2017, Vol. 38
2. 工业典型污染物废物资源化处理北京市重点实验室, 北京 100083
2. Beijing Key Laboratory of Resource-Oriented Treatment of Industrial Pollutants, Beijing 100083, China
由于冬季低温的影响，中国北方污水处理厂常面临季节性TN超标的问题.此外，受制于市政污水低碳氮比的水质特性，污水处理厂也面临着异养反硝化不充分而导致的TN超标问题.与异养反硝化相比，硫自养反硝化是以还原态硫为电子供体，NO3--N为电子受体进行的自养反硝化过程，能够有效地去除水中的NO3--N[1~3].硫自养反硝化因无需外加碳源、运行成本低、污泥产量少、效率高、工艺简单等优点而得到广泛关注[4~6].目前，Li等[7]将硫自养反硝化工艺应用于低温、低碳氮比条件下污水处理厂氮污染物的去除，并达到了90%以上的氮去除效果.另一方面，硫自养反硝化过程作为冬季或低碳比条件下的脱氮保障工艺，常面临季节性、间歇性运行的操作方式.但是针对硫自养反硝化工艺饥饿忍耐后能力恢复及其对微生物菌群结构影响的研究却鲜见报道.
近年来，分子生物学作为有效手段用来研究污水处理过程中微生物群落结构特性，如变形梯度凝胶电泳、克隆文库和高通量测序等[8~11]. MiSeq高通量测序以Illumina的测序技术为基础，通过可逆终止试剂方法对数百万个基因片段同时进行大规模平行测序，具有分析结果精确、高速等特点，被广泛应用于污水处理过程中微生物结构和多样性研究[12, 13].
本文以颗粒硫磺和黄铁矿的硫自养反硝化反应器为研究对象，探究反应器在经过30 d饥饿忍耐后的恢复情况，并利用MiSeq高通量测序对饥饿忍耐前后反应器中细菌群落的变化情况进行分析，以期为污水处理厂脱氮保障工艺的季节性、间歇性运行提供技术参考.
1 材料与方法 1.1 试验装置硫自养反硝化工艺采用降流式生物滤池，试验装置示意图如图 1所示.反应器为密封的有机玻璃柱，内径140 mm，高度1 170 mm，填充高度500 mm，有效容积5.94 L.进水口距柱底600 mm，沿反应器不同高度处分别设置取填料口，取填料口距填料顶部的距离分别是100 mm和300 mm.
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图 1 试验装置示意 Fig. 1 Schematic layout of experimental installation |
试验共设2个反应器(分别记为1号、2号)，1号反应器加入硫磺和白云石的混合物，2号反应器加入黄铁矿和白云石的混合物. 2个反应器中的填料均按1:1的体积比混合装填，硫磺、黄铁矿和白云石的粒径均为5~10 mm.其中，硫磺/白云石的填充区域孔隙率为45.9%，黄铁矿/白云石为44.1%.
1.2 进水水质和接种污泥本试验用水为人工模拟污水厂尾水，水质指标为: NO3--N浓度为30 mg·L-1，NH4+-N浓度为2 mg·L-1，TP浓度为1 mg·L-1，COD浓度为18~23 mg·L-1，pH为6.8~7.2.接种污泥取自高碑店污水处理厂二沉池回流污泥.
1.3 反应器运行方式反应器在低温下运行85 d (1月2日至3月26日)，主要分为稳定期、饥饿期和恢复期:稳定期(1~30 d)，正常进水，反应器稳定运行，平均温度为12℃；饥饿期(31~60 d)，停止进水，反应器处于饥饿状态，平均温度12.8℃；恢复期(61~85 d)，恢复进水，反应器进入恢复期，平均温度为14℃.饥饿期结束后及恢复期采集反应器中的污泥样品(1号饥饿期A1、恢复期A2；2号饥饿期B1、恢复期B2) 进行MiSeq高通量测序分析，分析反应器饥饿期及稳定期细菌群落的变化情况.
1.4 测试指标和方法 1.4.1 水质指标的测定反应器运行期间，定期采样进行水质指标的测定，检测项目包括硝酸盐氮(NO3--N)、亚硝氮(NO2--N)、总氮(TN)、总磷(TP) 等.其中NO3--N采用紫外分光光度法测定；NO2--N采用N-(1-萘基)-乙二胺分光光度法测定；TN采用碱性过硫酸钾消解紫外分光光度法测定；TP采用钼酸盐分光光度测定.试验所用分光光度计为HACH DR5000紫外可见分光光度计.生物量采用脂磷法测定[14].
1.4.2 微生物多样性的测定DNA的提取与PCR的扩增:为了探究系统的细菌群落，在反应的饥饿期和恢复期进行取样.采用E. Z. N. A. Soil DNA试剂盒(美国Omega公司)，按照试剂盒说明书提供的操作步骤提取.提取的DNA用1%琼脂凝胶电泳进行检测. PCR的扩增区域为16S rRNA的V3-V4区，细菌16S rRNA扩增引物采用通用引物(338F/806R).引物名称和引物序列分别是338F (ACTCCTACGGGAGGCAGCAG) 和806R (GGACTACHVGGGTWTCTAAT). PCR反应体系: Forward primer (10 μmol·L-1)，2 μL；Reverse primer (10 μmol·L-1)，2 μL；dNTPs (2.5 mmol·L-1)，4 μL；10×PCR buffer，5 μL；Pyrobest DNA Polymerase (2.5 U·μL-1)，0.3 μL；补充ddH2O至50 μL.反应程序:先95℃预热5 min；然后进行25个循环(95℃变形30 s，56℃退火30 s，72℃延伸40 s)，最后72℃延伸10 min.用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(Axygen公司) 回收PCR产物，经Tris-HCl洗脱后，用2%琼脂糖凝胶电泳检测.根据电泳结果.将PCR产物用QuantiFluorTM -ST (Promega公司) 进行定量，按照每个样品的测序量要求，进行相应比例的混合.
MiSeq文库构建与测序:用高通量测序平台Illumina MiSeq对扩增产物进行MiSeq高通量测序.测序得到的PE reads根据overlap关系进行拼接，同时过滤掉低质量的reads，区别样品后进行OUT聚类分析和物种分类学分析.
生物多样性和分类学分析:首先将序列按照彼此的相似性归为操作分类单元(OTU).按照97%相似性进行OUT聚类，采用RDP classifier对97%相似水平的OUT代表序列进行分类学分析.利用MOTHUR软件对样品覆盖率(coverage percentage)，ACE，Chao丰富指数以及Shannon多样性指数进行计算.同时为了保证分析的高可信度，根据SILVA106库中的参考序列对OUT进行种属鉴定，种属比对的可信度阈值设定为80%.
2 结果与讨论 2.1 反应器运行情况稳定期、饥饿期和恢复期的硫自养1号和2号反应器进出水水质的变化情况如图 2所示.进水NO3--N、NO2--N、TN和TP平均浓度分别为30.00、0.01、35.88和1.00 mg·L-1.稳定期，反应器在低温下(12℃) 运行30 d后，1号反应器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP浓度分别为1.78、0.03、2.87和0.91 mg·L-1，TN去除率为91.9%，1号反应器具有较高的脱氮效果. 2号反应器出水NO3--N、NO2--N、TN和TP浓度分别为11.32、0.11、13.10和0.14 mg·L-1，TN和TP去除率分别为63.49%和86.41%. 2号反应器具有同步脱氮除磷的效果.
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图 2 饥饿前后反应器NO3--N、NO2--N、TN、TP的变化 Fig. 2 Changes of NO3--N, NO2--N, TN and TP of the reactors before and after starvation |
反应器稳定运行后，停止进水，进入饥饿期.经过30 d的饥饿忍耐后，反应器在低温下(14℃) 恢复进水，进入恢复期.由图 2可以看出，饥饿忍耐后，1号反应器出水NO3--N增加到27.87 mg·L-1，2号反应器出水NO3--N增加到26.56 mg·L-1.但随着反应器的恢复，出水NO3--N浓度逐渐降低，1号反应器经5 d的恢复(第65 d)，出水NO3--N和TN浓度分别为0.38 mg·L-1和2.37 mg·L-1，去除率分别为98.8%和93.6%；2号反应器经11 d的恢复(第71 d)，出水NO3--N和TN浓度分别为10.51 mg·L-1和12.91 mg·L-1，去除率为66.40%和65.57%.其次，在恢复期2个反应器的出水NO2--N浓度均呈现先增加后降低的趋势，恢复初期均出现NO2--N的积累.由图 2可知，1号反应器恢复期第3 d (第63 d) 出水NO2--N浓度为2.17 mg·L-1；2号反应器恢复期第5 d (第65 d)，出水NO2--N浓度为0.37 mg·L-1.随着反应器稳定运行，最终1号反应器NO2--N浓度下降到0.1 mg·L-1以下，2号反应器有0.1 mg·L-1 NO2--N的积累量.此外，饥饿忍耐未对2号反应器TP的去除效果产生明显的影响.原因如下，2号反应器对磷的去除主要是通过黄铁矿中的铁与磷结合形成铁磷沉淀物及铁的氧化物和氢氧化物对磷有吸附作用，饥饿条件下并未明显影响这一物理化学过程[15, 16].结果表明，与1号反应器相比，2号反应器的恢复时间略长，但2个反应器都能在低温、短期内恢复到正常处理效果.
饥饿期(第60 d) 及恢复期(第85 d) 反应器不同高度处微生物量的变化如表 1所示.从中可知，1号和2号反应器饥饿忍耐后不同高度处微生物量均低于恢复期.分析原因，主要是饥饿期间反应器中部分微生物对饥饿环境的忍耐能力差，裂解死亡；部分细菌因营养物质缺乏而进入休眠状态，不能进行生长繁殖.反应器恢复进水后，生物膜的活性和生长可得到不同程度的恢复，使得微生物量有所增加，同时反硝化性能得以恢复[17~19].
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表 1 饥饿忍耐前后反应器不同高度处生物量的变化/nmol·g-1 Table 1 Changes of biomass at different height of the reactors before and after the starvation/nmol·g-1 |
2.2 微生物多样性的分析
利用MiSeq平台对A1、A2、B1、B2这4个污泥样品进行高通量测序，分别获得39 989、39 302、45 227、61 572条优化序列.将优化序列截齐后与SILVA106库比对后进行聚类，在97%的相似性下分别获得3 188、3 412、1 734、1 976个OUTs.并且4个污泥样品的覆盖率(Good's coverage) 均在95%以上，表明本研究中构建的序列库可以覆盖细菌群落的多样性(见表 2).
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表 2 样品的物种丰富度和多样性分析 Table 2 Species abundance and diversity of samples |
Chao指数和Shannon指数表示微生物群落结构的变化.群落丰富度用Chao指数描述，其值越高表明群落物种的丰富度越高；Shannon指数可以反映样品的多样性程度，其值越高表明群落物种的多样性越高. 表 2显示，4个污泥样品的Chao和Shannon指数均为A2>A1>B2>B1.结果表明，1号反应器中的物种丰度和多样性均高于2号反应器.分析原因，主要是黄铁矿/白云石反应器(2号) 中所用硫源为黄铁矿，其硫含量低于硫磺.这使得硫磺/白云石反应器(1号) 中的硫自养反硝化菌群因得到充足基质而更好的生长.即由于基质含量的不同，黄铁矿/白云石反应器中的自养反硝化菌种的生长受到一定的限制.另一方面，经过30 d的饥饿忍耐后，硫磺/白云石和黄铁矿白云石2个反应器中微生物丰富度和多样性明显低于恢复期.分析原因，主要是饥饿期部分微生物对饥饿环境的忍耐能力差，裂解死亡，部分细菌因营养物质缺乏而进入休眠状态；恢复期生物膜的活性和生长可得到不同程度的恢复.这与上述反应器中微生物量饥饿期低于恢复期的变化是一致的.
2.3 群落结构分析基于SILVA数据库的分类信息，对饥饿期及恢复期污泥样品的高通量测序数据进行了门、纲、属水平上的分类分析.门分类水平上，4个污泥样品共检测出39个类群，门水平上的大量类群(相对丰度大于1%) 如图 3所示.从中可知，A1和A2样品中Proteobacteria为优势菌群，丰度分别为89.70%和89.77%，其次为Bacteroidetes (5.88%和5.60%) 和Chlamydiae (1.21%和1.71%)，其他菌类比例相对较低(相对丰度小于1%). B1和B2样品中Proteobacteria为优势菌群，比例分别为51.82%和55.42%.此外，Bacteroidetes、Chlamydiae、Chloroflexi、Actinobacteria、Acidobacteria、Chlorobi、Planctomycetes、Verrucomicrobia、Gemmatimonadetes也是B1和B2样品中主要的门类(相对丰度大于1%).结果表明，1号和2号反应器在生物群落结构和丰度上具有比较明显的差异.两组反应器最主要的优势菌门虽均为Proteobacteria，但其相对丰度存在明显的差异，且2号反应器在门水平上的主要类群较为多样.此外，每组反应器饥饿期和稳定期丰度变化不大.
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图 3 门水平上群落结构 Fig. 3 Bacterial communities of samples at phylum level |
纲分类水平上，1号和2号反应器中共检测出68个类群，其中7个类群为主要的纲，如图 4所示. A1和A2样品中主要的纲类为β-Proteobacteria，丰度为73.42%和69.15%，且β-Proteobacteria中的一些细菌是与污泥反硝化相关的[20~22]；其次为α-Proteobacteria、γ-Proteobacteria、Sphinggobacteria、Chlamydiae (相对丰度大于1%). B1和B2样品中主要的纲类为α-Proteobacteria、β-Proteobacteria、γ-Proteobacteria.此外B1和B2污泥样品中还含有的δ-Proteobacteria、Ignavibacteria、Chlorobia、Actinobacteria、Anaerolineae、Acidobacteria、Gemmatimonadetes、Phycisphaerae. 图 4表明，不同样品中类群结构及丰度差异性较大，1号反应器中β-Proteobacteria的相对丰度高于2号反应器，2号反应器中α-Proteobacteria和γ-Proteobacteria的相对丰度则高于1号反应器.
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图 4 纲水平上群落结构 Fig. 4 Bacterial communities of samples at class level |
属分类水平上，1号和2号反应器大量类群如图 5所示.在属水平上，2个反应器中共检测出296个细菌类群.其中A1和A2样品中主要属类为Sulfobacillus、Variovorax以及Thiobacillus，其丰度分别35.67%、8.82%、19.54%(A1) 和31.98%、13.25%、11.86%(A2).其中，Sulfobacillus是噬酸且耐热的硫化物矿石氧化菌，也是亚铁离子氧化菌[23]. Thiobacillus为革兰氏阴性细菌，是目前被报道最多的用于还原NO3--N的硫氧化细菌，可用于硫自养反硝化处理市政污水和地下水中的NO3--N[24~26].此外，A1和A2样品中的主要类群(相对丰度大于1%) 还包括Thermomonas、Ferruginibacter、Denitratisoma、Sulfurimonas、Rhizobium.
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图 5 属水平上群落结构 Fig. 5 Bacterial communities of samples at genus level |
与A1和A2样品相比，B1和B2样品中的主要类群包括Sulfobacillus、Variovorax、Thiobacillus、Denitratisoma、Ferruginibacter、Neochlamydia、Woodsholea、Blastocatella、Bradyrhizobium、Sulfuritalea等菌属.并且不同时期反应器中某些菌属的相对丰度有一定的差别，如B1和B2样品中Sulfobacillus和Thiobacillus在饥饿期和恢复期的相对丰度分别为0.06%、4.88%(B1) 和3.89%、0.70%(B2).
3 结论(1) 颗粒硫磺/白云石和黄铁矿/白云石反应器经过30 d的饥饿期后，分别需要5 d和11 d就可使NO3--N去除率恢复饥饿前的水平，且恢复期初期均出现NO2--N的积累现象.两个反应器在短时间内均能恢复稳定运行，在低温条件仍能保持良好的脱氮效果.
(2) 高通量测序结果表明，黄铁矿/白云石反应器的细菌群落的丰度和多样性低于硫磺/白云石反应器.经过30 d的饥饿忍耐后，两个反应器的细菌群落的丰度和多样性均略低于恢复期.
(3) 微生物群落结构的分析表明，颗粒硫磺/白云石和黄铁矿/白云石硫自养反应器的优势菌门均为Proteobacteria，主要的纲类均为β-Proteobacteria.颗粒硫磺/白云石反应器中存在起主要反硝化作用的Thiobacillus.
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