2017, Vol. 38
2. 南京农业大学资源与环境科学学院, 南京 210095
2. College of Resources and Environmental Sciences, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China
土壤氮循环是地球化学循环的重要组成部分，不但影响着土壤生产力和可持续发展，还影响着全球气候变化[1].土壤微生物在土壤氮循环中发挥着不可替代的作用，其中硝化和反硝化微生物是土壤氮循环的重要驱动者，对土壤中N浓度、N损失、N2O的排放有关键的调节作用，因而它们在土壤氮库调节方面起着不可替代的作用[2].
硝化作用主要指土壤中硝化菌将氨盐氧化成硝酸盐的过程，该过程分为氨氧化和亚硝酸氧化两个阶段，是土壤生物过程产生N2O的来源之一.氨的氧化是硝化过程的限速步骤，参与氨氧化的微生物包括氨氧化古菌(ammonia-oxidizing archaea, AOA) 和氨氧化细菌(ammonia-oxidizing bacteria, AOB)[3].反硝化作用是指在厌氧条件下，由反硝化细菌将硝酸盐还原成NO、N2O和N2的过程[4]，这一过程通常导致土壤有效氮的损失，被认为是大气中N2O的主要来源.反硝化作用最为关键的一步反应是在亚硝酸盐还原酶催化下将NO2-还原为NO的过程，此酶包括含细胞色素cd1的还原酶NirS和含Cu的还原酶NirK[5]，分别由基因nirS和nirK编码.这两个基因已成为研究反硝化细菌多样性及其丰度的常用分子标记物.
以大气CO2浓度和温度升高为主要特征的气候变化提高了植物的生长发育，对土壤环境产生了直接和间接地影响，并通过影响植物生长而间接地影响土壤微生物[6].由于土壤微生物对气候变化引起的环境因子的改变比较敏感，全球气候变化将改变N循环过程中的微生物[7].有研究表明，大气CO2浓度升高对土壤硝化和反硝化的微生物过程有重要的影响[2, 8].大气CO2浓度升高和升温等因素改变了氨氧化菌的群落结构和丰度[9, 10]. Baggs等[11]发现在草地FACE (free air CO2 enrichment, 开放式空气CO2浓度升高) 条件下反硝化活性明显增强，其原因主要是地下碳的增加为反硝化提供了能量.但是，利用FACE系统平台有研究发现大气CO2浓度升高并未明显改变土壤硝化和反硝化菌群的数量[12, 13].升温会增强土壤微生物的活性进而促进土壤有机质分解和无机氮的释放，同时，还会影响参与氮循环过程的氨氧化细菌和古菌、反硝化细菌，进而改变由此驱动的土壤硝化和反硝化过程[14, 15].
由于CO2浓度和温度升高的水平、土壤特性和植物类型的不同，土壤微生物对不同气候变化因子的响应也存在差异[16, 17].本课题组依托同步模拟大气CO2浓度和温度气候变化基地，以我国太湖地区稻麦轮作系统为研究对象.在水稻生长季，本研究发现在水稻不同生育期，AOA和AOB对大气CO2浓度升高和升温的响应存在差异；同时，大气CO2浓度升高处理显著提高了稻田土壤硝化速率，而单独升温只在抽穗期提高土壤硝化速率[18].由于小麦和水稻季的水分管理方式不同，因此，麦田土壤N循环功能微生物群落对大气CO2浓度升高和升温的响应势必与水稻土壤有所不同.为此，本试验以小麦季作为研究对象，分析大气CO2浓度和温度升高对土壤N循环微生物的影响及其作用机制，可帮助人们在未来全球气候变化背景下，进一步完善对农田生态系统响应的认识，提高作物对未来全球变化的适应能力.
1 材料与方法 1.1 试验地概况与试验设计气候变化试验基地位于江苏省常熟市古里镇(31°30′N, 120°33′E).该地区属于亚热带季风气候，年平均温度16℃，年平均降水量大于1 100 mm，年日照时间大于2 000 h，年无霜期大于200 d，对太湖地区的生态环境、气候特征具有广泛的代表性.耕作方式为夏水稻、冬小麦轮作.该地区土壤类型为太湖地区典型的水稻土-乌栅土，表层土壤(0~15 cm) 基本性质: pH为7.0，容重为1.2 g·cm-3, 有机碳含量19.2 g·kg-1，总氮含量1.6 g·kg-1，总磷含量0.9 g·kg-1，总钾含量15.0 g·kg-1.
本试验平台为模拟未来近地表大气CO2浓度升高(500×10-6) 和温度升高(2℃) 对农业系统的影响.该模拟气候变化平台建于2010年，共设置4个处理:大气CO2浓度升高处理(atmospheric CO2 enrichment, CE)；温度升高处理(warming of canopy air, WA)；大气CO2浓度和温度同时升高处理(interactive CO2 enrichment and warming, CW)，以及正常CO2浓度和温度的对照处理(CK).每个处理各设3个重复，共计12个处理小区，每个试验圈为八边形构造，面积约45 m2.为了避免设备干扰的影响，所有处理圈从外观上保持一致，CO2处理圈和对照圈中均安装了升温圈中的红外灯罩，升温处理圈安装了CO2释放管.平台设计如图 1所示.
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图 1 野外模拟气候变化试验平台示意 Fig. 1 Schematic diagram of simulated climate change field condition platform |
小麦供试品种为扬麦14号，在2012年11月水稻收获后即种植小麦.选取了小麦季3个生育期进行采样:分蘖期(3月5日)、抽穗期(4月24日) 和成熟期(5月23日)，采集0~15 cm的耕层根际土壤.根据不同生育期植株根系发育情况不同，随机选择3~5株植株，采用抖根法收集根围0~2 mm范围内土壤作为根际土壤，每个圈内根际土壤充分混合.混合新鲜土样去除碎石、秸秆及动植物残体后过2 mm筛，过筛后的混合样品被装入无菌自封袋于低温带回实验室.将样品分为2份:第一份存储于4℃冰箱，以测定土壤硝化和反硝化速率；第二份存储于-20℃，以供土壤总DNA提取.
1.3 定量PCR技术(qPCR) 测定土壤微生物丰度采用MOBIO公司的土壤DNA快速提取试剂盒(PowerSoilTM DNA Isolation Kit, Mo Bio Laboratories Inc., CA) 提取土壤微生物基因组DNA.用NanoDrop ND-1000微量分光光度计测定DNA浓度，然后稀释到15 ng·μL-1.
功能基因的定量分析采用SYBR GREEN法，反硝化细菌功能基因nirK、AOA和AOB的amoA基因的定量分析引物分别为nirK876/nirK1040、Arch-amoAF/Arch-amoAR、amoA-1F/amoA-2R.定量PCR采用25 μL反应体系: 12.5 μL扩增酶混合物SYBR premix EX TaqTM，9.5 μL无菌超纯水，10 μmol·L-1正反向引物各1 μL，DNA模板1 μL (15 ng).每次扩增均做溶解曲线分析以确保荧光信号来自于目标PCR产物而非引物二聚体或其它杂质.本试验用于制作标准曲线的质粒的拷贝数为103~109，AOA的PCR扩增效率在98%和109%之间，R2值大于0.99，AOB的PCR扩增效率在95%和106%之间，R2值大于0.98，反硝化菌(nirK) 的PCR扩增效率在92%和104%之间，R2值大于0.98.结果以每克干土重的基因拷贝数(copies·g-1) 表示.
1.4 末端限制性片段多态性分析(terminal-restriction fragment length polymorphism, T-RFLP) 技术测定土壤微生物群落结构用具有6-FAM标记的上述引物分别扩增AOA、AOB和反硝化细菌基因片段.扩增体系为50 μL: 25 μL扩增反应液(Go Taq Green Master Mix, Promega)，10 μmol·L-1正反向引物各2 μL，20 μL无菌水及1 μL DNA模板. AOA和AOB纯化产物分别用HhaⅠ和AfaⅠ(Takara) 酶切消化，反硝化细菌纯化产物用HaeⅢ (Takara) 酶切消化.酶切反应体系: 10×Buffer 2 μL，DNA 200 ng，0.1% BSA (bovine serum albumin, 牛血清白蛋白) 2 μL，无菌水补足20 μL.将酶切产物送上海生工测序. T-RFLP图谱中选择的限制性片段(T-RF) 范围在50~550 bp，在平行试验的图谱中重复出现的峰纳入统计分析，并去除丰度＜1%的T-RFs.每个T-RF的相对丰度为其峰高占总峰高的比值，T-RFs片段大小±1bp被认为是同一片段.根据图谱中T-RFs的数目及其相对丰度进行主成分分析和多样性指数(香农指数) 计算，香农指数(Shannon index) 的计算公式如下:
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式中，ni是第i个T-RF的相对丰度值，i是T-RFLP图谱上的每个T-RF的编号，N是T-RFLP图谱上每个样品所有选择T-RF的相对丰度总和.
1.5 土壤硝化和反硝化速率的测定用短期培养方法测定土壤硝化速率[19].称取20 g新鲜土样于250 mL三角瓶中，向其中加入100 mL 0.5 mmol·L-1磷酸缓冲液(pH 7.2)，该缓冲液中含有0.5 mmol·L-1 (NH4)2SO4和10 mmol·L-1 KClO3 (阻止NO2-进一步氧化). 25℃恒温振荡24 h，在培养4、8、12和24 h时，取出5 mL土壤悬浊液，立即加入5 mL 3.5 mol·L-1 KCl溶液以阻止NH4+进一步氧化，3 000 r·min-1离心5 min.取5 mL滤液到25 mL比色管中，再加入2 mL对氨基苯磺酸(H2NC6H4SO3H，4 g·L-1) 和1 mL盐酸萘乙二胺(C12H16N2Cl2，2 g·L-1) 试剂，最后用去离子水定容至25 mL. 0.5 h后，用紫外/可见分光光度计在波长538 nm比色测定.试验处理中设空白对照.在NO2-产生随时间而增加的线性范围，以培养12 h内NO2-浓度的净增加量为土壤的硝化速率，单位为mg·(kg·h)-1.
反硝化速率测定采用淹水厌氧密闭培养-乙炔抑制法.称取20 g新鲜土样于250 mL三角瓶中，按水土比1:1加入1 mmol·L-1葡萄糖和1 mmol·L-1硝酸钾的混合溶液，用橡胶塞密封瓶口，向瓶中通入高纯N2以除尽瓶中的空气.用50 mL注射器取出一定量的气体，然后加入相同量的C2H2，使玻璃瓶内C2H2终体积分数为10%，然后立即将采气口用硅胶密封以确保瓶内为厌氧环境.将玻璃瓶置于25℃摇床上振荡(200 r·min-1) 培养9 h，每隔1.5 h间隔采集气体，N2O测定以带有ECD电子捕获检测器的气相色谱仪(Agilent 7890A，美国) 进行，最后计算加入C2H2后9 h内的N2O线性增加量.
1.6 数据处理所有结果表示为平均值±标准差.用方差分析(ANOVA) 检验同一采样时期处理之间差异是否显著(Duncan-test).相关性用直线相关分析，采用Spearman相关系数计算，双尾显著性检验.微生物群落结构与环境因子关系的分析用CANOCO 4.5软件中的冗余分析(redundancy analysis, RDA) 来完成.
2 结果与分析 2.1 大气CO2浓度和温度升高对土壤NH4+-N和NO3--N含量的影响从表 1可以看出，土壤NH4+-N含量随着小麦生长而逐渐升高，在成熟期达到最高(CW, 8.29 mg·kg-1)；但是，土壤NO3--N含量随着小麦生长而逐渐降低，在成熟期达到最低(CK, 6.64 mg·kg-1).在小麦季3个生育期内，不同气候变化处理对土壤NH4+-N含量没有影响，而在成熟期，CE、CW和WA处理的NO3--N浓度比对照显著提高(P＜0.05).
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表 1 土壤NH4+-N和NO3--N含量以及AOA、AOB和反硝化细菌多样性指数(H′)1) Table 1 Concentrations of soil NH4+-N and NO3--N, Shannon-Wiener index (H′) of AOA, AOB and denitrifier |
2.2 大气CO2浓度和温度升高对硝化和反硝化微生物丰度的影响
小麦季土壤AOA、AOB和反硝化细菌基因拷贝数如图 2所示，AOA和AOB基因丰度分别在8.63×106~3.27×107 copies·g-1和3.07×106~4.14×107 copies·g-1，其对大气CO2浓度升高和升温的响应存在差异.与对照相比，CE和WA处理显著提高了AOA丰度，而CW处理对其没有影响.但是，在抽穗期和成熟期，CE处理显著提高了AOB丰度，CW处理仅是提高了抽穗期的AOB丰度，而WA处理降低了成熟期的AOB丰度.
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图 2 AOA、AOB和反硝化细菌功能基因丰度 Fig. 2 Abundance of AOA, AOB and denitrifier genes |
相对于土壤AOA和AOB，反硝化细菌数量相对较高，基因数量在3.68×107~1.23×108 copies·g-1.在分蘖期，不同处理的反硝化细菌丰度没有显著变化；而在抽穗和成熟期，CE处理的反硝化细菌丰度与对照相比显著提高，而CW和WA处理的反硝化细菌丰度没有变化.
2.3 大气CO2浓度和温度升高对硝化和反硝化微生物群落结构的影响本试验通过T-RFLP技术对土壤N循环功能微生物群落结构进行分析，其多样性结果如表 1所示，AOA、AOB和反硝化细菌多样性对大气CO2浓度升高和升温有不同的响应.在分蘖期和抽穗期，CE和CW处理提高了AOA多样性，WA处理提高了抽穗期的AOA多样性，而在成熟期，气候变化处理对AOA多样性没有影响.但是，AOB群落在模拟气候变化条件下比较稳定，CE、CW和WA处理对AOB多样性均无影响.相反，反硝化细菌多样性在小麦不同生育期对CO2浓度升高和升温的响应各不相同.
对微生物群落结构组成与环境变量、基因丰度进行了冗余分析(RDA)，结果(如图 3和图 4) 表明，X轴和Y轴分别能够解释AOA、AOB和反硝化细菌群落结构总变异量的53%、53%和51%，在分蘖、抽穗和成熟期之间，AOA、AOB和反硝化细菌群落没有明显分开.在所分析的5个变量中，NH4+-N和AOA基因丰度对AOA基因的多样性组成具有显著影响，NH4+-N和AOB基因丰度对AOB基因的多样性组成具有显著影响，而只有nirK基因丰度对反硝化细菌基因丰度具有显著影响.
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图 3 土壤AOA和AOB基因群落与土壤基本性质的RDA分析 Fig. 3 RDA analysis based on the T-RFLP patterns and soil properties of AOA and AOB in sampled soils |
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图 4 土壤反硝化细菌群落与土壤基本性质的RDA分析 Fig. 4 RDA analysis based on the T-RFLP patterns and soil properties of denitrifier in sampled soils |
小麦季土壤的硝化和反硝化速率如图 5所示，硝化速率的变化从1.15 mg·(kg·h)-1(WA，抽穗期) 到5.09 mg·(kg·h)-1(CE，成熟期).土壤硝化速率在抽穗期最低，但在成熟期达到最高值.在小麦分蘖和抽穗期，CE、CW和WA处理的硝化速率与对照相比没有变化，而在成熟期，CE、CW和WA处理提高了土壤硝化速率，其中CE处理的提高幅度达到了显著水平(P＜0.05).土壤反硝化速率范围从41.97 mg·(kg·h)-1(CW，分蘖期) 到139.62 mg·(kg·h)-1(CE，成熟期)，反硝化速率随着小麦生长生育期逐渐升高，在成熟期时达到最大值.但是，与CK相比，3个生育期内的CE、CW和WA处理反硝化速率都没有显著变化(P>0-05).
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图 5 土壤硝化速率和反硝化速率 Fig. 5 Nitrifying and denitrifying rates in sampled soils |
从表 2可知，硝化速率与NH4+-N浓度具有显著的正相关关系，反硝化速率与NO3--N浓度呈现显著负相关关系，但硝化和反硝化速率与功能微生物基因丰度之间均无明显的相关性.同时，NH4+-N浓度与AOA、AOB基因丰度及硝化速率之间呈显著的正相关关系，而NO3--N浓度与AOB基因丰度及反硝化速率表现出显著负相关关系.
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表 2 土壤理化指标、基因丰度及活性的相关分析1) Table 2 Correlations among soil physiochemical properties, gene abundances and activities |
3 讨论
土壤中CO2浓度大约是大气中CO2浓度的50倍[20]，大气CO2浓度升高对土壤微生物的影响是间接的，即通过植物光合产物及根系分泌物的变化而影响.有研究表明，CO2浓度升高促进植物光合作用和根系生长，增加了根系生物量，导致根际分泌物和沉积物有所增加[21, 22]，为土壤硝化和反硝化微生物生长提供了更多的能源和C源，从而促进土壤微生物的生长.同时，升温促进土壤微生物的活性，进而加速有机质的降解速率和土壤氮的矿化速率，升温还会影响土壤氮循环的功能微生物[23, 24].本研究表明，大气CO2浓度升高和升温对土壤硝化和反硝化细菌数量产生了显著影响.但是，Nelson等[10]利用平原SoyFACE平台研究发现，CO2浓度升高对玉米和大豆根际土壤氨氧化古菌和细菌丰度没有影响. Long等[25]在温带森林生态系统中研究发现，CO2浓度升高显著提高了氨氧化古菌丰度，而对氨氧化细菌丰度没有影响.这种差异可能与农作物类型、土壤养分状况和CO2浓度升高方式有很大关系.因此，大气CO2浓度升高和升温对土壤中硝化和反硝化的微生物过程有直接的和间接的影响，而多数研究结论差异明显，至今还没有统一的结论.
岳进等[12]研究发现，CO2浓度升高处理下硝化细菌的数量随着小麦生长发育会间歇性出现正、负效应，但是对反硝化细菌没有显著地影响. CO2浓度升高和升温等因素改变了氨氧化菌的群落结构和丰度[9, 10].如图 2结果所示，在水稻的抽穗期和成熟期，CO2浓度单独升高处理的AOA、AOB和反硝化细菌丰度比对照显著升高.一般认为CO2浓度升高促进了植物的光合作用，通过根系分泌物和植物凋落物而提高土壤中有机碳底物，为AOA、AOB和反硝化细菌提供了额外的C源和能源.小麦冠层温度升高2℃对土壤温度的影响较小(＜1℃)，而升温通过小麦的间接作用对AOB和反硝化细菌也没有明显影响(图 2). Malchair等[26]发现温度升高3℃使土壤氨氧化细菌群落结构发生变化，其丰富度降低，然而其还不能证明这种变化是由于温度的直接作用，还是通过植物带来的间接作用.本研究结果显示，单独升温却显著促进了麦田土壤AOA丰度，这可能与土壤AOA群落特性有关系，Stopnišek等[27]研究结果显示AOA丰度与土壤小分子有机碳的相关性比与无机氮的相关性更显著.目前有关温度升高对土壤氮循环功能微生物的研究还很少，未来的研究应在这方面加强.
通过室内培养测定，小麦季硝化速率范围在1.15~5.09 mg·(kg·h)-1，本研究发现大气CO2浓度升高和升温对小麦分蘖和抽穗期的土壤硝化速率没有影响，而CO2浓度单独升高处理显著提高了成熟期土壤硝化速率(图 5).在小麦成熟期，根的生物量和根系沉降物、分泌物较高，土壤AOA和AOB数量在CO2浓度升高处理中显著提高，这可能是硝化速率提高的原因.胡君利等[13]利用FACE系统研究发现，CO2浓度升高增强了低氮土壤的硝化活性，降低了常氮土壤的硝化活性，这说明CO2浓度升高对农田土壤硝化活性的影响与施氮肥量有直接关系.一些研究表明，升高CO2浓度促进了土壤总矿化作用[28]，进而通过影响土壤NH4+有效性而改变硝化活性. NH4+作为土壤硝化作用的底物，是硝化强度的限制因子，而在本研究中发现大气CO2浓度升高和升温对麦田土壤NH4+浓度没有影响.土壤中氮的转化受施氮量、作物类型、土壤水分含量等因素的调控，甚至在植物不同生长期会对大气CO2浓度升高和升温做出截然不同的反应，因此，在这方面的研究也有待于进一步加强.
4 结论大气CO2浓度和温度升高对土壤AOA、AOB和反硝化细菌群落结构没有明显影响，但是在一定程度上改变了AOA和反硝化细菌多样性.在小麦分蘖期，大气CO2浓度和温度升高对AOB和反硝化细菌丰度没有影响，而在抽穗和成熟期，CO2浓度单独升高显著提高了AOB和反硝化细菌丰度，升温处理对其没有显著影响.同时，不同功能微生物的丰度对大气CO2浓度升高和升温表现出不同的响应.以上结果表明，土壤AOA、AOB和反硝化细菌群落对气候变化的响应在小麦不同生育期存在差异.
致谢: 本试验的现场采样工作由常熟市古里镇气候变化监测站完成, 在此对工作站的工作人员潘根福等表示感谢.| [1] | 贺纪正, 张丽梅. 氨氧化微生物生态学与氮循环研究进展[J]. 生态学报, 2009, 29(1) : 406–415. He J Z, Zhang L M. Advances in ammonia-oxidizing microorganisms and global nitrogen cycle[J]. Acta Ecologica Sinica, 2009, 29(1) : 406–415. |
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