 mg·kg-1) 也低于远根区 (0.144 mg·kg-1)，但其对发光细菌的激活作用略强于远根区，这可能是由于结合态在一定的范围内随着含量的升高对发光细菌的激活作用加强，而超过一定的含量，其对发光细菌的发光系统开始造成破坏作用时，结合态对发光细菌的激活作用会随着含量的上升而减弱.在10 mg·kg-1的处理作用下，不同根-土界面所形成的结合态的量均远高于在5 mg·kg-1的处理作用下所形成的结合的量，因此，结合态对发光细菌表现出微弱的激活作用.由于根际区结合态含量 (0.340 mg·kg-1) 略低于远根区 (0.570 mg·kg-1)，因此，根际区结合态对发光细菌的激活作用较远根区略强，结合态含量与其对发光细菌的激活作用呈线性负相关，相关系数R2>0.8.
此外，由图 2可知，在同一根-土界面，高含量处理作用下土壤中3种形态磺胺类药物对发光细菌的相对毒性抑制率高于低含量作用下的相对毒性抑制率.例如，在2、5和10 mg·kg-1的处理作用下，根际区水溶态对发光细菌的相对毒性抑制率分别为0.47%、1.79%和3.60%；远根区有机溶剂可提取态对发光细菌的相对毒性抑制率分别为0.91%、2.28%和4.71%.这是由于随着水溶态和有机溶剂可提取态含量的增加，对发光细菌的代谢抑制作用增强，其相对发光强度随着药物含量的增大而显著降低[18].
2.3 根-土界面3种形态磺胺类药物的毒性评价根据毒性评价标准[23]，3种形态磺胺类药物对发光细菌的相对发光抑制率均小于30%，相当的氯化汞浓度均低于0.07 mg·L-1，表现为低毒性.其中，有机溶剂可提取态对发光细菌的毒性最大，其次是水溶态，结合态毒性作用最小，甚至对发光细菌有微弱的激活作用.而有机溶剂可提取态的含量并非最高，说明仅依据污染物浓度评价其对环境的影响并不合理，同时应考虑污染物的存在形态及结构等因素的影响. Linsak等[24]对海洋沉积物进行了化学分析和发光细菌检测，也认为污染物的浓度高低并不能完全代表对有机体潜在毒性的大小. Maisto等[25]利用化学和一系列生物分析法研究土壤中重金属浓度与土壤毒性的关系.结果表明，重金属污染土壤对发光细菌的毒性不仅与重金属的含量有关，也与其在土壤中的存在形态有关.
Deprez等[26]提出了一种运用化学和生物检测相结合的方法评价污染物对环境的影响.在其方法中，首先对污染物进行化学分析，然后在研究污染物毒性作用机制之前利用发光细菌法进行毒性筛选，其被证明是一种评价污染物急性毒性的有效方法.此外，对发光细菌有急性毒性作用的污染物通常在毒性机制检测中显示出慢性毒性作用.因此，在污染物的毒性风险分析中，建议同时使用化学分析和生物检测法，以期为污染物对人体健康和生态环境造成的影响作出准确的评价.
3 结论(1) 根际区土壤中磺胺类药物主要以水溶态的形式存在，远根区主要以有机溶剂可提取态为主，而近根区土壤中磺胺类药物的主要存在形态是水溶态和有机溶剂可提取态.
(2) 根际区磺胺类药物的水溶态对明亮发光细菌的相对毒性抑制率大于远根区，而有机溶剂可提取态和结合态对明亮发光细菌的相对毒性抑制率小于远根区.在一定含量范围内，磺胺类药物的水溶态、有机溶剂可提取态和结合态含量与对发光细菌的相对毒性抑制率存在良好的线性相关性，相关系数R2>0.7.
(3) 3种形态的磺胺类药物对发光细菌的相对发光抑制率均小于30%，表现为低毒性.其中，水溶态和有机溶剂可提取态的含量较高，对发光细菌的毒性作用较大，且有机溶剂可提取态的毒性大于水溶态，结合态对明亮发光细菌的毒性作用最小.
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