2017, Vol. 38
2. 深圳市水务(集团)有限公司, 深圳 518001
2. Shenzhen Water Group Co., Ltd., Shenzhen 518001, China
厌氧氨氧化(anaerobic ammonium oxidation，ANAMMOX)，指在厌氧或缺氧条件下，厌氧氨氧化微生物以NO2--N为电子受体，氧化NH4+-N生成氮气的生物过程.与传统硝化-反硝化脱氮工艺相比，厌氧氨氧化工艺缩短了氨氮氧化还原成氮气的过程，降低了曝气量，是一种高效节能的新型脱氮工艺，具有很好的应用前景.但是由于生长速度慢、 细胞产率极低、 对环境条件敏感等生长特性，厌氧氨氧化菌的富集培养很困难，如何调控更高效的厌氧氨氧化工艺是近几年来的研究热点.
在菌群生长过程中，细菌会释放出一种被称作自诱导物(auto-inducer，AI)的胞外信号分子.当自诱导物在其微环境中达到一个阈值时，信号被菌群接收并开始调节特定基因的表达[1]； 这一过程称为群体感应.群体感应是一种普遍存在于微生物细胞之间的通讯机制，包括种内和种间的通讯； 根据菌群密度和周围环境变化调节基因表达以调控细菌的诸多生理功能，如胞外多聚物(extracellular polymeric substances,EPS)的合成和分泌[2]、 细菌的聚集以及生物膜的形成等[3].顺-2-十二烯-11-甲基酸(cis-11-Methyl-2-dodecenoic acid,DSF)是一种种内和种间的信号分子，有研究表明DSF具有调控EPS产生和生物膜形成等功能[4, 5]； 酰基高丝氨酸内酯(N-acyl-homoserine lactone,AHLs)是一种革兰氏阴性菌种内信号分子，具有较高的种属特异性； 而AI-2一般被认为是种间细胞交流的通用信号分子[6].细菌细胞间的群体感应已经成为环境科学领域微生物学研究的重点，也为如何调控更高效的厌氧氨氧化工艺提供了新思路.
丁爽等[7]研究发现，厌氧氨氧化菌存在密度依赖性，并且具有自诱导物AHLs的合成潜力，因此推断厌氧氨氧化菌的活性和团聚行为与群体感应调控有关.刘思彤等[8]在启动厌氧氨氧化反应过程中，添加了少量活性较好的厌氧氨氧化颗粒污泥，此后，反应器的脱氮效果有了显著提高、 厌氧氨氧化菌活性也得到大幅度提高； 推测上述现象产生的原因是加入的活性较好的厌氧氨氧化菌具有较高的细胞密度，释放了高质量浓度的信号分子，周围的厌氧氨氧化菌在这些信号分子的诱导下启动表达相关基因，提高了菌群活性和脱氮效果.Tang等[9]研究发现人为添加适量的C6-HSL可以提高厌氧氨氧化菌的生长速率和活性，添加C8-HSL仅能提高细菌活性，而添加C12-HSL会抑制厌氧氨氧化菌的活性.而De Clippeleir等[10]在厌氧氨氧化颗粒污泥和OLAND生物膜系统中发现C12-HSL信号分子的存在，并且证明该信号分子能够提高厌氧氨氧化菌活性.
过去的研究报道说明厌氧氨氧化菌确实能产生AHLs信号分子，但是否存在AI-2信号分子，以及各种群体感应信号分子是否都有利于促进厌氧氨氧化菌附着生长仍不是很清楚.因此，本研究通过检测厌氧氨氧化污泥中存在的信号分子类型，并探索添加外源信号分子对厌氧氨氧化污泥附着生长能力的影响.从群体感应的角度，以期为调控和强化厌氧氨氧化工艺提供理论基础.
1 材料与方法 1.1 实验材料报告菌培养所需的抗生素(四环素、 壮观霉素、 庆大霉素等)和琼脂糖购于上海生工； 实验中所添加的8种化学合成AHLs信号分子(C6-HSL、C8-HSL、 C10-HSL、 C12-HSL、 3-oxo-C6-HSL、 3-oxo-C8-HSL、 3-oxo-C10-HSL、 3-oxo-C12-HSL)，以及顺-2-十二烯-11-甲基酸(cis-11-Methyl-2-dodecenoic acid,DSF)均购自Sigma-aldrich，8种AHLs均以甲醇为溶剂，配制成浓度为1 g·L-1的溶液； 实验中所用的超纯水是由Milli-Q梯度系统(Millipore,Bedford,MA)生产.
1.2 厌氧氨氧化污泥的培养以处理垃圾渗滤液的活性污泥作为接种污泥，接种至有效体积为1.1L的UASB反应器中.反应器进水采用人工配水(表 1)，在运行过程中，氮源[(NH4)2SO4和NaNO2]的添加量随反应器运行状况逐步增加，并通过水浴加热的方式控制温度在35℃±1℃； 进水pH通过碳酸氢钾调节，控制在7.5±0.05； 初始水力停留时间为24 h，随着反应器的运行逐步缩短水力停留时间至12 h.
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表 1 厌氧氨氧化菌富集培养进水配方1) Table 1 Nutrients used for enrichment of ANAMMOX bacteria |
1.3 厌氧氨氧化污泥的群体感应信号分子检测
AHLs信号分子的检测采用报告菌显色法[11]: 取反应器中的上清液50 mL经0.22 μm水系滤膜过滤后，用乙酸乙酯(色谱纯)等体积萃取3次，再用旋转蒸发仪常温蒸发至1 mL后，使用甲醇(色谱纯)润洗并转移至10 mL消解管中，再用氮气吹干，再加入1.5 mL甲醇定容，用0.22 μm有机滤膜过滤后转移至棕色样品瓶，用于后续AHLs检测.取适量报告菌Agrobacterium tumefaciens JZA1[KYC55 (pJZ372) (pJZ384) (pJZ410),Ti-]接种至100 mL AT培养基[(NH4)2SO4 200 mg； MgSO4 7.8 mg； CaCl2 0.76 mg； FeSO4·7H2O 0.5 mg； MnSO4·H2O 0.22 mg； KH2PO4 1.07 g； 葡萄糖0.5 g]中，在28℃、 180~190r·min-1条件下培养12~14 h； 再将培养菌液和50 mL 2.4%高压灭菌水琼脂混合后，摇匀后快速倒入灭菌的培养皿中，待培养基凝固后，均匀涂布60 μL 50 g·L-1的x-gal； 最后，取100 μL污泥上清液提取液涂布在培养基上，密封培养皿后将其放入28℃的恒温箱中培养12~14 h，观察其颜色变化.实验中设置阳性对照[涂布40 μL的N-3-羰基辛酰-L-高丝氨酸内酯(N-(3-Oxooctanoyl)-L-homoserine lactone,3-oxo-C8-HSL)(100 mg·L-1)信号分子]和阴性对照(空白).
AI-2信号分子的检测采用发光检测法[12]: 取哈氏弧菌(Vibrio harveyi)BB170接种于AB培养基中，在30℃、 150r·min-1的恒温培养箱中有氧培养16~18 h后，检测其D600 nm接近0.7.取出10 mL左右菌液，过滤得到后作为阳性上清液，取同体积的新鲜AB培养基过滤后作为阴性对照，按照1：5 000用AB培养基稀释剩余菌液并振荡.分别取20 μL反应器中的上清液、 阳性对照和阴性对照，加至白色96孔微孔板中，再加入稀释后的菌液(每孔180 μL)，混合后置于30℃、 150 r·min-1恒温培养箱中培养.随后的7 h中，每30 min取出一次，用酶标仪检测其发光强度.上述AB培养基的配置方法如下，首先将0.3 mol·L-1 NaCl，0.005 mol·L-1 MgSO4，0.2%酸水解酪蛋白(不含维生素)用KOH调节pH至7.5后，过滤灭菌，然后每100 mL培养基中加入灭菌后的1 mL 1 mol·L-1磷酸钾缓冲液 (pH 7.0)、 1 mL 0.1 mol·L-1精氨酸和2 mL 50%甘油.
1.4 厌氧氨氧化污泥附着实验将UASB中培养的污泥接种至六孔微孔板中，人为添加外源信号分子，培养一定时间后，测微生物附着量，开展厌氧氨氧化污泥附着实验研究.
(1) 考察菌悬液浓度对附着实验的影响
取不同浓度的菌悬液加至微孔板中，每孔加5 mL，并添加所需营养基质，用封口膜密封后，在恒温箱(35℃)中培养24 h后，测定微生物附着量.菌悬液浓度用D600(600 nm波长下的吸光度)的值来表征，分别采用D600值为0.2、 0.4、 0.6、 0.8、 1的5个阶梯浓度，每个浓度做6个平行样.其中添加的营养基质的配方与UASB反应器进水相同，初始氨氮浓度为50mg·L-1，亚硝氮为60 mg·L-1.
(2) 考察信号分子浓度对厌氧氨氧化污泥附着能力的影响
取一定浓度的菌悬液(D600=0.4)加至微孔板中，每孔加5 mL，添加所需营养基质后，再向微孔板中加入不同浓度(0、 1、 2、 4、 8μmol·L-1)的C12-HSL信号分子，每组做6个平行样.用封口膜密封后，在恒温箱(35℃)中培养24 h后，测定微生物附着量.
(3) 考察不同信号分子类型对厌氧氨氧化菌附着能力的影响
取一定浓度的菌悬液(D600=0.4)加至微孔板中，每孔5mL，添加所需营养基质后，再向微孔板中分别加入2 μmol·L-1的9种信号分子(C6-HSL、C8-HSL、 C10-HSL、 C12-HSL、 3-oxo-C6-HSL、 3-oxo-C8-HSL、 3-oxo-C10-HSL、 3-oxo-C12-HSL、 DSF)，并设置空白对照组，每组做6个平行样.用封口膜密封后，在恒温箱(35℃)中培养24 h后，测定微生物附着量.附着实验的微生物附着量采用结晶紫染色法[13, 14]来测定.
1.5 常规指标的分析方法氨氮、 亚硝氮和硝氮的测定均采用紫外分光光度法(HACH DR6000)； 污泥量MLSS采用重量法[15]测定； pH采用HACH pHC01电极测定，溶解氧浓度采用HACH LDO101电极测定.为分析污泥样品的微生物多样性，实验中采用高通量测序法(Illumina MiSeq sequencing)测定菌群结构[16~18]，具体方法如下: 首先采用E. Z. N. A. ® Bacteria DNA提取试剂盒(Omega Bio-tek,Norcross,GA,U. S.)提取厌氧氨氧化污泥样品中细菌基因组DNA； 将提取到的DNA通过PCR扩增16S核糖体RNA基因的V3-V4可变区，所用引物为338F 5′-barcode-ACTCCTACGGGAGGCAGCA-3′ 和806R 5′-GGACTACHV- GGGTWTCTAAT-3′，反应体系为20 μL(包括4 μL的 5×FastPfu Buffer，2 μL的2.5 mmol·L-1 dNTPs，5 μmol·L-1引物 各0.8 μL，0.4 μL的FastPfu Polymerase和10ng模板DNA)，扩增条件为: 95℃解链2min，95℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，25个循环，再 72℃延伸5min，每个样品的扩增均做3次重复，然后从2%琼脂糖凝胶中回收扩增子，采用AxyPrep DNA Gel Extraction Kit(Axygen Biosciences,Union City,CA,U. S.)进行纯化，再用QuantiFluorTM -ST (Promega,U. S.)进行定量.最后将纯化后的扩增子等量混合，然后根据Illumina MiSeq测序平台的标准流程进行双端(2×300bp)测序.原始数据提交到NCBI Sequence Read Archive (SRA)数据库进行比对、 分析.
2 结果与讨论 2.1 厌氧氨氧化工艺运行情况反应器的进水氨氮与亚硝氮浓度之比为5：6，初始进水氨氮浓度为70 mg·L-1、 亚硝氮为84 mg·L-1； 在运行过程中，进水氨氮逐渐提高至250 mg·L-1，亚硝氮也成比例提高至300mg·L-1 [图 1(a)]，出水氨氮和亚硝氮稳定在较低水平.然而，随着进水氮源浓度显著提高，出水硝氮浓度不仅没有出现大幅提高的趋势，反而有所降低，在运行150 d后，出水硝氮由初期的100 mg·L-1以上，降到了75 mg·L-1，总氮降解率达到了80%以上.整个培养过程中，不断提升进水氨氮、 亚硝氮浓度并逐渐降低HRT，通过这两种方式提升总氮去除负荷.
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图 1 反应器的脱氮效果和不同菌种的氮消耗量 Fig. 1 Nitrogen removal efficiency and nitrogen consumption of different bacteria in the bioreactor |
在自然环境中，厌氧氨氧化菌(ANAMMOX)通常与好氧氨氧化菌(ammonia-oxidizing bacteria,AOB)和硝化细菌(nitrite-oxidizing bacteria,NOB)共同存在，考虑到AOB和NOB在氮元素转换过程中也发挥了很大作用，根据厌氧氨氧化、 好氧氨氧化和硝化反应的反应式，可以推导出3个方程式:
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(1) |
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(2) |
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(3) |
这3个方程式反映了进出水氨氮、 亚硝氮以及硝氮浓度与3类菌种在反应器中消耗的氮浓度之间的关系，通过这3个方程式可以计算出不同菌种的氮消耗量，进而量化出3种细菌在氮循环中发挥的功效.在运行150 d后，用上述公式计算出反应器内AOB、 NOB和ANAMMOX各自发挥的作用[图 1(b)]，结果表明，反应器中厌氧氨氧化菌的作用明显大于好氧氨氧化菌和硝化细菌，由此可推断，厌氧氨氧化菌已经成为反应器内利用氮源的优势菌种.
2.2 厌氧氨氧化污泥菌群结构在反应器运行150 d后，测定了反应器内活性污泥的菌群结构(图 2).其中，Candidatus brocadia、 Candidatus kuenenia和Candidatus anammoxoglobus均为厌氧氨氧化菌属[19].Candidatus brocadia在菌群结构中的比例达到了10%，Candidatus kuenenia的比例为8.7%，Candidatus anammoxoglobus的比例为1.8%； 总体来看，厌氧氨氧化菌在菌群中所占比例超过了20%.其接种污泥的菌群结构中，Candidatus brocadia和Candidatus anammoxoglobus所占比例均不超过1%，运行150 d后，Candidatus brocadia和Candidatus anammoxoglobus所占比例有了大幅度上升，并且新产生了Candidatus kuenenia属的厌氧氨氧化菌； 主要原因是氮负荷的持续提高和适宜的生长环境，促进了厌氧氨氧化菌的生长和富集.
根据菌群结构分析发现[图 2(a)]，本研究的厌氧氨氧化污泥中也存在一定量的AOB和NOB，但其比例均远小于ANAMMOX，ANAMMOX所占比例约为NOB的10倍、 AOB的20倍[图 2(b)].对比厌氧氨氧化污泥中ANAMMOX、 AOB和NOB存在的数量及其氮消耗量[图 1(b)]可以发现，无论是菌群数量还是氮消耗量，都存在着ANAMMOX>NOB>AOB的关系.AOB和NOB主要生长在反应器内溶氧相对较高的位置，AOB把氨氮氧化成亚硝氮，可作为NOB的氮源.由于整个反应器内溶解氧浓度低，同时AOB和NOB都与优势菌ANAMMOX存在竞争氮源的关系，反应器内环境不利于AOB和NOB生长，因此这两类细菌在整个菌群中所占比例很低.ANAMMOX作为优势菌种，在该体系中发挥着主要的脱氮作用.
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图 2 厌氧氨氧化污泥的菌群结构及ANAMMOX、 AOB和NOB所占比例 Fig. 2 Microbial community structure of ANAMMOX sludge and the proportions of ANAMMOX,AOB and NOB |
用JAZ1作为报告菌，检测厌氧氨氧化污泥提取液中是否存在AHLs信号分子的结果[图 3(a)]表明，在过夜培养后，有厌氧氨氧化污泥提取液的培养皿(ANAS)显现出蓝色，阳性对照显现出较深的蓝色，而阴性对照不显色.实验结果表明厌氧氨氧化污泥中确实有AHLs信号分子存在，但是浓度很低.此外，用哈氏弧菌发光检测法检测污泥中是否存在中间信号分子AI-2，若实验组最低点发光强度与初始发光强度比值大于空白组的该比值，则说明存在AI-2信号分子； 厌氧氨氧化污泥的发光检测实验的结果表明[图 3(b)]，污泥样品中不存在AI-2信号分子，可能是由于厌氧氨氧化污泥的菌群结构较为单一.
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图 3 AHLs和AI-2信号分子的检测 Fig. 3 Detection of AHLs and AI-2 signal molecules |
现有研究表明，AHLs信号分子会通过调节EPS的产生来促进污泥聚集生长、 生物膜的形成和颗粒化[1]，本研究发现，虽然厌氧氨氧化污泥自身可以产生AHLs信号分子，但是浓度较低； 因此，推测可以通过添加外源信号分子的方式，促进厌氧氨氧化污泥聚集生长，实现快速颗粒化.
2.4 外源添加信号分子对厌氧氨氧化污泥附着生长的影响 2.4.1 菌悬液浓度的影响对厌氧氨氧化污泥附着生长实验条件优化(图 4)可以发现，菌悬液浓度为D600=1.0时，微生物附着量明显大于其他浓度下的微生物附着量； D600=0.4和D600=0.6的浓度下的微生物附着量略大于D600=0.2和D600=0.8浓度下的附着量.考虑到一次性取大量厌氧氨氧化污泥用于附着实验，会影响反应器的脱氮效果和富集培养过程，因此，选取相对较低的浓度，又能获得较高的微生物附着量的菌悬液初始浓度D600=0.4来进行后续的附着实验.
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*表示显著性差异（P＜0.05） 图 4 初始生物量对厌氧氨氧化污泥附着生长的影响 Fig. 4 Effect of initial biomass on the adhesion growth of ANAMMOX sludge |
通过添加不同浓度的C12-HSL信号分子的附着实验(图 5)可以发现，添加C12-HSL信号分子的实验组的微生物附着量均高于空白组，随着信号分子浓度提高，微生物附着量也更高； 这表明C12-HSL信号分子对厌氧氨氧化污泥的附着生长能力有促进作用，并且浓度越高，促进作用越强.随着信号分子浓度的增加，微生物附着量的差异越来越小，可以推测信号分子浓度对厌氧氨氧化污泥附着生长的促进作用并不是线性增长的关系.信号分子浓度为2、 4和8 μmol·L-1的实验组微生物附着量均达到了较高的水平，并且三组的差异很小，同时考虑到信号分子的成本问题，在后续实验中，采用信号分子浓度为2 μmol·L-1进行实验.侯保连等[20]在研究信号分子对硝化污泥附着生长能力的影响实验中，加入的信号分子浓度为2 μmol·L-1； Valle等[21]在探索信号分子对活性污泥中微生物的群落组成和功能的影响实验中，采用的信号分子浓度也是2 μmol·L-1； Gamage等[22]在添加外源信号分子修复生物膜的实验中发现，添加2 μmol·L-1的C8-HSL信号分子最有利于生物膜的形成.结合本实验的研究结果，说明以信号分子浓度2 μmol·L-1进行附着实验是合适的.
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图 5 信号分子浓度对厌氧氨氧化污泥附着生长的影响 Fig. 5 Effect of signal molecule concentration on the adhesion growth of ANAMMOX sludge |
通过添加浓度相同但类型不同的信号分子的附着实验(图 6)发现，不同类型的信号分子对厌氧氨氧化污泥的附着生长发挥着不同作用.其中，添加3-oxo-C8-HSL对微生物附着生长的促进效果最明显； 其次是3-oxo-C6-HSL和3-oxo-C12-HSL，且这两组的微生物附着量相当； 再次是C12-HSL、 C6-HSL和 3-oxo-C10-HSL； 添加DSF、 C8-HSL和C10-HSL均未能提高厌氧氨氧化污泥的附着生长能力.由此可见，3-碳位置取代基为羰基(3-oxo-C6-HSL、 3-oxo-C8-HSL、 3-oxo-C10-HSL、 3-oxo-C12-HSL)的AHLs均对厌氧氨氧化污泥的附着生长有较明显的促进作用，而3-碳位置无取代基的AHLs中只有C6-HSL和C12-HSL发挥积极影响.
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图 6 信号分子类型对厌氧氨氧化污泥附着生长的影响 Fig. 6 Effect of AHLs and DSF on the adhesion growth of ANAMMOX sludge |
Tan等[23]研究发现添加外源3-oxo-C6-HSL、 3-oxo-C8-HSL和 C6-HSL信号分子明显促进了好氧污泥EPS的产生.Kusada等[24]在一种β-内酰胺抗药性细菌Acidovorax sp.strain MR-S7中人为添加3-碳位置取代基为羰基的AHLs，发现这些信号分子均能促进生物膜的形成.Li等[25]发现添加3-碳位置取代基为羰基的AHLs，对自养硝化污泥附着生长的促进作用优于3-碳位置无取代基的AHLs.结合本研究结果表明，3-碳位置取代基为羰基(3-oxo-C6-HSL、 3-oxo-C8-HSL、 3-oxo-C10-HSL、 3-oxo-C12-HSL)的AHLs信号分子对多种微生物的附着生长均能发挥积极的影响，非常适用于强化菌群多样性高的活性污泥附着生长及其颗粒化.而3-碳位置无取代基的AHLs则很可能针对不同的菌种发挥不同的作用.已有研究发现厌氧氨氧化颗粒污泥中存在C12-HSL[10]，还有研究发现人为添加适量的C6-HSL可以提高厌氧氨氧化菌的生长速率和活性[8]，由此可以解释这两种3-碳位置无取代基的AHLs对厌氧氨氧化菌的附着生长能起到促进作用.DSF信号分子对厌氧氨氧化污泥的附着生长没有起到促进作用，这很可能是因为DSF的存在会抑制EPS的生成[1]，而EPS通常有利于活性污泥凝聚及附着生长.因此，通过外源添加AHLs信号分子(特别是3-碳位置取代基为羰基的AHLs)来促进厌氧氨氧化工艺的启动从而提高脱氮能力是可行的.
3 结论(1) 厌氧氨氧化污泥能产生少量浓度较低的AHLs信号分子，但不存在AI-2种间信号分子.
(2) 添加3-碳位置取代基为羰基的AHLs信号分子，均可促进厌氧氨氧化污泥的附着生长，促进效果由高到低依次为3-oxo-C8-HSL、 3-oxo-C6-HSL、 3-oxo-C12-HSL、 3-oxo-C10-HSL； 3-碳位置无取代基的AHLs 中只有C12-HSL、 C6-HSL存在积极影响，而C8-HSL、 C10-HSL以及DSF信号分子对厌氧氨氧化污泥的附着生长能力并没有促进作用.
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