2017, Vol. 38
2. 中国地质大学 (武汉) 环境学院, 武汉 430074
2. School of Environmental Studies, China University of Geosciences, Wuhan 430074, China
随着工农业生产的迅速发展，污染物在环境中的不断累积，导致土壤环境污染日益严重[1~3]，尤其是土壤重金属污染因其高富集、难降解、毒性强等特点而越来越被人们所关注.众所周知有些重金属是植物所必需营养元素，而多数为植物非必需元素，所有的重金属元素当浓度超过某一阈值，都会对植物产生毒害作用.重金属胁迫将导致植物体代谢功能紊乱，生长发育受影响，严重时甚至导致植物死亡.镍 (Ni) 是一种重金属元素，它是植物必需的微量元素，但当环境中Ni含量超过一定浓度就会对植物体产生毒害作用[4].据2014年环保部和国土资源部联合发布的全国土壤污染状况调查公报显示，无机污染物指标中，Ni超标率为4.8%，仅次于Cd的7.0%，是我国耕地主要污染物之一[5]. Ni胁迫对植物的毒害作用已有较多报道，Ni毒害表现为抑制种子萌发、影响幼苗根和茎叶生长、导致植物体内活性氧代谢失衡、降低作物产量[6, 7]，因此如何防治Ni胁迫对植物的毒害具有十分重要的现实意义.
褪黑素 (melatonin，MT) 又名褪黑激素，是一种结构简单的小分子量分子，分子式为C13N2H16O2，相对分子质量232.17，熔点为116~118℃.褪黑素广泛存在于动植物体内，具有亲水和亲脂双重性质，能自由进出细胞.早期褪黑素的研究主要集中在哺乳动物，有研究发现MT与生物的个体发育、生殖、中枢神经等调节有关[8].随着检测技术的进步，人们已经在许多植物中发现褪黑素.有研究表明褪黑素对植物逆境胁迫有着显著的缓解作用[9]，这些研究主要集中在植物抵御干旱[10]、低温[11]、高盐[12]、UV辐射[13]、化学胁迫[14]等方面.褪黑素不仅可以作为一种自由基清除剂，还可以通过提高抗氧化系统酶活性来抑制活性氧产生，提高植物抵御各种环境胁迫.包宇等[15]研究发现褪黑素添加可有效缓解番茄幼苗低温胁迫，与对照组相比，番茄叶片的SOD、POD、CAT等抗氧化酶活性均有一定程度的提高，膜脂过氧化程度降低.有研究报道在重金属胁迫下，植物体内褪黑素含量有明显的升高，这暗示内源褪黑素产生是植物应对逆境的一种生理反应[16].笔者最近的研究表明添加褪黑素可缓解Cd胁迫下水稻的种子萌发，促进水稻幼苗生长[17]，但是褪黑素在植物Ni胁迫的影响情况还未见报道.本实验以水稻为材料，研究褪黑素对Ni胁迫下水稻幼芽生长的影响，以期为农业生产中作物Ni毒害防治提供科学依据.
1 材料与方法 1.1 材料水稻品种为早稻潭两优83和晚稻T2优369(以下以X83和X369表示).选取饱满的水稻种子，在实验前均用3% NaClO浸泡消毒10 min，去离子水反复冲洗4~5遍.
1.2 实验设计Ni胁迫浓度的筛选：将消毒洗净后的水稻种子置于培养皿中浸种1 d，挑选整齐露白的种子置于铺有一层滤纸的9 cm培养皿中，每盘20粒，摆好种子后向培养皿中加入8 mL Ni处理液 (7个处理浓度分别为0、10、50、100、200、500、1 000 μmol·L-1)，每个处理重复3次，Ni以Ni (NO3)2·6H2O形式加入.将培养皿放置在28℃生化培养箱中暗培养，记录每个培养皿重量，并用称重法补充蒸发的水分.处理4~5 d后取样.
MT缓解水稻Ni胁迫浓度筛选：将消毒洗净后的水稻种子置于培养皿中浸种1 d，挑选整齐露白的种子置于铺有一层滤纸的9 cm培养皿中，每盘20粒，摆好种子后向培养皿中加入8 mL处理液.处理液设置7个MT浓度 (CK1、CK2、1、5、10、50、100 μmol·L-1)，Ni处理浓度为100 μmol·L-1.每个处理重复3次.其中，CK1表示正常生长的水稻幼芽，无Ni胁迫处理，未添加褪黑素；CK2表示水稻幼芽仅受100 μmol·L-1 Ni胁迫处理，而未添加褪黑素.将培养皿放置在28℃生化培养箱中暗培养，记录每个培养皿重量，并用称重法补充蒸发的水分.处理4~5 d后取样.
MT缓解水稻Ni胁迫实验：将消毒洗净后的水稻种子置于培养皿中浸种1 d，挑选整齐露白的种子置于育苗盆中，摆好种子后向育苗盆中加入等量处理液，使得处理液刚好接触种子.设置4个处理：CK、100 μmol·L-1 Ni、10 μmol·L-1MT、100 μmol·L-1 Ni+10 μmol·L-1 MT.每个处理重复3次.将育苗盆放置在28℃生化培养箱中暗培养，记录每个育苗盆重量，并用称重法补充蒸发的水分.处理4~5 d后取样.
1.3 测定项目与方法 1.3.1 生长指标测定培养4~5 d后测定水稻幼芽的根长、芽长、根鲜重和芽鲜重，其中芽鲜重、根鲜重按每10粒计算.
1.3.2 生理指标测定超氧阴离子产生速率、可溶性蛋白含量、CAT活性和相对电导率的测定均参考文献[18]中的方法.主要测定步骤如下所述.
取0.5 g幼芽，用10 mL提取液 (pH=7.0的50 mmol·L-1磷酸钾缓冲液，其中包含1 mmol·L-1 EDTA，1% PVP-30) 进行冰浴研磨，随后提取液在16 000 r·min-1、4℃下离心15 min.取上清液进行后续测定.
可溶性蛋白含量选用考马斯亮蓝法测定：吸取0.1 mL样品提取液，加入5 mL考马斯亮蓝G-250试剂，摇匀静置10 min后测定595 nm处吸光值，通过标准曲线，换算成样品中可溶性蛋白含量. CAT活性测定使用分光光度法，以每分钟减少0.1为1个H2O2活性单位 (U)，在求得每克鲜样中CAT活性后，换算成CAT比活力. O2-·产生速率使用羟胺氧化法.电导率用电导仪进行测定，将0.5 g洗净、拭干的样品置于烧杯中，加入20 mL去离子水后静置4 h，用手持电导仪 (梅特勒SG3) 测定电导值R1，置于沸水中煮15 min，冷却至室温后测外渗液电导值R2，相对电导率=R1/R2×100%.
采用根系扫描仪 (Epson Expression 10000XL) 对水稻根系进行扫描，并用WinRhizo根系分析软件进行根形态指标分析.
1.4 数据处理本实验数据采用Origin 9.0和SPSS 19统计分析软件进行分析及差异显著性检验.对不同处理数据进行单因素方差分析 (ANOVA) 和Duncan多重比较，数据以平均值±标准差表示.
2 结果与分析 2.1 不同浓度Ni对水稻幼芽的胁迫作用表 1为不同浓度Ni对水稻幼芽生长的影响，从表中可以看出高浓度Ni对水稻幼芽有明显的胁迫作用 (P < 0.05)，而低浓度Ni对水稻幼芽无明显毒害作用.根系扫描结果显示，与对照组相比，当Ni胁迫浓度为100 μmol·L-1时，总根长、根表面积等指标降幅均超过50%.以X83为例，与对照处理相比，10 μmol·L-1和50 μmol·L-1 Ni对水稻根系生长未表现出显著差异 (P>0.05).与对照处理相比，100、200、500和1 000 μmol·L-1 Ni胁迫对水稻X83根系生长有显著负面影响 (P < 0.05)，其对水稻总根长分别降低了63.3%、78.4%、95.8%和98.0%，对根表面积分别降低了56.9%、71.3%、94.7%和96.3%.不同浓度Ni对X369根系生长的影响与X83相似，均在100 μmol·L-1 Ni时开始出现明显胁迫症状，因此选用该浓度作为下阶段实验Ni胁迫浓度.
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表 1 不同浓度Ni胁迫对水稻幼芽根系形态相关参数的影响1) Table 1 Effects of Ni stress on rice root parameters |
2.2 不同浓度MT对水稻幼芽Ni胁迫的缓解作用
表 2为不同MT添加对水稻幼芽Ni胁迫的影响.从中可以看出当添加褪黑素浓度为5 μmol·L-1和10 μmol·L-1时，对X83和X369的缓解效果最为明显 (P < 0.05)，而较低浓度褪黑素 (1 μmol·L-1) 和较高浓度褪黑素 (50 μmol·L-1和100 μmol·L-1) 对Ni胁迫的缓解作用相对较低或无明显缓解作用.以X369为例，与对照处理 (CK1) 相比，在100 μmol·L-1 Ni胁迫时，水稻幼芽总根长和根表面积分别降低了58.4%和55.0%，当添加5 μmol·L-1和10 μmol·L-1褪黑素浓度时，相较于无Ni胁迫的对照处理，水稻幼芽总根长仅降低了33.2%和8.7%，根表面积分别下降了23.3%和9.7%；1、50和100 μmol·L-1褪黑素添加时，对Ni胁迫的缓解作用相对较低或无明显缓解作用，并没有表现出显著差异.不同浓度褪黑素对Ni胁迫下X83根系生长的影响与X369接近，均在5 μmol·L-1和10 μmol·L-1时有明显的缓解作用，其中10 μmol·L-1对两个水稻品种影响均最为显著.与无Ni胁迫的处理相比，在添加10 μmol·L-1褪黑素处理后，水稻总根长仅降低了8.7%~29.1%，显著低于仅有Ni胁迫的58.4%~83.8%.因此选择该浓度作为下一阶段MT添加浓度.
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表 2 褪黑素对Ni胁迫下 (100 μmol·L-1) 水稻幼芽根系形态相关参数的影响1) Table 2 Effects of exogenous melatonin on rice root parameters under Ni stress |
2.3 褪黑素添加对Ni胁迫下水稻幼芽生长的影响
图 1表示10 μmol·L-1褪黑素添加对Ni胁迫下水稻幼芽地上部和根部生长的影响，从中可以看出Ni胁迫可明显抑制水稻根芽的生长.在无Ni胁迫的情况下添加褪黑素对水稻芽生长无明显影响，对根长影响也不显著，但明显提高了根鲜重.当水稻受到Ni胁迫时，添加外源褪黑素对水稻幼芽生长抑制有明显的缓解作用，其中水稻幼芽根系生长的影响较地上部生长的影响更为明显.以X369为例，在仅添加褪黑素时，水稻芽长、根长和芽重与对照处理 (CK) 相比均无显著性差异 (P>0.05)，根重与对照处理相比呈显著差异 (P < 0.05)，提高10.8%.在仅有100 μmol·L-1Ni胁迫时，相较于对照处理，水稻芽长和根长分别下降20.2%和84.7%，芽重和根重分别下降26.3%和89.6%，但是当添加10 μmol·L-1外源褪黑素后，Ni对水稻芽和根生长的抑制作用有明显的降低 (P < 0.05)，与对照处理相比，添加褪黑素后水稻芽长和根长分别仅下降了11.6%和41.3%，芽重和根重分别下降2.0%和16.6%.
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CK：0 μmol·L-1 Ni+0 μmol·L-1 MT；MT：0 μmol·L-1 Ni+10 μmol·L-1 MT；Ni：100 μmol·L-1Ni+0 μmol·L-1 MT；Ni+MT：100 μmol·L-1 Ni+10 μmol·L-1 MT；不同小写字母表示不同处理间差异显著 (P < 0.05)，下同 图 1 外源褪黑素对Ni胁迫下水稻根长、芽长、根重和芽重的影响 Fig. 1 Effects of exogenous melatonin on fresh weight and length of rice seedings |
图 2表示褪黑素添加对水稻幼芽相对电导率的影响，从中看出褪黑素添加可显著降低Ni胁迫下水稻幼芽的电导率 (P < 0.05).以X369为例，与对照处理相比，在无Ni胁迫的情况下，仅添加褪黑素对水稻幼芽相对电导率无明显影响，而Ni胁迫处理明显提高水稻幼芽的相对电导率，达到26.7%；添加褪黑素能明显降低Ni胁迫导致的水稻幼芽电导率的增加.同样，X83品种也看出相同的趋势.与100 μmol·L-1 Ni胁迫处理相比，添加10 μmol·L-1褪黑素能显著地降低两种水稻品种相对电导率25.7%~31.6%.
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图 2 褪黑素对Ni胁迫下水稻幼芽相对电导率的影响 Fig. 2 Effects of melatonin on relative electrolytic leakage in rice seedings under Ni stress |
褪黑素添加对水稻幼芽CAT活性的影响如图 3所示，褪黑素添加能明显提高Ni胁迫下水稻幼芽的CAT活性 (P < 0.05).以X369为例，与对照处理相比，除了单独添加褪黑素处理对水稻幼芽CAT活性无明显影响外，100 μmol·L-1 Ni和100 μmol·L-1 Ni+10 μmol·L-1 MT处理分别导致水稻幼芽CAT活性提高25.2%和52.5%.水稻品种X83也表现出相似的规律.与100 μmol·L-1 Ni胁迫处理相比，添加10 μmol·L-1褪黑素能显著地提高两种水稻品种CAT活性21.9%~33.7%.
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图 3 褪黑素对Ni胁迫下水稻幼芽CAT活性的影响 Fig. 3 Effects of melatonin on CAT activity in rice seedings under Ni stress |
添加外源褪黑素对水稻幼芽O2-·产生速率的影响如图 4所示，褪黑素的添加能明显降低Ni胁迫下水稻幼芽O2-·产生速率 (P < 0.05).以X369为例，在无Ni胁迫时，褪黑素添加对O2-·产生速率无明显影响.单独Ni胁迫时，水稻体内O2-·产生速率比对照组提高130.8%，而100 μmol·L-1 Ni+10 μmol·L-1 MT处理仅比对照组提高53.7%. X83品种也看出相同的趋势.与100 μmol·L-1 Ni胁迫处理相比，添加10 μmol·L-1褪黑素能显著地降低两种水稻品种O2-·产生速率43.2%~50.2%.
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图 4 褪黑素对Ni胁迫下水稻幼芽O2-·产生速率的影响 Fig. 4 Effects of melatonin on O2-· production rate in rice seedings under Ni stress |
图 5表示添加外源褪黑素对水稻幼芽可溶性蛋白含量的影响.褪黑素的添加能明显提高Ni胁迫下水稻幼芽的可溶性蛋白含量.以X369为例，单独Ni胁迫时水稻体内可溶性蛋白含量比对照组降低46.9% (P < 0.05)，与单独Ni胁迫处理相比，100 μmol·L-1 Ni+10 μmol·L-1 MT处理显著提高水稻幼芽体内的可溶性蛋白含量.与100 μmol·L-1 Ni胁迫处理相比，添加10 μmol·L-1褪黑素能显著提高两种水稻品种可溶性蛋白含量82.6%~84.6%.
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图 5 褪黑素对Ni胁迫下水稻可溶性蛋白含量的影响 Fig. 5 Effects of melatonin on soluble protein content in rice seedings under Ni stress |
自1958年Lerner等[19]首次从牛的松果体分离出褪黑素后，在很长一段时间内，人们认为褪黑素是仅存在于动物的一类神经激素[8]，直至近年，其对植物体逆境胁迫方面的作用才逐渐受到重视.本实验研究表明褪黑素添加对水稻Ni胁迫有一定的缓解作用，特别是在缓解Ni胁迫导致的水稻根系生长抑制上效果显著.
本研究结果显示水稻根系生长在低浓度Ni胁迫下有一定的促进作用，但是当Ni浓度提高时，水稻根系生长表现出明显的抑制作用，这一抑制作用在地上部表现得并没有根部明显，这与前人的研究结果相似，即Ni对植物体的胁迫作用在其达到较高浓度时才会表现出来，同时这种胁迫作用首先表现在根部，其次才是地上部[20].褪黑素添加能明显促进水稻幼芽根系生物量的积累，这可能是由于褪黑素能促进水稻根系的新陈代谢过程，加快水稻根系发育，而褪黑素对水稻地上部的影响没有那么明显，这与笔者最近的研究结果相类似[17].
褪黑素对植物体的作用具有较强的浓度依赖性，对于同一品种植物体，不同浓度褪黑素对植物体所受胁迫作用可能是缓解，也可能是加剧相关胁迫作用. Posmyk等[21]研究了不同浓度褪黑素前处理对红叶卷心菜Cu胁迫下种子萌发的影响，发现经过1 μmol·L-1和10 μmol·L-1褪黑素处理后，对无Cu胁迫和有Cu胁迫处理种子的萌发均有促进作用，而100 μmol·L-1褪黑素处理却不利于种子的萌发. Tiryaki等[22]研究艾菊叶法色草种子经过褪黑素前期处理后，发芽率和发芽时间都有明显变化，当褪黑素浓度较高时，褪黑素的影响偏负面.本实验在研究不同MT浓度处理对水稻Ni胁迫的缓解情况时，发现5 μmol·L-1和10 μmol·L-1褪黑素对Ni胁迫下水稻幼芽根系生长的影响最为明显，水稻总根长、总表面积、总体积和分叉数等均比对照处理明显提高，根长、芽长、根重和芽重也比对照处理显著提高，而低浓度和高浓度褪黑素的缓解作用相对较低或无明显缓解作用. Weeda等[23]利用转录组分析发现拟南芥经过褪黑素处理16 h后，低浓度褪黑素处理时，有81个基因的转录水平发生明显变化，其中30个上调，51个下调；高浓度褪黑素处理时，1 308个基因发生明显变化，其中566个上调，742个下调，同时并不是所有被低浓度影响的基因都会被高浓度影响，这也侧面说明了不同浓度褪黑素在植物中的作用不尽相同.由此可见，在使用褪黑素进行植物逆境胁迫缓解研究时，提前筛选合适的处理浓度有着重要的作用.
植物体需要微量Ni维持正常的生命活动，但过量Ni胁迫将会导致植物体内活性氧大量产生和积累，膜脂过氧化加剧，质膜透性显著增大[24].在本实验未添加褪黑素的处理中，添加高浓度Ni (100 μmol·L-1) 胁迫明显提升水稻幼芽中O2-·产生速率，水稻体内CAT活性一定程度的提高并未能阻止活性氧在其体内的积累.活性氧积累加剧了水稻体内膜脂过氧化，使得细胞内可溶性物质外渗，最终表现为水稻幼芽体内相对电导率增加.同时，高浓度Ni胁迫也明显降低了水稻幼芽中可溶性蛋白含量，这可能是由于高浓度Ni胁迫直接或间接影响了植物体内蛋白质的合成以及蛋白酶的活性.本研究实验结果表明，高浓度Ni胁迫下，10 μmol·L-1褪黑素的添加显著地提高了水稻幼芽CAT活性，降低了O2-·产生速率，从而有效地缓解了水稻幼芽的膜脂过氧化，并表现为水稻幼芽体内相对电导率的下降.同时，适宜浓度褪黑素添加显著提高Ni胁迫下水稻幼芽的可溶性蛋白含量，这与Hasan等[25]在研究褪黑素缓解西红柿Cd胁迫所得的结果相吻合，该研究发现褪黑素处理的西红柿体内不仅谷胱甘肽含量明显增加，植物螯合肽等含量也较之对照组有明显升高.
4 结论(1) 高浓度Ni胁迫对水稻幼芽生长有明显的抑制作用，适宜浓度外源褪黑素的添加对Ni胁迫下水稻幼芽生长有明显的促进作用，但是外源褪黑素浓度过高时则未表现出明显的促进作用.
(2) 添加外源褪黑素显著提高Ni胁迫下水稻幼芽抗氧化酶CAT的活性，降低O2-·产生速率，进而降低了Ni胁迫下水稻幼芽的相对电导率，说明添加外源褪黑素能有效缓解Ni胁迫导致的水稻幼芽膜脂过氧化.
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