2017, Vol. 38
微生物燃料电池(microbial fuel cell, MFC) 是近年来发展起来的一种污水同步处理与电能回收技术[1, 2].它是一种利用产电微生物作为生物催化剂将有机物降解并产生电能的装置[3, 4].许多易降解有机物能够在燃料电池中被微生物降解并产电[5]. MFC特殊的厌氧环境也为难降解废水的处理提供了可能.虽然有研究报道含纤维素[6]、垃圾渗滤液[7]、硝基苯[8]、喹啉[9]、甲苯[10]、偶氮染料[11]、苯酚[12]等难降解有机物的废水也可以在MFC系统中降解，但难降解有机物的存在往往会抑制系统产电.因此，如何提高难降解有机物的处理效果并同步产电，成为MFC系统推广应用的关键.
2, 4-二氯苯氧乙酸(2, 4-D) 是一种广泛应用的除草剂，它毒性强，对许多生物具有“三致”效应[13]. 2, 4-D的芳环结构和氯代原子的存在使其很难被降解，在环境中具有持久性[14, 15].生物方法是去除废水中2, 4-D的主要方法，如利用对2, 4-D具有高效降解作用的微生物进行生物强化，或采用高效的颗粒污泥技术等.当利用微生物燃料电池污水处理系统处理含2, 4-D的废水时，2, 4-D存在对系统产电及微生物群落结构有何影响，如何通过MFC操作模式的优化强化2, 4-D的去除同步产电，相关研究尚未开展，有待深入研究.
本研究以MFC系统强化2, 4-D去除为目标，探讨了不同浓度2, 4-D加入阳极室对MFC系统产电影响，以及阳极预曝气对2, 4-D强化去除效应及微生物群落结构影响.本研究对于推动微生物燃料电池技术在难降解废水中的应用具有理论价值与实践意义.
1 材料与方法 1.1 实验装置本实验使用一种方形双室MFC，阳极室和阴极室体积均为100 mL，阳极采用碳布(2 cm×8 cm，HCP330，河森，上海)，阴极采用涂覆铂催化剂(0.40 mg·cm-2) 的碳纸(3 cm×4 cm)，两极间用质子交换膜分隔(PEM). PEM在使用前进行预处理，以去除表面的有机物和金属离子杂质:将膜放入80℃的3%过氧化氢中1h，用80℃的去离子水冲洗膜1 h，再将膜在80℃的1 mol·L-1硫酸溶液中浸泡1 h，用80℃的去离子水冲洗膜1 h.经过清洁的Nafion膜被存放在去离子水中，使用前在空气中风干.用铜导线连接阳极，外接负载和阴极.所有连接处暴露的金属均用非导电性的环氧树脂密封. MFC的运行温度设定为(30℃±1℃)，系统在间歇条件下运行.
1.2 微生物接种与运行采用取自污水处理厂的厌氧污泥和好氧颗粒污泥进行接种.挂膜时，阳极室和阴极室需要使用磷酸盐缓冲溶液(phosphatebuffered solution, PBS) 来增加溶液的导电和缓冲能力.以含2 000 mg·L-1乙酸钠的PBS溶液(50 mmol·L-1, pH=7.0) 作为阳极液，以单纯的PBS溶液(50 mmol·L-1, pH=7.0) 作为阴极液并从阴极室底部曝气.当阳极表面形成可见生物膜时，去除阳极液中的悬浮和沉淀污泥.
在实验中，用于MFC的基质有乙酸钠、2, 4-D、乙酸钠和2, 4-D的混合液. MFC先使用乙酸钠作为基质，启动成功后转换为混合基质.向MFC中加入有2, 4-D降解能力的好氧颗粒污泥和厌氧污泥混合物，以便快速构建具有2, 4-D降解能力的MFC体系.成功启动后的MFC首先在阳极厌氧模式下运行，伴随着不同浓度的2, 4-D加入，每种浓度条件至少运行两个周期且电压降至50 mV以下时更换基质.每次更换基质后，阳极室吹氮10 min以保证厌氧状态.之后采用间歇曝气的方式运行，在每个周期开始前对阳极曝气6 h，用于强化2, 4-D的去除.
1.3 分析检测方法水质指标:化学需氧量(chemical oxygen demand, COD) 按照标准分析法测定，溶解氧采用便捷式溶解氧测定仪(雷磁JPBJ-608) 进行测定，2, 4-D的浓度采用高效液相色谱仪(HPLC) (Waters 1525, USA) 进行检测，进样前用0.22 μm的膜过滤.流动相为：甲醇:水=3:1，检测波长为紫外280 nm，液体流动速度为1 mL·min-1.
电化学测定与计算:数据采集由连接在电脑上的数据采集卡(RBH8253，瑞博华科技，中国) 来实现；电流密度(IA) 由欧姆定律计算；极化曲线可以采用稳态放电法测定，通过测定MFC在不同外电阻条件下稳定放电时的外电阻电压，通过I=U/R得到电流，进而得到极化曲线，将极化曲线的欧姆极化区数据线性拟合所得到的斜率为表观内阻.其它电化学测定使用电化学工作站(CHI600D，上海辰华) 实现.
微生物群落分析使用变性梯度凝胶电泳(denaturing gradient gel electrophoresis，DGGE) 技术.采用DNA提取试剂盒从生物膜样品中提取细菌基因组DNA，采用通用引物341F (5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′) 和907R (5′-CCG TCA ATT CCT TTG AGT TT-3′) 扩增V3区.扩增步骤为:首先在95℃下变性10 min, 接着循环30周期，该周期包括94℃下变性30 s，57℃下退火1 min，72℃下延伸2 min, 循环结束.最后72℃下延伸7 min.扩增后的样品在DGGE (Bio-Rad, USA) 系统进行分析，采用6%(质量浓度) 的聚丙烯酰胺凝胶，变性梯度为30%~55%.分析结果采用SYBR Green I (Invitrogen, USA) 染色后在成像仪(VILBER INFINITY 3000, France) 上进行成像分析.条带割胶测序扩增后送至美吉生物技术公司进行测序分析.基因序列通过BLAST进行比对分析.
2 结果与讨论 2.1 MFCs系统对2, 4-D的去除及产电性能不同浓度2, 4-D存在时MFC的电压输出如图 1所示.可以发现最高输出电压随2, 4-D的浓度增加而降低.在对照系统(无2, 4-D)，最高电压可达到0.53 V，当2, 4-D浓度分别为30、80、180和300 mg·L-1时，最高电压分别降为0.51、0.47、0.33和0.31 V.输出电压的下降可能是由于2, 4-D的生物毒性抑制了产电微生物活性，另一方面2, 4-D还原过程消耗了一部分电子. Sun等[11]也报道了持久性难降解污染物对能量输出的抑制，发现1 500 mg·L-1的活性艳红X-3B (ABRX3) 可使最高输出电压降低25%.
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图 1 不同浓度2, 4-D存在时MFC的输出电压 Fig. 1 Voltage output from MFCs in the presence of different concentrations of 2, 4-D |
系统稳定后，在MFC运行的一个周期内研究了2, 4-D和COD的去除，如图 2和图 3所示.可以发现，2, 4-D的去除速率随其浓度的增加而增加，而COD去除率随2, 4-D浓度升高而降低，当2, 4-D的浓度分别为30、80、180和300 mg·L-1时，其平均去除速率为0.23、0.51、1.44和2.02 mg·(L·h)-1，对应COD的去除率为96%、95%、78%和68%.当运行时间足够长，2, 4-D可以被完全去除，其氯离子释放率达到96%~100%.
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图 2 不同浓度2, 4-D存在下2, 4-D的去除曲线 Fig. 2 Removal of 2, 4-D at different concentrations |
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图 3 不同浓度2, 4-D存在下COD的去除曲线 Fig. 3 Removal of COD in the presence of different concentration of 2, 4-D |
图 4比较了2, 4-D-乙酸钠混合以及2, 4-D单独作为基质底物时的产电变化.当混合基质含有300 mg·L-1的2, 4-D时，产生最大电压为0.31 V，但是2, 4-D单独存在的情况下没有电压产生，这表明2, 4-D不能被胞外产电菌利用而产电.另一方面，混合基质中乙酸钠促进了2, 4-D的降解，使其平均去除速率从1.46 mg·(L·h)-1(仅2, 4-D) 增加到2.02 mg·(L·h)-1(混合基质).可见，MFC系统中易降解基质乙酸钠的存在可以促进难降解有机物2, 4-D的去除. Luo等[12]研究也发现，MFC系统中易降解有机物葡萄糖存在能提高苯酚和吡啶的去除效率.
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图 4 2, 4-D单基质及与乙酸钠共基质条件下MFCs系统污染物去除和电压输出情况 Fig. 4 Electricity generation and voltage output from MFCs fed with 2, 4-D alone as the fuel or the mixed substrates of 2, 4-D and acetate sodium |
当输出电压稳定后，改变外电阻测得以乙酸钠和2, 4-D混合溶液作为基质的极化曲线和功率输出变化曲线，如图 5所示，并根据内阻和外电阻相等时输出功率最大的原理计算了内阻大小，见表 1.
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图 5 乙酸钠单基质及与2, 4-D共基质条件下MFCs系统极化曲线密度比较 Fig. 5 Comparison of polarization curves produced by MFCs fed with 850 mg·L-1 acetate alone and its mixture with 300 mg·L-1 2, 4-D |
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表 1 不同基质各周期的内阻变化 Table 1 Internal resistance in different cycles with increasing concentration of 2, 4-D |
发现当300 mg·L-1的2, 4-D存在时，与乙酸钠(850 mg·L-1) 单基质相比，最大功率密度从0.151 W·m-2迅速下降到0.057 W·m-2，如表 1所示，内阻相应地从524 Ω增加到1 230 Ω. 2, 4-D的存在使得功率密度急剧下降，内阻急剧增加，这可能是由于2, 4-D的毒害作用影响阳极微生物活性以及吸收部分电子用于2, 4-D的自身还原.有研究采用相似的MFC系统探究难降解有机物吲哚和吡啶对产电影响，发现500 mg·L-1吲哚作碳源可得最大功率密度为1.7 W·m-2[16]，吡啶作碳源能获得的最大功率密度为1.7 W·m-3[17].
2.2 阳极预曝气对2, 4-D强化去除效应本研究结果表明即使经过长时间的适应培养(4个月左右)，2, 4-D仍不能被用于MFC产电，而且其存在还会对产电微生物产生抑制作用.因此，当其存在于阳极室时需要建立一种快速去除2, 4-D的方法.考虑到有机污染物一般可以通过有氧呼吸被快速生物降解，因此在每个周期的前6 h给阳极室曝气，然后再转换为普通的厌氧运行方式.阳极曝气对于2, 4-D的去除和产电的影响如图 6和图 7所示.可以发现即使在曝气阶段，电压也快速升高至0.42~0.47 V.然而，产电周期相比非曝气系统缩短并且也随着运行周期数的增加而降低.可能有以下几方面原因:曝气加速了有机污染物在运行初期的降解，从而导致运行周期缩短；随着运行周期数增加，更多的好氧细菌成为阳极的优势菌群.除了实验开始的周期，从其它几个周期看，6 h的预曝气会加速2, 4-D的降解，特别是第3周期的6 h去除率接近50%，预曝气的效果直接促进了后续运行过程中MFC系统对2, 4-D的降解，使得MFC在大部分2, 4-D被去除之前都能保持较高的输出电压.从阳极传统厌氧运行转为预曝气的第一周期，2, 4-D降解速率并未得到显著提升，可能是因为阳极厌氧细菌在厌氧状态运行长时间后，曝气会抑制其活性.本研究中发现阳极微生物对于氧气存在一定的抵抗力，在已有研究中也有相似结果.有研究表明如果基质足够，在MFC运行期间微量提升溶解氧含量至0.3 mg·L-1并不会影响能量输出[18].一些特殊菌群例如Shewanella oneidensis DSP 10甚至能够在高溶解氧环境(≥8 mg·L-1) 下产电[19].这些数据表明以连续曝气和厌氧模式运行MFC可以强化一些难降解有机物的去除.在MFC中同时存在难降解有机污染物和易降解污染物的情况下，难降解污染物可能会对产电微生物群体产生毒害作用并阻碍电能输出，此时可以通过阳极预曝气方式加快难降解有机物去除，然后再转入厌氧运行产电模式.虽然阳极曝气过程，由于氧气与电子结合会消耗部分电子流，从而降低库仑效率，但阳极室输入的燃料为难降解有机物与易降解有机物混合基质时，快速降低难降解有机物对产电菌的抑制毒性效应，对于后续产电过程更为重要.因此，有必要在此情形下采取阳极预曝气-厌氧运行模式.
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图 6 阳极曝气时的输出电压(多个周期) Fig. 6 Voltage curves of MFC with sequential aeration in anode chamber (multiple cycles) |
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图 7 阳极曝气时2, 4-D的去除曲线 Fig. 7 Removal curves of 2, 4-D with sequential aeration in anode chamber |
分别以乙酸钠或2, 4-D单独作为基质，乙酸钠与2, 4-D混合作基质，考察了MFC系统微生物菌群结构的变化，采用DGGE对其进行了分析，结果如图 8所示. 表 2列出了图 8谱带基因测序后BLAST结果.
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图 8 不同基质条件下阳极附着生物膜的DGGE条带 Fig. 8 DGGE bands for biofilms attached on anode electrode with different substrates |
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表 2 以不同类型基质为碳源时阳极生物膜的微生物组成信息 Table 2 Microbial composition for the anode biofilm enriched with different substrates |
从图 8中可以看出，乙酸钠单独作为基质获得的条代数较多，这些条带对应的细菌主要属于Bacteroides sp. (条带2和3)、Clostridium sp. (条带5)、Delftia sp. (条带6)、Comamonas sp. (条带7)、Diaphorobacter sp. (条带8)、Rhodospirillaceae sp. (条带9)、Sphaerochaeta sp. (条带10) 和Azospirillum sp. (条带11).当MFC中加入2, 4-D之后，一些条带就弱化或者消失了，例如条带1、4、6和8，这表明这些条带所代表的菌株遭受了2, 4-D的毒害作用.而一些新的条带如12、13和14出现，它们分别属于Acidobacteria bacteriumsp.、β-Proteobacterium sp.和Sphingobium sp..单独以2, 4-D为基质运行的MFC，获得的比较明显的条带是2、7、9、10、14和16，它们分别属于Bacteroides sp.、Comamonas sp.、Azospirillum sp.、Sphaerochaeta sp.、Sphingobium sp.和Variovorax sp..在这些菌种中，Sphingobium sp.[20]、Variovorax sp.[21]、Azospirillum sp.[22]、Comamonas sp.[23]均被报道能够降解2, 4-D.例如，Sphingobium sp.被报道含有降解2, 4-D的cadA基因[20].一些Variovorax sp.菌属例如Variovorax paradoxus能够在含有2, 4-D的环境中生长并且能以2, 4-D作为唯一碳源[21]，Comamonas sp.也能够在Fe (Ⅲ) 还原环境中生物降解2, 4-D[23].
Comamonas sp.也是微生物染料电池系统普遍存在的具有产电功能的微生物类群[24]. Comamonas sp.属于Comamonadaceae科，其是兼性厌氧的微生物且广泛存在于缺氧环境.例如，在低溶解氧浓度下(DO=0.1 mg·L-1)Comamonadaceae sp.占食品加工废水处理细菌总数的52.3%，它们由大量的脱氮细菌组成[25].此外，Bacteroides sp.也曾被报道为具有产电特性的铁还原菌[26]，Sphaerochaeta sp.是具有钒(V) 还原能力的产电菌[27].由此可见，当阳极室加入2, 4-D后，阳极生物膜会进一步选择出具有2, 4-D降解特性的微生物与产电微生物共存.
3 结论(1) 向以乙酸钠为基质启动的MFC系统阳极室内加入2, 4-D后，由于2, 4-D对阳极微生物的抑制毒害作用，系统的产电电压及最大功率密度降低，内阻显著增加.
(2) MFC系统不能够以2, 4-D为唯一碳源产电，乙酸钠与2, 4-D共存条件下能够达到同步产电及2, 4-D去除的目的，但2, 4-D去除速率较低.
(3) 通过在阳极室内预曝气方式可以强化2, 4-D的去除，此后转入阳极厌氧运行，仍然可以达到较高的电能回收.
(4) 2, 4-D加入后MFC阳极微生物群落结构发生了变化，选择出了多种2, 4-D降解菌及具有2, 4-D耐受能力的产电菌.
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