2017, Vol. 38
, ZHAO Gao-feng
, ZHOU Huai-dong , ZHANG Pan-wei , LIU Qiao-na , ZHAO Xiao-hui , LI Dong-jiao , REN Min , ZHAO Dan-dan
氯苯类化合物广泛应用于染料、医药、农药、有机合成等工业中，在水体、沉积物、水生生物和人体中均已有检出.早在2001年5月23日联合国环境规划署在瑞典颁布的《关于持久性有机污染物的斯德哥尔摩公约》，提出了包括六氯苯(hexachlorobenzene, HCB) 在内的12种持久性有机污染物(persistent organic pollutants, POPs)；在2004年8月，该公约进一步增加了包括五氯苯(1, 2, 3, 4, 5-Pentachlorobenzene, PeCB) 在内的9种化合物.在我国，公约所约束的第一批12种以及后续增补的包括五氯苯在内的9种化合物分别于2004和2013年正式生效.有研究表明[1~6]，HCB在一定条件下可降解为低氯代氯苯类化合物，这些化合物最终会以各种途径进入人体而影响人体健康，例如市场所售食用鱼体和母乳中就有HCB的检出[7, 8].进一步研究表明[9~11]，氯苯类化合物对斑马鱼胚胎发育和仔鱼具有一定的毒性效应.
茅草街镇位于澧水尾闾、湖南省益阳市南县最南端，处在湘、资、沅、澧、松澧洪道、藕池西支和沱江这七大水系交汇处，是典型的血吸虫病疫区；该地区曾大量使用五氯酚及其钠盐(PCP) 灭螺防治血吸虫病，同时作为五氯酚钠合成主要中间体的HCB也大量进入环境.该镇面积2.48 km2，居民6 417户，人口18 337人，是南县主要农副产品集散地，也是益阳市的经济强镇.据统计，南县2011年水生生物年产量为9.63万t，其中鱼年产量为8.59万t.已有研究表明[12]，该地区野生鱼体肌肉中CBs类污染物含量较高，长期食用该区域鱼体具有一定的健康风险.本研究以茅草街镇为中心，收集具有代表性的三类鱼体(鲫鱼、黄颡鱼和鲶鱼) 各器官进行分析，以期为该区域的CBs (chlorobenzenes) 类化合物在鱼体各器官赋存状态进行研究，并对该区域生态风险评估提供基础数据支持.
1 材料与方法 1.1 实验材料与仪器有机溶剂正己烷、二氯甲烷和丙酮等均为农残级(J. T. Baker，Phillipburg，USA)；优级纯浓硫酸(BDHL，England)；无水硫酸钠(分析纯，用二氯甲烷淋洗，然后置于400℃的马弗炉中烘烤6 h，干燥器中密闭保存、备用)；超纯水(经MILLIQ水纯化系统纯化，电阻率为18.2 MΩ·cm)；硅胶(Merck，Darmstadt，Germany)；去活硅胶(H2O质量分数为3.3%)；酸化硅胶(H2SO4质量分数为44%)；12种CBs标准品均购置于德国Dr.公司(纯度≥98%).
1.2 样品采集与处理样品采集于2013年4月，采样点见图 1.共采集鲫鱼30尾(体长范围为8 cm~12 cm)、黄颡鱼8尾(体长范围为23~26 cm) 和鲶鱼30尾(体长范围为38~42 cm)，4℃保存.将样品转移至实验室后分别进行前处理；将30尾鲫鱼分类混合为肌肉样品5个、性腺样品1个、脑样品2个和肾脏样品2个，8尾黄颡鱼分类混合为肌肉样品2个、性腺样品1个、脑样品1个、肾脏样品1个和肝脏样品1个，30尾鲶鱼分类混合为肌肉样品5个、性腺样品1个、脑样品2个、肾脏样品2个和肝脏样品2个.
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图 1 典型血吸虫病疫区水生生物采集位置示意 Fig. 1 Sampling sites for aquatic organisms in typical regions of schistosomiasis prevalence |
经冷冻干燥机干燥后，研磨过200目筛，准确称取5 g样品(不满5 g的以实际质量为准) 与3 g硅藻土混合均匀，加入10 μL TMX回收率指示物后使用加速溶剂萃取仪(accelerated solvent extraction, ASE) 进行萃取. ASE条件为100℃，1 500 psi，加热5 min，静态萃取7 min，清洗溶液体积分数60%，循环2次，溶剂A为二氯甲烷含量50%，溶剂B为正己烷含量为50%.将上述萃取液经旋转浓缩、氮吹后定容至6 mL，经凝胶渗透色谱仪(gel permeation chromatography, GPC) 去除大分子物质(蛋白质和脂肪等)，GPC条件设置为:流动相为环己烷:正己烷(1:1, 体积比)，流速: 4.7 mL·min-1，柱型: co780，注射环型号: 2.5 mL，收集8~16 min洗脱液. GPC注射剩余样品用于样品脂肪含量检测.
收集洗脱液再次氮吹浓缩至1~2 mL，经酸化硅胶柱净化(净化柱填料及用量从上至下依次为无水硫酸钠2 g、去活硅胶2 g、酸化硅胶5 g、去活硅胶2 g、无水硫酸钠2 g)，依次使用30 mL正己烷、30 mL正己烷:二氯甲烷(9:1, 体积比) 溶液洗脱；收集洗脱液浓缩、定容至100 μL，待测.
1.3 仪器分析气相色谱-质谱仪Agilent 6890GC/5975MS，配备30 m HP-5MS (5%phenyl/95% methyl silicone，30 m，0.25 mm i. d.，0.25 μm film，Agilent，USA) 色谱柱.采用无分流进样方式，载气为高纯He，恒流1.0 mL·min-1，进样量1μL.离子源和传输杆的温度分别为230℃和250℃；采用电子轰击(EI) 模式检测；程序升温: 90℃保留1 min，以4℃·min-1的速率升至250℃，然后以25℃·min-1的速率从250℃升至280℃停留5 min.
1.4 质量控制与保证玻璃器皿依次用洗涤剂、重铬酸钾洗液、自来水、去离子水和丙酮漂洗，再用烘箱烘干.每10个样品添加一个溶剂空白和程序空白，避免背景污染(保证空白无污染后方可进行实验). CBs定量标准曲线的质量浓度包括5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 μg·L-1共5个级别；线性相关系数r2>0.98.样品的最低检测限(LOD) 以3倍信噪比(S/N) 来计算.化合物加标回收率数据及方法检出限如表 1所示.
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表 1 CBs化合物加标回收率及方法检出限 Table 1 Recovery test and detection limit of CBs |
1.5 统计分析
鲫鱼样品分类混合为肌肉样品5个，性腺样品1个，脑样品2个和肾脏样品2个；黄颡鱼样品分类混合为肌肉样品2个，性腺样品1个，脑样品1个、肾脏样品1个和肝脏样品1个；鲶鱼样品分类混合为肌肉样品5个，性腺样品1个，脑样品2个、肾脏样品2个和肝脏样品2个.对上述样品分别进行统计分析.样品中CBs的质量浓度低于LOD时用1/2 LOD进行统计计算.统计分析软件为SPSS (版本17.0, SPSS Inc., Chicago, IL, USA)，几何均值用来描述CBs在鱼体各器官内的含量.
2 结果与分析采集并分析了血吸虫病疫区三类代表性鱼类肌肉及不同器官中ΣCBs(表示12种CBs总量) 含量, 结果见表 2.鲶鱼肌肉和脑中ΣCBs总含量(几何均值分别为7 811.23 ng·g-1和3 329.61 ng·g-1，按脂肪质量计，下同) 较另外两种鱼体高；鲫鱼为不同鱼种肾脏内ΣCBs含量最高的鱼种(几何均值为4 667.76 ng·g-1)；性腺中ΣCBs含量最高的鱼种为黄颡鱼，几何均值为4 640.05 ng·g-1.本研究区域鱼类体内1, 3-二氯苯、1, 4-二氯苯、1, 2-二氯苯和HCB这四类化合物检出率和含量均较高，为研究区域鱼体各器官内CBs类化合物典型污染物.
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表 2 典型血吸虫病疫区鱼体器官中氯苯类化合物的含量1)/ng·g-1 Table 2 Concentration of CBs in organs of fish in typical epidemic areas of schistosomiasis prevalence/ng·g-1 |
对研究区域鱼体器官内各类CBs化合物所占质量分数进行分析(图 2)，发现HCB在鲶鱼和黄颡鱼各器官中所占质量分数最高的为肌肉和性腺，且两者质量分数相当(鲶鱼肌肉和性腺中HCB所占ΣCBs的质量分数分别为19.73%和22.21%，黄颡鱼肌肉和性腺中HCB所占质量分数分别为8.28%和7.34%)；同时该数值明显高于相应鱼种肾脏和脑中质量分数；鲶鱼体内各类器官肝脏中HCB质量分数占到20.37%，为HCB比重最高的器官；鲫鱼肌肉内HCB质量分数明显高于该鱼种其他器官. 3种二氯苯化合物的质量分数总和比重则恰相反.
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图 2 典型血吸虫病疫区CBs各同系物所占质量分数分布 Fig. 2 Mass fractions of different homologues of CBs in aquatic organisms collected from typical epidemic areas of schistosomiasis prevalence |
从表 2数据可以看出，鲶鱼肌肉内ΣCBs最高，为各类鱼体器官中污染物含量的1.67~11.08倍.原因可能是ΣCBs具有一定的生物富集放大作用，所以导致在水中营养等级较高的肉食性鱼体鲶鱼体内该类化合物含量较高，这一结果与本实验室之前所做的调查结果相一致[12]；另外，鲶鱼体内各器官ΣCBs含量为肌肉＞肾脏＞脑＞性腺＞肝脏，说明鲶鱼肌肉较其他器官而言更易于CBs类化合物的富集.分析鲫鱼体内各器官中ΣCBs含量发现，肌肉、性腺和脑等器官中ΣCBs含量处于同一水平(2 423.18~3 005.85 ng·g-1)，而在主要负责去除血液中代谢废物的肾脏中含量较高(4 667.76 ng·g-1)，这说明鲫鱼具备一定的功能将体内ΣCBs通过自身排泄排出体外.观察黄颡鱼体内各器官污染物含量发现，性腺中ΣCBs含量(4 640.05 ng·g-1) 为污染物含量最高的器官，说明黄颡鱼母体体内CBs毒性较另外两种鱼体更易影响子代的受精及发育过程，对子代产生毒性效应.
3.2 典型污染物来源分析HCB作为工业中间体，曾被大量用于生产五氯酚及其钠盐.并有研究证明[13, 14]，五氯酚钠成品内含有大量的HCB残留(含量达到20.95 mg·kg-1).自1959年起长江中下游地区大量使用五氯酚及其钠盐(PCP) 用于灭螺防治血吸虫病.有报道指出[15, 16]，疫区血防人员灭螺时，每m2土地面积的PCP用药量高达5~20 g，导致表层土壤沉积物中PCP的含量非常高，常常伴随发生生物和人畜中毒甚至死亡的急性中毒事件. PCP的大量而且不间断地使用也使得HCB大量地进入当地环境中，然后通过各种途径进入水生生物体内.这也就解释了当地鱼体体内HCB含量较高的现象.
本研究表明1, 2-二氯苯在各鱼体组织器官中含量为二氯苯类化合物首要污染物(所占二氯苯类化合物质量分数均高于52%，含量范围为384.97~3 676.62 ng·g-1).分析1, 2-二氯苯在日常生产生活中的用途发现，在医药方面该类化合物可用于生产氟氯苯胺，用作氟哌酸的生产；在农药方面，可合成碳酸酐酶抑制药双氯磺酰胺，防治蚊蝇、臭虫的药剂三氯杀虫酯、硝喹等的中间体，广谱驱虫药甲苯咪唑的中间体，以及农药呋喃丹的基本原料等；在染料行业主要用于生产3, 4-二氯硝基苯，进一步生产分散紫4BN、分散翠蓝BF、还原棕R、还原草绿GB等.裘丽萍等[17]研究表明，根据鱼类急性毒性分级标准，1, 2-二氯苯对斑马鱼96h的半致死质量浓度为5.13 mg·L-1，安全质量浓度为0.51 mg·L-1，属于高毒性物质，所以1, 2-二氯苯在环境中的赋存状况应引起重视.相应地，1, 3-二氯苯和1, 4-二氯苯之和在各鱼体组织器官中所占二氯苯类化合物质量分数均低于48%. 1, 4-二氯苯主要用作热塑性工程塑料聚苯硫醚(PPS) 的原料；同时也被用作生产家庭卫生用品(防蛀，防霉和防臭剂)；农药方面还可以用来合成除草剂地草平的中间体，喹诺酮酸类抗菌剂的起始原料和对苯二酚等. 1, 3-二氯苯可用于合成间苯二酚，3, 5-二氯苯胺等.我国人口众多，消费基数较大，二氯苯的需求量一直保持着较高水平，以代替精萘用作防蛀防霉剂的1, 4-二氯苯为例，早在1993年消耗量已达到5 000 t·a-1.而作为中间体，由于生产工艺和技术手段等问题，将不可避免地在各产品中有大量二氯苯的残留，然后通过水体溶解、河流径流、气体挥发、大气沉降等途径使得污染物进入水体环境中，最终被水生生物吸收[12].同时，有研究表明六氯苯可在厌氧环境下最终降解为二氯苯类化合物也是重要的来源[3, 6].
因此可以推断该研究区域鱼体各器官中六氯苯主要来源于该地区之前长期使用的杀螺剂(五氯酚钠)；二氯苯化合物一方面主要来源于六氯苯在厌氧条件下的降解，另一方面来源于当地居民日常生活所使用的含有二氯苯化合物的生活用品.
3.3 典型污染物在各生物体内含量分析分析HCB在各鱼体器官中的含量发现，各鱼体肌肉中HCB含量相当(几何均值分别为鲫鱼697.93 ng·g-1、黄颡鱼539.00 ng·g-1以及鲶鱼646.60 ng·g-1)，在鲫鱼和鲶鱼体内，肌肉中HCB含量均高于其他器官中含量.此次采集的鱼体样品中六氯苯和二氯苯类化合物在不同生物体内含量相当且与在生物链内的生物等级并无明显关系，这可能与此次采集各类鱼体样品的生长时间以及各自生活环境和习性有关.
3.4 国内外研究对比对比国内外相关研究报道(见表 3) 发现该区域肌肉中HCB与之前报道的该区域鱼体(160~906 ng·g-1) 肌肉中含量相当，略高于中国各地区报道的相关含量；与其他国家和地区报道值(日本2~100 ng·g-1，挪威36~79 ng·g-1，丹麦19~54 ng·g-1) 相比，研究区域HCB含量同样处于较高水平.与已有报道的鱼体肝脏中HCB含量相比较发现，格陵兰岛的鳕鱼、比目鱼和狼鱼肝脏中含量较低(27~42 ng·g-1)，研究区域黄颡鱼HCB含量与我国中华鲟肝脏中含量相当，且高于新乡超市中购买的草鱼和鲤鱼.另外，与我国中华鲟体内的性腺相比，研究区域鲫鱼和鲶鱼性腺中的含量与之持平，但黄颡鱼性腺中含量远高于中华鲟性腺中HCB含量.
由于本研究在计算ΣCBs时使用的是12种氯苯类化合物含量，所以在与格陵兰岛和中国新乡(仅将四氯苯、五氯苯和六氯苯作为ΣCBs加和项) 相关报道值相比较时发现，本研究区域ΣCBs含量较高；但当与中国珠江口(将二氯苯、三氯苯、四氯苯、五氯苯和六氯苯作为ΣCBs加和项) 相关报道中各鱼体ΣCBs值相比较发现，本研究区域与珠江口研究区域的ΣCBs含量相当.上述现象说明环境中二氯苯类污染物不仅占CBs比重较高并且较其他氯苯类化合物更易被忽略.
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表 3 水生生物体内ΣCBs和HCB的国内外对比/ng·g-1 Table 3 Levels of ΣCBs and HCB among samples in aquatic organisms from various locations/ng·g-1 |
4 结论
典型血吸虫病疫区鱼体不同器官内CBs含量有所差异，肌肉含量范围为2 731.50~7 811.23 ng·g-1，性腺含量范围为2 557.89~4 640.05 ng·g-1，脑中含量范围为2 423.18~3 329.61 ng·g-1，肾脏中含量范围为1 628.05~4 667.76 ng·g-1，肝脏中含量范围为704.92~1 086.96 ng·g-1.血吸虫病疫区水生生物体内CBs类污染物以二氯苯和HCB为主；当地HCB主要来源为杀螺剂(五氯酚钠)，二氯苯主要来源为六氯苯厌氧降解以及当地居民日常生活用品；与国内外报道的水生生物体内HCB相比，研究区域生物体内HCB污染处于较高水平，且二氯苯类化合物含量较高，需引起重视.
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