2017, Vol. 38
2. 香港城市大学深圳研究院, 深圳海洋生物多样性可持续利用重点实验室, 深圳 518057;
3. 香港科技大学环境学科, 香港
2. Shenzhen Key Laboratory for the Sustainable Use of Marine Biodiversity, Research Centre for the Oceans and Human Health, City University of Hong Kong Shenzhen Research Institute, Shenzhen 518057, China;
3. Environmental Science Programs, The Hong Kong University of Science and Technology, Hong Kong, China
纳米银(AgNPs)由于其良好的抗菌特性被广泛应用于各个领域，是使用量最高的纳米材料，目前全世界含有纳米银的商品种类超过400种[1].随着含有纳米银的商品大量使用，进入环境中的纳米银浓度会持续积累，给生态系统带来一定的潜在风险[2].针对含纳米银的儿童产品的检测结果显示其银的释放量最高可以达到38%[3].也有研究检测到食物容器会释放纳米银颗粒，检测到的纳米银粒径范围为10~60 nm，浓度范围是1.66~31.46 ng·cm-2[4].针对环境中释放的纳米材料的模型结果表明，污水处理厂排放的污水和污泥是环境中纳米银的主要来源[5].纳米银经历一系列的迁移转化会汇入河口流入海洋，给河口和海洋生态系统带来一定潜在影响[6].
微生物是生态系统的重要组成部分，广泛分布于各类环境中.微生物细胞结构简单，对污染物相对敏感，纳米银又有很强的杀菌性能，释放到环境中的纳米银会对微生物带来一定的潜在危害.近年来针对纳米银对微生物的毒理研究成为热点[7~10].已报道的研究多以实验室条件模拟为主要方法，并且选用细菌培养基作为暴露介质，细菌在培养基中生长良好，因此对污染物的耐受力也相对较高.自然环境中供微生物生长的营养物质是有限的，微生物在环境中的分布处于动态平衡，所以实验条件下得到的结论不能完全反映真实的环境条件.有研究比较纳米银在模拟生态系统中和实验室条件下对小型鱼类和线虫的毒性效应，结果表明从两种环境中得到的结论并不相符[11].有研究比较纳米氧化锌对不同培养条件中大肠杆菌的毒性差异，结果表明营养丰富的培养基提升了大肠杆菌对纳米银的耐受力[12].环境因子如pH值、 溶解有机质和离子配体会影响纳米银的团聚、 释放等理化性质，并影响其毒性效应[13~15].
纳米银的理化性质决定其毒性效应[16].目前已报道的研究多以纳米银的静态暴露为实验方法，或者直接将纳米银加入暴露体系，忽略了纳米银在介质中的动态平衡.纳米银的粒径分布、 溶解性和团聚等性质在实验控制条件和真实环境中的对比研究十分有限.本实验比较油胺包裹的4 nm纳米银在环境水样和实验介质条件下理化性质，进一步比较在不同培养条件下纳米银对枯草芽孢杆菌毒性效应，并探讨纳米银的毒性机制.本文对研究自然环境尤其是条件复杂的河口环境中纳米材料的毒性效应提供一定的科学参考.
1 材料与方法 1.1 试剂与仪器试剂: 纳米银粉购自于苏州冷石纳米材料科技有限公司，平均粒径是(4±1)nm，纯度为99.5%，表面包裹物是油胺； 细菌存活率检测试剂盒(LIVE/DEAD® BacLightTM Bacterial Viability Kits,L7012,Molecular Probes,Inc.Eugene,Oregon,USA)购自于上海麦野生物科技有限公司； 硝基腐殖酸购自于梯希爱(上海)化成工业发展有限公司； 人工海水配方(400mmol·L-1氯化钠，8mmol·L-1氯化钾，8mmol·L-1二水合氯化钙，20mmol·L-1六水合氯化镁，20mmol·L-1七水合硫酸镁，2mmol·L-1碳酸氢钠，盐度为28 ‰)[17]； 纯水选择电阻率为18.2 MΩ·cm的Milli-Q纯水(电导率＜0.1 μS·cm-1).枯草芽孢杆菌(ATCC 6633)购自于广东省微生物研究所微生物菌种保藏中心； 细菌培养基(Luria-Bertani Medium，LB培养基，组成成分为5g·L-1胰蛋白胨，3g·L-1牛肉膏，5g·L-1氯化钠)和磷酸盐缓冲溶液(PBS溶液)均购自于生工生物工程(上海)股份有限公司.
仪器: 超声波清洗仪(SB-520DTDN，宁波新芝公司)； 恒温摇床(SPH-103B，上海世平实验设备有限公司)； SpectraMax 多功能酶标仪(美国，Molecular Device公司)； 透射电子显微镜(Transmission Electron Microscope，TEM，JEM-2100，日本，HITACHI公司)； Malvern Zetasizer Nano ZS动态光散射粒度仪(英国，Malvern Instruments公司)； 电感耦合等离子体质谱仪(Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry，ICP-MS，Neptune，德国，Thermo公司).
1.2 环境水样采集水环境样品于2015年5月于大通水文观测站南部(117°37.835′E,30°46.150′N)、 中部(117°37.705′E,30°46.441′N)和北部(117°37.533′E,30°46.863′N)这3个采样点采集，3个站点采集的样品均为表层水样，将3个采样点的水样等量混合以代表大通水文站样品，样品存储于聚丙烯材质的桶中，存储温度不超过24℃.样品的基本理化参数为: 平均盐度值为(0.20±0.05)‰； 平均pH值(8.01±0.01)； 平均电导率值为(0.15±0.05)mS·cm-1； 溶解有机碳含量为103.2 μmol·L-1.大通水文站位于长江上游，受潮汐影响较不明显，一定程度上代表了长江下游的河口水环境情况.水样经0.45 μm滤膜过滤后室温保存备用，时间不超过7 d.
1.3 纳米银的表征将0.1 g纳米银粉分散至100 mL Milli-Q纯水中，超声分散(220 V,40×103 Hz)1 h，制备成纳米银储备液，避光储存至4℃.将纳米银储备液分别分散至Milli-Q纯水、 人工海水、 含10 mg·L-1硝基腐殖酸的纯水和河口水样中，制备成纳米银悬浮液，放置于恒温摇床(160r·min-1，30℃)平衡12 h.平衡后将纳米银悬浮液超声分散30 min，取一滴悬浮液滴在铜网上，待室温下完全干燥后，用于透射电子显微镜观察.取上述不同介质中的纳米银悬浮液1.5 mL，用动态光散射粒度仪测量纳米银的水动力粒径.
为了研究纳米银释放银离子的含量，控制释放环境与暴露环境一致，用Amicon Ultra-0.5 3K 超滤管(孔径1~2 nm)将纳米银悬浮液分离(14 000r·min-1，40 min)，分离出的银离子(粒径约0.3 nm)溶液用浓硝酸酸化后用ICP-MS测定其含量，实验结果显示纳米银释放银离子的含量极低，并且用相同剂量的硝酸银暴露细菌，并未发现对细菌产生毒性效应.
1.4 纳米银毒性实验设计(1) 枯草芽孢杆菌的培养 将枯草芽孢杆菌菌种接种于LB固体培养基中，并储存至4℃.每次暴露实验前，将菌种重新接种于新鲜的LB液体培养基中，放入恒温摇床(200r·min-1，30℃)培养12 h至对数期，作为备用细菌悬浮液.
(2) 细菌生长速率测定 取对数期的细菌悬浮液离心(4 500r·min-1，5 min)，用PBS溶液清洗3遍后悬浮至新鲜的LB培养基中，用酶标仪测量细菌在600 nm可见光波长下的光密度(D600)，并用LB培养基调节至D600=0.05.将不同介质中的纳米银悬浮液梯度稀释后，取20 μL与180 μL细菌悬浮液混合加入至96孔细胞培养板中，使得纳米银暴露浓度为0、 90、 900、 1 800 μg·L-1，每组设置3个平行.将96孔培养板放置恒温摇床(200r·min-1，30℃)培养，12h后测定细菌悬浮液的D600.测量结束后，细菌的生长抑制率(%)计算公式为:
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式中，N0和N分别代表空白组和暴露组细菌悬浮液的D600.
(3) 细菌存活率测定 取对数期的细菌悬浮液离心，用PBS溶液清洗3遍后悬浮至0.85% NaCl溶液中，并用0.85% NaCl调节细菌悬浮液D600=0.2.然后将不同介质中的纳米银溶液梯度稀释与同体积的细菌悬浮液混合加入24孔细胞培养板，使得纳米银暴露浓度为0、 90、 900、 1800 μg·L-1，每组设置3个平行.将24孔培养板放置恒温摇床培养，3 h后收集细菌悬浮液，取100 μL细菌悬浮液和100 μL细菌存活率检测试剂至96孔荧光酶标板中，参照细菌存活率检测试剂盒的实验方法进行测定.检测混合液在波长485 nm处激发光下，分别在波长530 nm和630 nm处吸收光强度.其中，530 nm处荧光强度(F530)反映活细菌细胞密度，630 nm处荧光强度(F630)反映死细菌细胞密度，荧光强度比值(F530/F630)反映活细菌的含量(%).细菌的存活率(%)计算公式为:
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式中，R0和R分别代表空白组和暴露组的荧光强度比值.
(4) 环境因子对毒性实验的影响 设置纳米银在河口水样中的平衡时间分别为12 h和7 d[18]，研究纳米银在河口水样中的平衡时间对其毒性效应的影响.在保证暴露条件相同的前提下，利用上述实验方法，分别测定在河口水样中平衡12 h和7 d后，纳米银暴露后的枯草芽孢杆菌生长速率和存活率.
配制人工海水使其pH值分别为7.6、 8.1、 8.6(近似自然海水的pH值范围)，将纳米银分散至3种海水中平衡12 h后，研究pH值对纳米银毒性效应的影响.在保证暴露条件相同的前提下，利用上述实验方法，分别测定不同pH值条件下，纳米银暴露后枯草芽孢杆菌的存活率.
将硝基腐殖酸分别加入不同介质(Milli-Q纯水、 人工海水和河口水样)平衡12 h，使硝基腐殖酸在暴露体系中的浓度为10 mg·L-1 [19]，研究腐殖酸对纳米银毒性的影响.在保证暴露条件相同的前提下，利用上述实验方法，分别测定加入腐殖酸前后，纳米银暴露后的枯草芽孢杆菌的存活率.
(5) 纳米银分离实验 为了研究纳米银产生毒性的主要原因，用3.5×103透析袋(Spectrum Laboratories,Rancho Dominguez,CA,USA)将纳米银密封，使纳米银与细菌分离.透析袋孔径为1~2 nm，纳米银不能透过透析袋进入细菌悬浮液.收集对数期的细菌悬浮液，用PBS溶液清洗3遍后悬浮至0.85% NaCl溶液中，并用0.85% NaCl调节细菌悬浮液D600=0.2.将纳米银直接加入含有20 mL细菌悬浮液的离心管中，每组设置3个平行，作为空白组.离心管体积为50 mL，纳米银与细菌相互混合.在保证相同暴露条件下，取20 mL细菌悬浮液和包裹纳米银的透析袋于离心管中，保证透析袋完全密封并浸没于细菌悬浮液，每组设置3个平行，作为对照组.暴露体系中纳米银的浓度均为1 800 μg·L-1.将50 mL离心管放置恒温摇床培养3h，然后测定枯草芽孢杆菌的存活率.
1.5 统计方法纳米银单分散态粒径用ImageJ2x软件(National Institutes of Health,Bethesda,MD,USA)测量TEM图片中单分散的纳米银颗粒在同一个方向上的直径，统计并制作直方图.暴露实验的实验结果用平均值±均值标准误差(Mean±SEM)表示，n=3.数据用GraphPad Prism 5软件分析并检验显著性，P＜0.05代表数据之间有显著性差异.
2 结果与分析 2.1 纳米银在不同条件下的粒径分布和团聚情况图 1分别展示实验介质(Milli-Q纯水、 人工海水和硝基腐殖酸溶液)和自然水样(河口水样)中油胺包裹的4 nm纳米银的透射电镜照片.照片显示油胺包裹的4 nm纳米银在实验介质的介质中基本形态呈球形，在纯水中纳米银分布均匀，虽然分布范围密集，但是并没有明显的团聚现象[图 1(a)].纳米银在海水中的团聚现象较为明显[图 1(b)].在含有硝基腐殖酸的介质中，部分纳米银有团聚的现象，也有部分纳米银颗粒的分布相对分散[图 1(c)].图 1(d)展示了纳米银在河口水样中的透射电镜照片，照片显示纳米银在河口水样中有明显的团聚现象，纳米银被一层膜物质包裹因此导致团聚.
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图 1 纳米银在纯水、 海水、 硝基腐殖酸溶液和河口水样中平衡12 h后的透射电镜照片 Fig. 1 TEM images of AgNPs in Milli-Q water,seawater,NHA and estuarine water after 12 h equilibration |
图 2表明油胺包裹的4 nm纳米银在介质中的单分散态粒径分布，经统计纳米银的单分散态粒径符合正态分布，介于2.36~8.96 nm之间，平均粒径为(4.75±1.25) nm[图 2(a)]，结果与纳米银出厂报告数据(4 nm)相近.图 2(b)结果表明纳米银在纯水中的水动力粒径拟合曲线显示两个峰值，分别是3.1 nm(强度6.9%)和111.3 nm(强度69.1%)，在海水中水动力粒径拟合曲线显示1个峰值为232.7 nm(强度100%).而纳米银在河口水样中水动力粒径拟合曲线显示3个峰值[图 2(c)]，分别为1.571 nm(强度16.3%)、 87.3 nm(强度39.7%)和363.9 nm(强度44%).
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图 2 纳米银的原始粒径和水动力粒径结果 Fig. 2 Primary size and hydrodynamic diameter of AgNPs |
图 3(a)表明不同环境中油胺包裹的4 nm纳米银对枯草芽孢杆菌在实验介质(LB液体培养基)下12 h生长的抑制作用.在纯水和海水中，随着纳米银浓度的升高，其对细菌生长的抑制率随之升高.当纳米银浓度较低(9 μg·L-1和90 μg·L-1)时，对细菌生长的抑制作用并不明显，抑制率不超过10%.当纳米银浓度上升到900 μg·L-1，纯水和海水中纳米银对细菌生长的抑制率分别约为20%和35%.当纳米银浓度为最高值1 800 μg·L-1时，纯水和海水中纳米银对细菌生长的抑制率分别约为71%和97%.但是在环境介质中(河口水样)，纳米银对枯草芽孢杆菌生长抑制作用未表现出一定的剂量效应关系.当纳米银浓度较低(9 μg·L-1和90 μg·L-1)时，河口水样中纳米银对细菌生长的抑制率约为8%，当纳米银浓度为最高值1 800 μg·L-1时，其对细菌生长的抑制率仅约为12%.当纳米银浓度为9 μg·L-1时，河口水样中的纳米银对细菌的生长抑制作用强于其在纯水中(P＜0.05).当纳米银的浓度≥900 μg·L-1时，不同介质中纳米银抑制细菌生长能力总体呈现为海水＞纯水＞河口水样(P＜0.05).
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(a)不同水环境中纳米银暴露12 h后的枯草芽孢杆菌的生长情况； (b)不同平衡时间对河口水样中纳米银暴露12 h后的枯草芽孢杆菌生长的影响； 结果与空白实验组作百分比，星号代表数据之间的显著性差异(*表示P<0.05,**表示P<0.01,***表示P<0.001) 图 3 纳米银暴露12 h后枯草芽孢杆菌的生长抑制率结果 Fig. 3 Growth inhibition of B.subtilis after exposure to AgNPs for 12 h |
图 3(b)进一步研究平衡时间对河口水样中纳米银抑制枯草芽孢杆菌生长效应的影响，结果表明，当纳米银浓度≥900 μg·L-1，在河口水样中平衡7 d的纳米银，对细菌生长抑制作用比平衡12 h的纳米银有显著性增强(P＜0.05).
2.3 纳米银暴露减弱枯草芽孢杆菌的存活率图 4(a)表明经过不同介质中油胺包裹的4 nm纳米银暴露3 h后，枯草芽孢杆菌在近似环境条件下(0.85% NaCl溶液)的存活率.当纳米银浓度≤90 μg·L-1时，细菌细胞的损伤情况并不明显，海水的纳米银对细胞的损伤程度比纯水中的纳米银较强一点，但存活率都超过90%.当纳米银浓度上升到900 μg·L-1，纯水和海水中的纳米银对细菌细胞的损伤程度加剧，并且当纳米银浓度达到最高1 800 μg·L-1时损伤程度随之提升至最高，存活率分别降至为73%和70%.但是在河口水样中，纳米银对细胞损伤程度较弱，当纳米银浓度≤90 μg·L-1时，存活率超过97%.当纳米银浓度达到最高1 800 μg·L-1后，河口水样中纳米银对细菌细胞的损伤仅有7%(存活率93%).当纳米银浓度为900 μg·L-1时，海水中的纳米银降低细菌存活率的能力比其在纯水中强(P＜0.05).在不同暴露浓度下(9、 90、 900、 1 800 μg·L-1)，河口水样中的纳米银对细菌存活率的削弱能力均比其在纯水和海水中弱(P＜0.05).
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(a)不同水环境中纳米银暴露3 h后的枯草芽孢杆菌的存活率； (b)不同平衡时间对河口水样中纳米银暴露3 h后的枯草芽孢杆菌存活率的影响 图 4 纳米银暴露3 h后枯草芽孢杆菌的存活率结果 Fig. 4 Cell viability of B.subtilis after exposure to AgNPs for 3 h |
图 4(b)进一步研究平衡时间对河口水样中纳米银降低枯草芽孢杆菌存活率效应的影响，结果表明，当纳米银浓度为1 800 μg·L-1，在河口水样中平衡7 d的纳米银，对枯草芽孢杆菌存活率的削弱能力比平衡12 h的纳米银有显著性减弱(P＜0.05).
2.4 环境因子对纳米银毒性效应的影响图 5(a)表示不同pH值(7.6、 8.1、 8.6)的海水中油胺包裹的4 nm纳米银对枯草芽孢杆菌存活率的削弱作用呈一定的剂量效应关系，并且当纳米银浓度为1 800 μg·L-1时有显著性差异(P＜0.05)，表现为pH 7.6＞pH 8.1＞pH 8.6.图 5(b)表明了硝基腐殖酸对纳米银削弱细菌存活率作用的影响.结果表明，当纳米银的浓度为1 800 μg·L-1时，加入10 mg·L-1硝基腐殖酸后，纳米银的毒性效应被明显减弱(P＜0.05).
2.5 动态混合对纳米银的毒性效应的影响图 6表示，油胺包裹的4 nm纳米银与细菌的混合与分离，对暴露后的枯草芽孢杆菌存活率的影响.结果表明，与纳米银直接和细菌悬浮液混合相比，放入透析袋后的纳米银对枯草芽孢杆菌存活率的减弱作用被明显削弱.在纯水和海水中，纳米银的毒性效应分别被削弱约18%和28%(P＜0.05).
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条件: (b)纳米银浓度为1 800 μg·L-1，硝基腐殖酸浓度为10 mg·L-1 图 6 混合和分离对纳米银暴露枯草芽孢杆菌3 h后存活率的影响 Fig. 6 Cell viability of B.subtilis after 3 h of direct and separate exposure to AgNPs |
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图 5 pH值和硝基腐殖酸对纳米银暴露3 h后的枯草芽孢杆菌存活率的影响 Fig. 5 Cell viability of B.subtilis after exposure to AgNPs for 3 h as a function of pH value and NHA |
纳米银的尺寸一定程度上会影响其对细菌的毒性效应[20].Park等[21]证明小粒径的纳米颗粒更容易被细胞摄入并导致细胞损伤.研究环境中纳米银的理化性质和毒性效应不能仅参考纳米银的原始粒径，也要重视纳米银在环境中的水动力粒径.TEM可以表明纳米银在介质中的真实粒径，在本实验中，TEM照片统计的结果表明，纳米银的单颗粒粒径约为(4.75±1.25) nm，结果与纳米银出厂报告中粒径的数据(4 nm)相近.但是透射电镜在观察上有一定的局限性，并不能反映纳米银在介质中整体粒径分布情况.DLS可以表明纳米银在介质中整体的粒径分布，但由于DLS数据是通过光强度信号计算得到的，对介质中进行布朗运动的大颗粒比较敏感，因此检测得到的纳米银水动力粒径，比TEM观察到的单分散直径大.Zhang等[22]表明纳米银在不同水介质中往往以团聚的形式存在，纳米银在介质中的水动力粒径要比单分散态粒径大几十甚至上百倍.纳米银的分散介质离子强度越高，颗粒之间的双电层越容易被压缩，团聚现象越明显[23, 24].
纳米银的表面包裹物也会一定程度影响其理化性质.本实验选用的纳米银表面包裹物是油胺，通过实验发现，纳米银在本实验选用的所有水介质中，其Zeta电位均为负值.在实验介质(Milli-Q纯水和人工海水)中，纳米银颗粒之间存在电荷一致性，产生的电荷排斥力，导致纳米银颗粒之间有一定的分散性.有研究表明腐殖酸的加入会使纳米银带电量增加，Zeta电位绝对值增加，从而减弱纳米银的团聚[17].本实验中同样观察到纳米银在硝基腐殖酸中有一定的分散性.有研究通过建立模型，表明天然胶体会影响颗粒的传输和沉降[25].此外，有研究表明环境中植物所释放出的溶解有机碳能够吸附纳米银颗粒，导致其发生明显团聚[11].本实验中，经测量发现河口水样中溶解有机碳的浓度为103.2 μmol·L-1，由于溶解有机碳包含胶体有机碳，因此推断河口水样中同样存在胶体.河口水样中纳米银产生明显团聚，可能的原因是河口水样中的溶解有机碳和胶体等具有吸附性的物质，吸附纳米银颗粒，导致纳米银颗粒的团聚[26].目前已有研究多使用以聚乙烯吡咯烷酮为包裹物的纳米银作为研究对象，这使得纳米银有较好的亲水性，更容易释放出银离子，导致毒性效应[27~29].而本实验选择的纳米银亲水性差，释放银离子的过程相对缓慢，在环境中具有较强持久性.
纳米银会抑制培养基中枯草芽孢杆菌的生长.细菌在培养基中生长良好，因此较低浓度的纳米银对细菌生长抑制作用并不明显.随着纳米银暴露浓度的增加，纳米银颗粒的数量增加，因此随着更多纳米银颗粒与细菌的动态混合，导致纯水和海水中纳米银，对细菌生长的抑制作用，呈现一定的剂量效应关系.但是纳米银在河口水样中容易发生团聚，即使纳米银暴露浓度增加，颗粒数量增加，还是有大量纳米银颗粒被吸附.所以，在河口水样中的纳米银，对细菌生长的抑制作用和对细菌存活率的减弱作用，没有呈现一定的剂量效应关系.因此，随着暴露浓度的升高，纳米银抑制细菌生长的整体趋势，表现为河口水样中纳米银对细菌生长抑制作用强于其在纯水和海水中.此外，海水中纳米银对细菌生长抑制作用比其在纯水中强，这可能是因为海水的离子强度较高，使得纳米银颗粒之间的双电层被压缩，从而增加了纳米银与细菌接触的几率，抑制细菌的生长.有研究表明随着离子强度的增加，纳米银会形成更多的分形结构，进一步增加其与细菌细胞的接触作用[30].
纳米银会降低生理盐水中枯草芽孢杆菌的存活率.在不同的暴露浓度下，河口水样中的纳米银降低枯草芽孢杆菌存活率的能力，均比其在纯水和海水中弱，这可能是纳米银在河口水样中产生明显团聚，抑制了纳米银与细菌的动态混合作用，从而导致纳米银降低细菌存活率的能力降低.纳米银的沉降减弱了其与悬浮细菌的相互作用，但在一定程度上也会影响沉积物中的微生物群落的组成[31].天然河口水样中富含溶解有机碳和胶体有机碳等具有吸附性的物质，有研究证实这些物质会降低纳米银的毒性效应[13, 32].并且生态系统中的植物释放的溶解有机碳同样会降低纳米银的毒性[11].本实验选用的河口水样中含有溶解有机碳，能够吸附纳米银颗粒并导致其团聚，导致其减弱细菌存活率的能力下降.纳米银在实验培养条件(LB液体培养基)下抑制细菌的生长，但由于培养基为细菌的生长提供充足的营养物质，随着细菌的繁殖速度超过抑制速度，细菌最终会大量繁殖(超过24 h).但在自然环境中，营养物质相对平衡，细菌的分布和丰度相对稳定，因此污染物的介入可能直接杀死细菌并导致微生物种群的变化.使用透析袋将纳米银密封后，纳米银被截留，但是银离子可以自由通过透析袋，透析后的纳米银毒性效应被显著削弱，表明本实验观察到的毒性效应并非由纳米银释放有毒的银离子产生，而是由纳米银与细菌的动态混合而产生[25, 33].
4 结论(1) 油胺包裹的4 nm纳米银在环境水样中会产生明显的团聚.
(2) 油胺包裹的4 nm纳米银在培养基介质中抑制枯草芽孢杆菌的生长，在生理盐水介质中降低枯草芽孢杆菌的存活率.
(3) 油胺包裹的4 nm纳米银与细菌动态混合，通过相互作用对细菌产生毒性效应.自然环境条件尤其是河口环境条件相对复杂，含溶解有机碳等吸附作用较强的物质，这些物质通过与纳米银相互作用的竞争，抑制纳米银与细菌动态混合的作用，减弱纳米银的毒性.
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