2017, Vol. 38
2. 中国科学院大学, 北京 100049
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China
氧化亚氮 (N2O) 是三大温室气体之一，其百年尺度单分子增温势 (global warming potential) 是CO2的298倍，对全球变暖的贡献约为6%[1, 2].到2050年大气中N2O的摩尔分数将从2001年的314×10-9增加到350×10-9~400×10-9[3]，将对全球气候和环境造成严重的威胁.农业土壤是最主要的N2O来源，每年仅因施用化学氮肥产生的N2O-N约150万t，占人类活动排放N2O-N量的44%[4].然而，排放到大气被检测到的N2O只是土壤中N2O产生与消耗过程综合作用后的动态结果，且由于土壤中N2O的产生速率往往高于其消耗速率，绝大多数研究只关注N2O净产量，而忽略了N2O净消纳量的可能性[5]. N2O净消耗现象在1976年就被首次发现，到目前为止，已有很多研究报道了显著而频繁的N2O净负通量现象，但是却由于缺乏证据而未做过多探讨[6~10].土壤不仅仅可以作为大气N2O的净源 (N2O source)，有时也可暂时作为N2O的汇库 (N2O sink)[11].在当前全球变暖的环境压力下，土壤N2O负排放的研究应该得到高度重视，充分认识土壤N2O消耗能力及其调控机制对于全球N2O的减排意义重大.
土壤由于其固有的机械组成和孔隙结构可在一定程度上截留一部分土体N2O，延长N2O在土体中的滞留时间而不轻易地扩散至大气中，但最终N2O的完全消耗只能通过微生物作用还原为N2.通常情况下异养细菌在呼吸过程中将N2O还原为N2的反硝化作用被认为是N2O消耗的主要原因[12].氧化亚氮还原酶 (Nos) 在反硝化过程中主导N2O的还原，因此以氧化亚氮还原酶基因 (nosZ) 为靶基因揭示微生物种群的N2O消耗还原能力是较直观的[13].有研究表明Nos酶对O2浓度的敏感性更高，低氧浓度和高水分含量可促进Nos酶活性的增加，并显著高于其他反硝化酶，从而促进N2O吸收消耗[14~16].有研究表明淹水或厌氧的环境有利于土壤N2O的负吸收，在含水率较高的泥炭地、湿地等土壤生态系统中N2O的吸收达到最大[17].水稻田是一种长期处于淹水缺氧状态中的人工湿地系统，土壤环境极有利于其反硝化脱氮和N2O充分还原[18, 19].淹水状态下的稻田土壤具有很强的N2O消耗潜力，但调控土壤N2O消耗容量的微生物机制并不清楚.本研究以表层水稻土壤为应试对象，通过严格厌氧密闭培养的方法探究表层水稻土壤对不同浓度的N2O消耗能力差异以及含nosZ基因的反硝化微生物丰度的差异，进而揭示厌氧状态下水稻土中调控N2O消耗过程的微生物机制，以期为调控水稻田温室气体排放提供重要的科学参考.
1 材料与方法 1.1 土样采集与预处理土样采集自湖南益阳水稻丰产节水节肥试验田 (29°08′N, 112°27′E)，为多年种植双季稻土壤.土壤母质为湖积物，质地为粉 (砂) 壤土 (美国制土壤质地分类).采集时间为2016年4月 (翻耕前2周)，此时土壤处于休耕渍水状态.采用随机多点采样法，采集0~5 cm水稻土壤并混匀.取回后将土壤水分调至50%(质量分数) 后充分混匀成泥浆状，在28℃±1℃温室预培养10 d后待用，预培养结束时的泥浆水稻土视为起始土样 (S)，其基础理化性状见表 1.
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表 1 应试土样基础理化性质1) Table 1 Physicochemical properties of paddy soil |
1.2 培养实验设计及样品采集
培养装置主体为1 L广口瓶，盖以橡胶塞进行培养.橡胶塞中间钻一小孔 (d=5 mm) 用于连接三通阀，密封后用于气体样品的采集.本实验设置5个N2O含量添加处理，分别使瓶内气体N2O摩尔分数为0、20、200、1 000、3 000 μmol ·mol-1(N0、N20、N200、N1000、N3000处理)，每处理3重复，总计15瓶.经单位转换计算后，5个处理中N2O质量浓度应为0、35.63、356.31、1 781.56、5 344.68 μg ·L-1.分别称取混匀的泥浆100 g±5 g置于广口瓶底部，加入30 mL双蒸水使水稻泥浆表层有自由水层，为水分过饱和状态.橡胶塞密闭广口瓶后，用真空泵抽真空后补足高纯He气，反复操作3次确保瓶内空气基本置换完毕后，外源充入N2O分别使瓶内N2O含量达到设定水平，立即置于恒温培养室 (28℃±1℃) 开始培养计时，培养时间共计145 h.
气体样品采集：用30 mL注射器分别在密闭培养的0.5、1.5、2.5、4.5、7、12.5、22、26、30、36、46.5、57.5、70、80、94、103、118、128、145 h采集广口瓶中气体样品30 mL于12 mL真空血清瓶中用于N2O含量的测定.每次采集气体样品前用注射器反复抽打广口瓶上层空间气体15~20次使瓶内气体混匀，气体样品采集后立即补入30 mL高纯He保证瓶内气压平衡.
土壤样品采集：共采集两次土样，分别为培养前处理获得的起始土样和培养结束时采集的土样.待145 h气体样品采集完后立即采集广口瓶内土壤样品.倒掉自由水后用灭菌后的小勺充分混匀土样，取出约20 g土样迅速用锡箔纸包裹，经由液氮速冻，放入-80℃保存用于相关分子生物学分析.将瓶内剩余土样装入密封袋，放入4℃保存用于无机氮及DOC含量分析，并在72 h内完成测定.
1.3 N2O浓度，无机氮和DOC测定N2O浓度采用温室气体气相色谱仪 (GC 7890A) 测定.以高纯N2作为色谱柱载气，气流速度28 psi (193 kPa)，检测器温度为300℃，柱箱温度为50℃，检测器为微池电子捕获器63Ni-ECD.
无机氮及DOC含量测定采用硫酸钾共提法浸提.称取约10 g土样，置于100 mL塑料振荡瓶中，加入50 mL 0.5 mol ·L-1 K2SO4溶液浸提，在振荡机上振荡1 h后用滤纸过滤悬浊液，澄清滤液分别采用连续流动分析仪 (Flastar 5000 Analyzer) 和C/N分析仪测定硝态氮、铵态氮含量和DOC含量.
1.4 功能基因丰度测定土壤样品的DNA提取方法主要参考Chen等的方法[20]，并在此基础上做了适当调整和修改.提取的DNA由Nanodrop ND-1000UV-Vis分光光度计测定DNA浓度和质量系数，并通过1%凝胶电泳检测DNA完整度，满足条件后用于qPCR分析.
16S rDNA和nos Z基因PCR分析用引物分别为1369F (5′-CGG TGA ATA CGT TCY CGG-3′) 和1492R (5′-GGW TAC CTT GTT ACG ACT-3′)[21]，nosZ-1126F (5′-GGG CTB GGG CCR TTG CA-3′) 和nosZ-1381R (5′-GAA GCG RTC CTT SGA RAA CTT G-3′)[20].实时PCR扩增所用的仪器为ABI PRISM 7900 (Applied Biosystems)，实现荧光检测和样品浓度测定.标准曲线分别用含16S rDNA和nosZ基因的质粒为模板，以10倍梯度稀释法配制. 16S rDNA和nosZ基因PCR扩增反应体系为 (10 μL)：上下游引物各0.2 μL，SYBRGreen (Takara)5 μL，Rox 0.2 μL，DNA模板5 ng (1 μL)，补水至10 μL. nosZ基因qPCR程序为：95℃ 30 s预变性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 10 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s校正溶解曲线. 16S rDNA基因qPCR程序为：95℃ 30 s预变性；95℃ 5 s，60℃ 30 s，40个循环；95℃ 15 s，60℃ 15 s，95℃ 15 s校正溶解曲线.所有样品重复3次并设置阴性对照，溶解曲线分析和琼脂糖凝胶电泳鉴定产物的特异性.
1.5 数据统计分析和处理数据的统计分析均采用SPSS 13.0软件进行分析. N2O浓度、无机养分浓度以及功能基因丰度处理间的差异性分析采用单向方差分析 (One Way ANOVE，LSD检验). N2O浓度与消耗速率的关系采用线性回归分析拟合.图形制作采用Orgin Pro 9.0软件完成.
2 结果与分析 2.1 不同浓度N2O消耗规律不同浓度的N2O处理后，上层空间N2O浓度在0.5 h时均略高于设定浓度值约1.50~106.78 μg ·L-1(表 2).但在1.5 h时上层空间中的N2O浓度已基本低于设定值，表明厌氧培养前期水稻土中反硝化过程持续进行而释放了部分N2O.随后，水稻土上层密闭空间中的N2O浓度随厌氧培养时间的延长均呈现明显的下降趋势 (图 1). N20处理在培养了70 h左右时空间内N2O基本已消耗至对照水平 (N0)，而N200处理中N2O消耗至对照水平耗时105 h左右，两个处理N2O在厌氧培养结束时 (145 h) 已被消耗完全 (表 2).与之不同的是，高水平的N2O添加 (N1000、N3000) 处理中上层空间N2O浓度在厌氧培养145 h后仍维持较高水平，分别达到70.70 μg ·L-1和234.20 μg ·L-1，但此时的N2O浓度也仅为培养起始时N2O浓度的4.13%左右.经过进一步计算发现，N0、N20、N200、N1000和N3000处理中N2O平均消耗速率分别为0.20、5.96、54.11、237.38和719.46 μg ·(kg ·h)-1.线性回归分析结果表明N2O平均消耗速率 (y) 与培养开始时上部空间的N2O浓度 (x) μg ·L-1呈极显著的线性正相关关系 (P < 0.001)(图 2).综合4个水平N2O处理的结果表明即使外源添加的N2O含量相差10~150倍，同一水稻土壤在完全厌氧条件下也能够基本消耗完这些外源添加的N2O，进一步说明淹水水稻土具有极强的N2O消耗潜力.
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数值代表平均值 (n=3)±标准误 图 1 不同N2O浓度添加处理后上层空间N2O浓度随厌氧培养时间的变化规律 Fig. 1 Dynamics of N2O concentrations in headspace of five N2O treatments during anaerobic incubation |
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表 2 厌氧培养前后土壤上层空间中N2O浓度/μg ·L-1 Table 2 N2O contents in headspace before and after the anaerobic incubation/μg ·L-1 |
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图 2 厌氧培养中N2O起始浓度与N2O平均消耗速率的关系 Fig. 2 Relation between N2O initial concentrations |
通过厌氧培养前后的土壤无机养分含量对比研究发现 (图 3)，培养前土壤中的无机氮 (NO3--N、NH4+-N) 含量显著高于厌氧培养后的土壤 (P < 0.05).土壤本底含有的NO3--N含量较低，仅有3.38 mg ·kg-1，但经过145 h厌氧培养期，土壤NO3--N含量被大量消耗了2.09~2.40 mg ·kg-1，约占土壤本底NO3--N含量的61.73%~71.08%.这些被消耗的NO3--N极大可能是在厌氧培养前期被水稻土中反硝化微生物作为底物利用而产生N2O.与此同时，土壤NH4+-N含量也被大量消耗了21.91~23.80 mg ·kg-1，约占土壤本底NH4+-N含量的35.97%~39.08%，但不同N2O浓度处理的土壤间并无显著差异.被消耗的NH4+-N可能通过硝化微生物的反硝化作用而生成N2O.与无机氮消耗规律不同的是，经过145 h厌氧培养后，低浓度N2O处理 (N0、N20、N200) 的土壤DOC消耗量约为113.05 mg ·kg-1，与培养前土壤DOC含量无显著差异，而高浓度N2O处理 (N1000、N3000) 的土壤DOC含量约消耗了160.60 mg ·kg-1，145 h时的含量显著低于培养前土壤 (P < 0.05).
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图柱代表每处理3个重复的测定平均值，误差线代表标准误；图柱上相同的字母代表差异不显著 (P < 0.05), 下同 图 3 土壤无机养分含量在不同N2O水平处理前后的差异规律 Fig. 3 Soil NH4+-N, NO3--N and DOC concentrations in different treatments |
图 4显示低浓度N2O处理 (N20、N200) 中16S rDNA基因丰度相比于N0处理略升高了4.53%左右，而N1000、N3000处理中16S rDNA基因丰度比N0处理增加了19.34%左右；同时低浓度N2O添加使氧化亚氮还原酶基因nosZ丰度提高了约17.6%，而高浓度的N2O添加则使nosZ基因丰度升高了23.13%.但通过对不同N2O浓度处理中的细菌16S rDNA与反硝化nosZ基因丰度进行差异性分析发现，两个基因的拷贝数量在不同处理间均无显著差异，淹水水稻土壤16S rDNA基因拷贝数平均为2.84×1011 copies ·g-1，nosZ基因拷贝数平均为6.67×108 copies ·g-1, 表明培养条件下DNA水平上的nosZ基因丰度变化可能并不是决定土壤N2O消耗能力差异的关键因子.
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图 4 不同水平N2O处理下反硝化功能基因nosZ和细菌16S rDNA基因丰度的差异 Fig. 4 16S rDNA and nosZ gene abundancesin soil samples from different treatments |
土壤是大气N2O的主要排放源，但越来越多的研究发现土壤也能够从大气中吸收转化N2O而成为N2O的有效汇库[11].厌氧、丰富的有机碳、低NO3-浓度和高水分含量常被认为是促进土壤N2O消耗的有利条件，因为土壤通过反硝化作用还原N2O为N2的过程在这些环境条件下被极大推动[5, 6].本研究中所有处理的上部空间N2O浓度均出现明显的降低趋势，表明无论环境N2O浓度高低，水稻土壤在实验条件下都具备吸收消耗N2O的能力.这是因为应试土壤的培养条件均被设定为淹水厌氧培养，使土壤微生物活动以厌氧反硝化作用为主.厌氧反硝化作用通常被认为是调控土壤N2O消耗还原的主要过程[12].在反硝化过程中，有效碳源的供应能够促进土壤微生物的生长，当给土壤额外添加有效碳含量500 mg ·kg-1左右时，反硝化微生物对N2O的吸收量显著增加[6]. Mathieu等[22]指出土壤有机碳的可利用率与土壤N2产量紧密相关，高浓度的可用有机碳能够促进土壤厌氧环境的进一步加强.虽然本研究中并未对土壤外源添加有机碳，但应试土壤本底DOC含量较充足，为417.74 mg ·kg-1，能够提供土壤微生物活动所需.此外当土壤中NO3-含量很低的时候，大气或土壤中的N2O就可能成为反硝化作用的唯一电子受体而被还原为N2，因此N素限制的生态系统常常会被认为是N2O负排放区域[5, 17, 23]. Ryden[24]和Rosenkranz等[25]报道认为土壤N2O负排放现象的出现与土壤中低水平的NO3-含量 ( < 1 mg ·kg-1) 直接相关.应试土壤中反硝化微生物活动可利用的NO3--N含量水平较低，仅为3.38 mg ·kg-1，十分利于土壤对N2O的消耗活动.因此，土壤本底无机养分特征 (高DOC、低NO3--N) 及应试培养条件 (厌氧、淹水) 使得表层水稻土壤的N2O吸收消耗能力充分发挥，从而在所有处理中都出现了极为显著的N2O负排放现象.
越来越多的研究表明具有强烈厌氧环境的湿地土壤会促使土壤N2O频繁的被消耗还原为N2而成为大气N2O的汇库. Schlesinger[17]通过综合分析后发现旱地土壤N2O平均吸收潜力约为4 μg ·(m2 ·h)-1，而土壤N2O的最高吸收值[100~207 μg ·(m2 ·h)-1]基本都出现在含水率较高的泥炭地、湿地等土壤生态系统中. Majumdar[26]通过综合比较也发现淹水稻田N2O吸收量显著高于旱地土壤，且淹水稻田N2O的吸收量范围为0.13~191 μg ·(m2 ·h)-1.本研究中水饱和状态的水稻土壤对N2O的吸收速率为0.20~719.46 μg ·(kg ·h)-1，单位面积换算后为1.24~4 567.99 μg ·(m2 ·h)-1，最大消耗速率已显著高于前述报道的最大值.环境N2O摩尔分数提高至1 000 μmol ·mol-1和3 000 μmol ·mol-1时，N2O吸收速率增加了一个数量级，超过1 000 μg ·(m2 ·h)-1，表明厌氧土壤吸收N2O的潜力深不可测.因此弄清土壤对N2O巨大的消耗能力是土壤固有性状，还是外部环境刺激，亦或是两者共同作用调控十分必要.
作为一个整体系统，土壤与外界环境间存在频繁的物质交换和能量流动.当土壤临界面出现N2O浓度差时，大气与土体中N2O开始进行对流和交换，N2O从高浓度区域向低浓度区域迁移，浓度差值越大，气体交换越频繁[27]，从而使单位时间内进入土壤被微生物利用的还原基质N2O就越多.通过线性回归分析发现水稻土N2O消耗速率与环境中N2O浓度呈极显著的线性正相关关系，表明高浓度的环境N2O刺激了土壤N2O消耗能力增强.当大气中的N2O通过被动扩散和对流方式进入土体后，除了通过反硝化作用还原为N2，少量N2O也可能转化生成NH4+[28].本研究中高摩尔分数N2O (1 000 μmol ·mol-1、3 000 μmol ·mol-1) 处理的土壤NH4+-N含量与低摩尔分数N2O (0、20、200 μmol ·mol-1) 处理无显著差异，表明被土壤吸收的N2O被微生物转化为无机态的NH4+-N的可能性较低，而应该是通过其他途径被消耗，比如完全反硝化还原为N2或同化为微生物生物量氮.
反硝化作用是在一系列反硝化酶 (Nar、Nor、Nir和Nos酶) 的顺次作用下发生的微生物还原过程，氧化亚氮还原酶基因 (nosZ) 参与催化N2O向N2转化.当土壤含水量超过饱和含水率时，完全厌氧的环境使厌氧高敏感的Nos基因所合成的酶活性显著增强并超过其他3种反硝化酶，有利于反硝化作用彻底进行而形成N2O的消耗[27]. Liu等[29]在培养条件下发现持续淹水状态下的0~20 cm水稻土nosZ基因绝对丰度为5.2×106~9.3×106 copies ·g-1，Yang等[30]也在相同状态下发现0~6 cm水稻土nosZ基因绝对丰度为5.0×106~2.1×107 copies ·g-1.本研究5个处理中土壤nosZ基因的绝对丰度均达到108 copies ·g-1，明显高于上述淹水土壤，表明该土壤含nosZ基因的微生物数量在培养条件下已快速增长，使土壤本身具备较强的N2O转化潜力.在这种前提下，还原底物N2O的增加可能进一步刺激功能微生物的增加. Majumdar[26]就指出当N2O成为环境中唯一的电子受体时，N2O还原微生物的数量是影响N2O最终浓度的唯一因素.但本研究结果却显示不同浓度N2O处理间nosZ基因的绝对丰度 (DNA水平) 没有显著差异，说明在土壤N2O还原微生物的数量已达到较高水平时，nosZ基因丰度可能已经不是限制N2O还原的关键因子.值得注意的是，DNA水平上的nosZ基因数量并不能完全代表土壤微生物的N2O还原活性，Uchida等[31]研究表明在DNA水平上反硝化基因 (nirS、nirK、nosZ) 与N2O排放无显著相关性，但在mRNA水平上显著相关，因此为探明环境N2O浓度对N2O消耗能力的影响可以从mRNA水平上进一步深入研究.此外，非典型nosZⅡ基因的发现与鉴定也为理解N2O还原途径多样性提供了全新的思路，这是一种与常规nosZ基因相关但具有进化差异的基因，并且被认为是一种有效的、丰富存在于陆地生态系统的N2O还原酶基因[32, 33].
4 结论水稻土因为长期处于淹水厌氧状态而具有强大的N2O吸收消耗能力，土壤中极低水平的NO3--N含量以及高水平的DOC含量在一定程度上促进了土壤完全反硝化作用的完成.环境N2O浓度与N2O消耗速率显著正相关 (P < 0.001)，在高浓度的环境N2O刺激下，N2O消耗速率能够达到4 567.99 μg ·(m2 ·h)-1，远远超出已报道的最大值，说明土壤吸收消耗N2O的潜力巨大，并且这种潜力的发挥可能与氧化亚氮还原酶基因 (nosZ) 的数量变化有一定联系.
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