2017, Vol. 38
2. 广东省环境污染与健康重点实验室, 广州 510632;
3. 广东省环境污染控制与修复材料工程技术研究中心, 广州 510632;
4. 广州市环境暴露与健康重点实验室, 广州 510632
2. Key Laboratory of Environmental Pollution and Health of Guangdong Province, Guangzhou 510632, China;
3. Guangdong Provincial Research Center for Environment Pollution Control and Remediation Materials, Guangzhou 510632, China;
4. Key Laboratory of Environmental Exposure and Health of Guangzhou, Guangzhou 510632, China
全氟辛酸(PFOA)是将辛酸烷基以及碳链中所有氢原子取代为氟原子形成的具有15个氟原子、 8个碳原子组成的烃链，其末端连接一个羧基.由于C—F共价键键能极高，使得PFOA具有极强的热稳定性，同时PFOA独特的结构使之兼具疏水性和疏油性，因此被大量应用于造纸、 纺织、 制革等工业.但同时也具有难降解性、 生物蓄积性和沿食物链在生物体内富集作用，被认为是一种在环境中分布广泛的持久性有机污染物[1].
有关PFOA的生物毒性大多以人体细胞[2~6]、 动物细胞[7]以及原生动物[8]为对象，获得了许多研究成果.然而，PFOA对环境微生物的影响的研究却非常少，对PFOA的微生物细胞毒性作用及相关机制还没有形成系统完善的认识.大肠杆菌作为一种原核模式微生物，是环境中最常见的微生物之一.研究PFOA对大肠杆菌的毒性作用，对PFOA的环境影响具有重要的评估意义.
流式细胞术(flow cytometry,FCM)由于能从微观角度了解单细胞的生理状态而逐渐被应用到微生物领域[9, 10].本研究以大肠杆菌为实验对象，通过流式细胞术等检测技术，考察在不同浓度的暴露过程中，PFOA对大肠杆菌的氧化胁迫与细胞膜特性的影响，以期为PFOA的环境生态风险提供更多理论依据.
1 材料与方法 1.1 实验菌株及试剂实验菌株: 大肠杆菌(Escherichia coli ATCC 9739).
培养基: 肉汤蛋白胨培养基(牛肉膏3.0 g，蛋白胨 10.0 g，氯化钠 5.0 g 于1 L去离子水中).
培养条件: 温度为37℃，160r·min-1恒温振荡培养至对数期待用.
PFOA(纯度99%)、 0.9%生理盐水、 pH=7磷酸盐缓冲液、 1%多聚甲醛溶液(Sigma公司)，超微量ATP酶试剂盒、 丙二醛MDA试剂盒(南京建成生物工程研究所)，JC-1染液(Tetrechloro-tetraethylbenzimidazol carbocyanine iodide)、 碘化丙啶(Propidium iodide，PI)染液、 2′,7′-二氯荧光素二乙 酸酯(2′,7′-Dichlorodihydrofluorescein diacetate，DCFH-DA)染液(碧云天生物技术公司).
1.2 方法 1.2.1 实验方案设计配制10倍母液的无机盐培养基(K2HPO44.0 g，KH2PO4 2.0 g，(NH4)2SO4 20.0 g，MgSO4 1.0 g，KCl 2.0 g 于1 L去离子水中).实验时分别向含有0.1、1.0、 10.0mg·L-1 PFOA的培养基中加入1 mL培养至对数期的大肠杆菌菌悬液(20.0g·L-1)，使培养体系总体积为20 mL，于37℃、 160r·min-1条件下振荡培养，以不添加PFOA的无机盐培养基体系为对照.分别于培养开始后0 h (本文中0 h是指与污染物接触后迅速离心得到的菌体，测定相关指标)、 12 h、 36 h收集大肠杆菌细胞进行分析.
1.2.2 细胞膜通透性、 ROS、 跨膜电位的测定定时取样，离心收集细胞，对菌体细胞进行前处理(在无机盐培养体系中定时收集细胞，6 000r·min-1离心10 min，收集大肠杆菌细胞后，用PBS洗涤2次，每次洗涤后6 000r·min-1离心5 min，倾倒上清液)后,采用流式细胞仪BD FACS Aria Ⅲ (Becton,Dickinson and Company,Franklin Lakes,NJ,USA)测定大肠杆菌细胞膜通透性、 ROS、 跨膜电位[11~13].
1.2.3 菌体丙二醛MDA浓度测定收集细胞，用PBS洗涤2次后，加入 1 mL生理盐水混匀，收集上清液，按照试剂盒说明书进行测定.
1.2.4 ATP酶活性测定收集细胞，用生理盐水洗涤2次后，采用与MDA测定相同的条件进行超声破碎，超声破碎(4℃，40%功率，开启5 s，停止7 s，共计10 min)，然后在1 000r·min-1离心5 min收集上清液，按照试剂盒说明书进行测定.
1.2.5 细胞膜磷脂脂肪酸含量测定定时收集细胞，用PBS洗涤2 次，洗涤后倾倒上层液体，保留底部菌体.加入2 mL 的2% H2SO4 甲醇溶液，充入氮气排空离心管中空气，将螺口玻璃试管放入 80℃水浴锅中水浴 1 h，冷却至室温，分别加入 2 mL的蒸馏水和 2 mL的正己烷，充分振荡，4 000r·min-1离心 10 min，取出上层有机相放置到新的离心管中，氮气吹干，加入9.9 mL正己烷和 10 μL内标十九酸甲酯，振荡后转移至上机瓶中，封口待测[14].
2 结果与分析 2.1 PFOA胁迫对大肠杆菌胞内ROS的影响活性氧(ROS)主要包括氧自由基(O2-)、 过氧化氢(H2O2)、 羟自由基(OH-)等，是生物细胞内有氧代谢的产物[15].利用荧光探针DCFH-DA通过流式细胞仪可以检测细胞内活性氧的水平.图 1为PFOA对大肠杆菌细胞内ROS含量的影响.结果显示，在0 h，各 PFOA浓度处理下，胞内ROS发生了显著升高，说明PFOA在极短时间的接触即对大肠杆菌ROS代谢产生了显著影响.在处理12 h与36 h，变化趋势与0 h类似.
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图 1 PFOA对大肠杆菌细胞内活性氧含量的影响 Fig. 1 Effect of PFOA on intracellular ROS of Escherichia coli |
图 2中0 h的结果表明，在 PFOA处理下，胞内不饱和脂肪酸比率发生了显著下降.与0 h的结果比较，12 h与36 h胞内不饱和脂肪酸比率只略有降低.有研究表明，生物细胞在受到外界胁迫时，细胞内过量ROS会攻击膜[16]，与细胞膜中不饱和脂肪酸发生氧化反应.这与本研究结果有相似之处: 当胞内ROS升高(图 1)，其迅速与膜上的不饱和脂肪酸反应，从而降低了细胞膜的不饱和脂肪酸度.
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图 2 PFOA对大肠杆菌细胞膜不饱和脂肪酸比率的影响 Fig. 2 Effect of PFOA on the ratio of cell membrane unsaturated fatty acid of Escherichia coli |
生物胞内含量过高的ROS会攻击细胞膜使膜发生过氧化作用进而影响膜的流动性与稳定性[17].MDA是膜脂过氧化的主要产物之一，是评价膜脂过氧化作用强弱的一个重要标志.由图 3可知，PFOA可以很快导致细胞内MDA的增加.加入PFOA 0 h时，各浓度PFOA体系中大肠杆菌细胞MDA浓度均有显著增高.当处理时间延长，菌体细胞内MDA上升，与空白对照相比，在处理12 h与36 h，在PFOA浓度为0.1、 1.0 和10.0mg·L-1时，MDA浓度分别升高了1.91%、 3.71%、 9.13%与3.61%、 12.47%、 28.91%，说明菌体内MDA 与PFOA胁迫时间和浓度也呈正相关.
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图 3 PFOA对大肠杆菌细胞MDA浓度的影响 Fig. 3 Effect of PFOA concentration on MDA content of Escherichia coli |
PI可以用来进行细胞膜通透性的检测[18].图 4为PFOA胁迫对大肠杆菌细胞膜通透性的影响.结果表明，在加入12 h后，与对照相比，10.0mg·L-1的PFOA 对细胞膜通透性产生了显著影响.36 h，各浓度PFOA体系中染色细胞比例有显著性变化，说明在此时，PFOA已经对大肠杆菌细胞膜通透性产生了显著影响.然而，尽管如此，总的染色细胞的比例仍然不高，最高浓度10.0mg·L-1的PFOA处理下，染色细胞比例只有23%，说明大肠杆菌对PFOA具有较强的抗性或耐受性.
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图 4 PFOA对大肠杆菌细胞膜通透性的影响 Fig. 4 Effect of PFOA on membrane permeability of Escherichia coli |
图 5是以相对荧光强度(relative fluorescence intensity，RFI)表示PFOA对大肠杆菌膜电位的影响.从中可知，与对照相比，在0 h，0.1mg·L-1和1.0mg·L-1的PFOA处理下，RFI并未明显下降，此结果与前面PFOA对细胞膜系统通透性的影响相一致.在12 h和36 h，0.1mg·L-1和1.0mg·L-1体系中RFI并未明显下降，10.0mg·L-1 PFOA处理体系中的RFI则出现显著下降，降幅分别达到25.77%和11.97%.研究结果表明低于1.0mg·L-1的PFOA对大肠杆菌细胞膜跨膜电位没有影响，10.0mg·L-1 PFOA处理对大肠杆菌细胞膜跨膜电位有显著影响.
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图 5 PFOA对大肠杆菌跨膜电位(相对荧光强度)的影响 Fig. 5 Effect of PFOA concentration on transmembrane potential (RFI) of Escherichia coli |
在细胞受到胁迫时，原核生物细胞膜上的ATP酶活性会发生变化[19~22].图 5 表明 PFOA对大肠杆菌Na+K+-ATPase[图 6 (a)]和Ca2+Mg2+-ATPase[图 6 (b)]酶活性产生的影响.其中，0.1mg·L-1和1.0mg·L-1的PFOA对大肠杆菌Na+K+-ATPase、 Ca2+Mg2+-ATPase有相似的规律性: 0 h时10.0mg·L-1的PFOA对大肠杆菌Na+K+-ATPase、 Ca2+Mg2+-ATPase就有显著性影响，12 h时各处理组活性有显著增高，但趋势却耐人寻味: PFOA浓度越高，ATPase活性越低.但在36 h后，3个PFOA处理组的Na+K+-ATPase、 Ca2+Mg2+-ATPase均已显著低于对照组，且PFOA浓度越高，ATPase活性越低.说明在PFOA胁迫下，大肠杆菌细胞在一定时间内自身通过代偿性的增高ATPase的活性来抵御PFOA的胁迫，但是随着PFOA胁迫时间的延长，大肠杆菌细胞膜的完整性遭到破坏，ATP酶受攻击，催化环境受影响，导致ATP酶活性下降.
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图 6 PFOA对大肠杆菌Na+K+-ATPase、 Ca2+Mg2+-ATPase酶活性的影响 Fig. 6 Effect of PFOA concentration on Na+K+-ATPase and Ca2+Mg2+-ATPase activities of Escherichia coli |
在细胞受到外界胁迫时，细胞内ROS含量升高，过量ROS会攻击膜和蛋白质[6]，与细胞膜中不饱和脂肪酸发生氧化反应，导致细胞质膜的过氧化而引起膜氧化损伤[23]，进而影响膜的流动性与稳定性[7].丙二醛(MDA)不仅是细胞膜脂过氧化作用的产物之一，它还可以通过与细胞内一些成分发生反应，放大ROS作用，进一步造成细胞膜损伤，使得菌体细胞膜的通透性、 流动性、 稳定性、 完整性受损，正常生理活动与物质能量代谢受阻，导致细胞生理活性受到抑制[24]，进而导致细胞损伤与凋亡[25].此外，ROS还可以降低膜电位，影响能量代谢酶系统的活性.而受到外界刺激胁迫导致生物细胞内高浓度的Ca2+也会干扰细胞正常能量代谢和很多生理功能[26].在细胞内部，包括Na+K+-ATPase、 Ca2+Mg2+-ATPase等在内的ATP酶是广泛存在于细胞膜及细胞器膜上的一种十分重要的酶系统，对于细胞的能量代谢、 细胞内外渗透压的平衡、 离子的运输与平衡和细胞膜完整性起到了重要的作用[27~29]，并参与多种代谢活动，维持细胞正常的生理活性.
本研究中，在PFOA胁迫下，大肠杆菌细胞内的ROS水平升高，与细胞膜中不饱和脂肪酸发生氧化反应，使膜脂肪酸不饱和度降低，引起细胞膜过氧化作用，MDA含量增高，膜通透性改变，同时降低跨膜电位，使呼吸链受抑，能量代谢功能被削弱.此时包括Na+K+-ATPase、 Ca2+Mg2+-ATPase等在内的ATP酶对外界胁迫环境做出反应，表现出代偿性的活性升高，通过提高酶的活性来影响物质运输，维持细胞膜两侧的膜电位、 胞内离子水平以及细胞内外渗透压的平衡.但随着时间的延长，菌体细胞体内产生了过多的ROS，同时由于膜结构完整性遭到破坏，能量代谢功能受阻，又会进一步使细胞产生更多的ROS，发生的过氧化反应使细胞膜系统完整性受损更严重，进一步增大大肠杆菌细胞膜通透性，膜上的ATP酶也受攻击，酶催化环境受影响，表现出ATP酶活性下降，物质运输受影响，更多的PFOA得以进入细胞中，出现恶性循环，最终使得大肠杆菌细胞出现失活和衰亡.
4 结论(1) 在PFOA胁迫下，大肠杆菌细胞内ROS和MDA含量上升，膜脂肪酸不饱和度降低，通透性增大，跨膜电位降低，膜上Na+K+-ATP酶活性与Ca2+Mg2+-ATP酶活性随着处理时间的延长呈先上升后下降的趋势.
(2) PFOA对大肠杆菌产生了氧化胁迫，对其细胞膜有损害作用.
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