2017, Vol. 38
2. 中国科学院重庆绿色智能技术研究院, 环境微生物与生态研究中心, 重庆 400714;
3. 中国科学院重庆绿色智能技术研究院, 水库水环境重点实验室, 重庆 400714
2. Environmental Microbiology and Ecology Research Center, Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology, Chinese Academy of Sciences, Chongqing 400714, China;
3. Key Laboratory of Reservoir Aquatic Environment, Chongqing Institute of Green and Intelligent Technology, Chinese Academy of Sciences, Chongqing 400714, China
近年来，三峡库区由于蓄水支流富营养化呈现逐渐加重的趋势:在2004～2009年间，库区重庆段就发生了80次“水华”，其中主要发生在三峡库区小江支流上[1].库区蓄水导致水位抬升，水面变宽，水深加大，流速变缓，泥沙沉降加剧，蓄水期高锰酸盐指数高于泄水期，氮负荷不断增加[2]，泄水期上覆水水温较蓄水期高，不利于溶解氧(dissolved oxygen,DO)渗透，从而对沉积物有机质累积、 矿化及其理化性质等造成影响[3]，进而造成硝化反硝化底物供给的差异．影响其硝化、 反硝化速率.
库区流域沉积物-水界面发生的硝化与反硝化过程是流域生态系统N迁移转化的主要过程,对水生生态系统物质传递和能量循环起着重要作用[4].硝化是在好氧硝化细菌作用下将NH4+-N转化为NO3-或NO-2的过程[5]，是氮循环的关键限速过程，也是氮循环的中心环节[6].它受到水体温度、 DO以及 NH4+-N含量等因素的影响.Tanaka等[7]研究表明在适宜温度、 充足DO条件下，底泥NH4+含量越高，硝化反应越剧烈.反硝化是指在缺氧或者厌氧条件下反硝化菌将NO3- 还原为N2O或N2的过程，是水生生态系统中主要的脱氮过程[8]，有研究表明输入河口、 海域50%的总氮是由反硝化作用去除[9, 10],沉积物的反硝化过程对上覆水中NO3--N的去除也起着重要作用[11].反硝化受到水体温度、 DO以及NO3--N含量等因素影响，Pattinson等[12]对河流沉积物硝化反硝化研究表明在足够的NO3--N含量下，反硝化速率随温度的增加而增加.
沉积物-水界面硝化与反硝化过程得到越来越多的关注，但是多数研究集中在海岸潮滩口[13]、 湿地[14, 15]以及河流河口[16, 17]等生态系统.而对库区认识主要集中在河体水-汽界面温室气体排放通量[18]、 河岸消落区部分水-气、 土-气N2O通量及反硝化方面[19]，但是对于河底沉积物与水界面通量研究较少.因此研究库区小江支流沉积物的硝化与反硝化过程可以为库区氮素管理提供科学依据，也为库区流域水质安全保障以及水环境修复提供理论基础.本研究以实地采样模拟库区流域沉积物硝化反硝化速率，表征库区沉积物硝化与反硝化过程在库区蓄水期和泄水期的特征.
1 材料与方法 1.1 样品采集本实验选取三峡库区开县段——小江支流南河(JLX)为实验对象，在南河上游(JLX-U)、 南河下游(JLX-D)以及南河与小流域菁林溪交汇处(JLX-A)中游分别各设置3个采样点(图 1)，即JLX-U-1、 JLX-U-2、 JLX-U-3、 JLX-D-1、 JLX-D-2、 JLX-D-3、 JLX-A-1、 JLX-A-2、 JLX-A-3，来代表南河上、 中、 下游.实验于南河泄水期(2015年8月)水深8~9 m、 蓄水期(2015年11月)水深17~19 m用抓斗式采泥器采集表层沉积物，用不锈钢采水器采集沉积物上覆水，4℃避光分别保存在干净的聚乙烯塑料瓶，立即运回实验室用于理化指标分析及培养实验.
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图 1 采样位点示意 Fig. 1 Sketch map showing sampling sites |
本实验采用乙炔抑制法测定沉积物硝化反硝化速率，其原理是>1%浓度的乙炔可以抑制氨单加氧酶(AMO)，即抑制NH4+氧化为NO-2，通过NH4+-N浓度计算硝化速率，并能抑制氧化亚氮还原酶(NOS)的活性使反硝化过程停留在N2O阶段，从而根据N2O浓度估算反硝化速率.乙炔抑制法具有培养时间短、 灵敏度高、 成本低、 重现性好的优点[20]，可批量进行实验，并且在实验过程中对沉积物的扰动较小[21].
每个采样点设计一组乙炔抑制实验组(加入上覆水制成的饱和乙炔水，使上覆水中乙炔体积分数为10%)和一组对照实验组(不加饱和乙炔水).将沉积物转移到直径为5 cm、 高为30 cm的有机玻璃培养管内，并将沉积物高度调整到培养管10 cm位置处，同时在沉积物上面充入上覆水，再用橡胶塞密封防止漏气.在培养实验开始前抽取上覆水保存在棕色试剂瓶中用于测定上覆水中初始N2O，同时加饱和HgCl2，4℃低温保存.无扰动培养4 h后迅速抽取沉积物上方的水样，一份直接注入棕色玻璃瓶中，加饱和HgCl2避光保存，用于测定N2O； 另一份用0.45 μm滤膜进行过滤，注入干净的样品瓶内4℃低温保存，测定其NH4+-N浓度.
1.3 样品分析采用静态顶空-气相色谱法[22]测定水样中N2O浓度，首先用注射器向装有10 mL水样的瓶(25 mL体积)内充入15.0 mL高纯N2(＞99.999%)，使样品瓶内形成顶空，再剧烈振荡样品玻璃瓶5 min，使瓶内气-液两相达到平衡，然后用注射器抽取样品瓶中气体注入气相色谱仪进行测定N2O浓度.所用气相色谱(Agilent 7890A，USA)检测方法为[23]: 柱温60℃，进样口温度为100℃，检测器温度为300℃，载气为高纯N2，流量为40 mL·min-1，检测器基电流为1.0 nA.样品检测前，用进样针抽取1 mL的3种不同浓度的标准气体，得出峰面积与N2O浓度的标准曲线.同时记录实验大气压及温度，通过标准曲线以及待测样品峰面积计算出样品顶空气中N2O 浓度.然后再根据平衡温度、 水样盐度及Weiss等[24]提供的N2O溶解度计算出上覆水样品中溶解的N2O浓度.同时采用流动注射分析仪(FIAstar 5000，Sweden)测定样品瓶中NH4+-N浓度.
1.4 数据计算计算公式如下[25]:
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(1) |
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(2) |
式中，c为水样中N2O浓度(μmol·L-1)； cg为顶空中N2O浓度(μL·L-1)； K0为N2O溶解度 (mol·L-1)； β为样品瓶中气相与液相体积比； A1、 A2、 A3、 B1、 B2、 B3为常数； S为水样盐度； T为水样绝对温度(K).
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(3) |
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(4) |
式中，RD为反硝化速率[μmol·(m2·h)-1]； RN为硝化速率[μmol·(m2·h)-1]； c0为初始水柱中N2O浓度(μmol·L-1)； c1为乙炔抑制柱中N2O浓度(μmol·L-1)； cK为对照柱中NH4+-N浓度(μmol·L-1)； c2为乙炔抑制柱中NH4+-N浓度(μmol·L-1)； H为培养管中水柱的高度(m)； t为培养时间(h)，本实验培养了4 h.
1.5 理化指标分析上覆水运回实验室后用雷磁电导率仪(DDSJ-308A)测其盐度为0.02%，泄水期上覆水温度为: (27.0±1.52)℃，蓄水期上覆水温度为: (17.5±0.87)℃.
用于理化指标分析的沉积物在自然条件下风干，研磨过1 mm筛、 0.25 mm筛，分别保存在自封袋中备用.称取过1 mm筛的土样10 g，加入25 mL水，在磁力搅拌器搅拌2 min，静置30 min，用pH计(FE20K)测其pH值，南河泄水期(蓄水期)pH值为8.22±0.11(8.28±0.19).NH4+-N及NO3--N用2mol·L-1的KCl浸提后通过流动注射分析仪(FIAstar 5000，Sweden)测定其土样中含量.土样TOC、 TN含量采用总有机碳/总氮分析仪(Vario TOC，Germany)测定.
2 结果与分析 2.1 泄水期与蓄水期沉积物理化指标变化本实验数据在分析之前，先对数据进行了正态分布检验(Kolmogorov-Smirnov检验)和方差齐性检验(Levene 检验).符合正态分布且方差齐性的数据直接进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，不符合正态分布的数据需先将数据进行对数转换，再分析.数据符合正态分布但方差不齐时采用Brown-Forsythe和Welch方法进行单因素方差分析.同时采用皮尔逊相关系数(Pearson's correlation coefficient) 两两分析数据之间的相关性.
从表 1可以看出沉积物pH在泄水期与蓄水期水量季节间差异不显著外，其他理化指标均随泄水期与蓄水期水量季节变化存在显著差异.从表 2数据两两之间的相关性表明，沉积物NO3--N、 NH4+-N和TOC均与沉积物pH值、 TN显著正相关(P<0.01，n=18)，沉积物NH4+-N、 TOC均与沉积物NO3--N显著正相关(P<0.01，n=18)，沉积物NH4+-N与TOC显著正相关(P<0.01，n=18).
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表 1 沉积物理化指标ANOVA分析 Table 1 ANOVA analysis on physiochemical parameters of sediments |
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表 2 沉积物理化性质Pearson相关性分析 Table 2 Person correlation on physiochemical parameters of sediments |
南河泄水期和蓄水期沉积物TN、 NO3--N、 NH4+-N及TOC含量变化见图 2.蓄水期的沉积物理化指标含量均显著高于泄水期理化指标含量.TN、 NO3--N、 NH4+-N及TOC含量最高(最低)分别达到(550.13±404.59)(121.73±56.00) mg·kg-1、 (9.20±2.34)(4.23±0.67) mg·kg-1、 (10.50±3.12)(4.70±0.82) mg·kg-1以及(11.64±6.50)(3.87±0.99)g·kg-1，且最高(最低)值出现在南河流域的不同位置.
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图 2 2015年沉积物泄水期(8月)与蓄水期(11月)理化指标含量 Fig. 2 Physiochemical parameters of sediment during 2015 water release and collection events of TGDR |
硝化速率变化见图 3，泄水期和蓄水期硝化速率(平均值)分别为(16.52±20.09)~(48.26±50.87)μmol·(m2·h)-1、 (121.94±82.20)~(194.06±151.90) μmol·(m2·h)-1，最高出现在南河下游(JLX-D)的蓄水期，最高达到(194.06±151.90)μmol·(m2·h)-1； 最低出现在南河与菁林溪流域交汇处(JLX-A)的泄水期，且最低达到了(16.52±20.09) μmol·(m2·h)-1.南河沉积物硝化速率有JLX-D>JLX-U>JLX-A，且蓄水期(11月)硝化速率显著普遍高于泄水期(8月).
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图 3 2015年沉积物泄水期与蓄水期硝化速率 Fig. 3 Nitrification rate of sediment during 2015 water release and collection events of TGDR |
南河沉积物反硝化速率见图 4，综合南河上游、 中游以及下游沉积物反硝化速率有较大差异，泄水期与蓄水期反硝化速率最高值均出现在南河与菁林溪交汇处(JLX-A)，最低值均出现南河下游(JLX-D).且南河反硝化速率存在明显的水量季节变化，泄水期(8月)普遍高于蓄水期(11月).泄水期反硝化速率(平均值)为(92.25±31.48)~(647.20±127.37) μmol·(m2·h)-1，蓄水期反硝化速率(平均值)为(24.04±364.12)~(69.15±527.18) μmol·(m2·h)-1.反硝化速率最高值达到了(647.20±127.37) μmol·(m2·h)-1； 最低值低至(24.04±364.12) μmol·(m2·h)-1.
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图 4 2015年沉积物泄水期与蓄水期反硝化速率 Fig. 4 Denitrification rate of sediment during 2015 water release and collection events of TGDR |
见表 3硝化、 反硝化速率与沉积物Pearson相关性分析可知，无论是在泄水期还是蓄水期沉积物理化指标与硝化、 反硝化速率存在显著相关性.硝化速率与TN、 NH4+-N、NO3--N及 TOC存在显著正相关关系； 而反硝化速率与TN、 NO3--N、 NH4+-N存在显著负相关关系.
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表 3 沉积物理化性质与硝化、 反硝化速率Pearson相关性分析 Table 3 Person correlation on physiochemical parameters,nitrification rate,and denitrification rate of sediments |
3 讨论 3.1 水量季节性理化指标变化
通过监测泄水期(8月)与蓄水期(11月)沉积物理化指标发现，TN、 NO3--N、 NH4+-N、 TOC随水量季节的变化而变化，泄水期沉积物理化指标含量均低于蓄水期.导致这一现象的原因可能是: ①蓄水期有外源入库，张晟等[26]和郭劲松等[27]对三峡库区小江支流水质状况研究得出不同营养盐季节变化表现为蓄水期＞泄水期，蓄水期属于中-富营养类型，处于中污染状态，蓄水期水体营养盐含量增加与沉积物物质交换亦增加，从而沉积物理化指标蓄水期含量高.同时蓄水期南河周围大面积土地被淹没，带入大量污染物质，水体自净能力下降，水质中污染物积累得不到排泄，不断下沉汇入沉积物[28]； ②蓄水期间水位抬升，水深增加，水流变缓，同时带入大量的泥沙进入水体，泥沙不断沉积，水体中泥沙吸附的有机污染物质也随着泥沙沉降进入底泥； ③沉积物样品本身性质，蓄水期悬浮物及高锰酸盐指数高于泄水期[29]，沉积物以污泥为主，泄水期沉积物主要以沙含量居多，则生物量蓄水期明显高于泄水期，TOC含量蓄水期显著高于泄水期； ④硝化反应过程是整个氮循环过程的限速步骤，而蓄水期硝化速率经实验测定远比泄水期快，则沉积物表面与上覆水之间物质的迁移转化在蓄水期加剧，最终导致蓄水期与泄水期沉积物理化指标存在显著差异.
3.2 水量季节性硝化速率变化蓄水期(11月)硝化速率普遍显著高于泄水期(8月).这主要是由于库区泄水期(8月)在夏季，夏季上覆水温度(27.0±1.52)℃较高不利于O2渗透，导致水中DO含量较低，黄祺等[30]对南河小江支流监测得出DO(2.52~9.38 mg·L-1)泄水期＜蓄水期也证明这一点.同时泄水期在高水温、 低DO含量且水深＞8m的情况下导致上覆水水体出现层化现象[31]，从而消耗的DO无法及时补充，沉积物处于缺氧状态，而硝化反应是一个需氧过程.硝化速率也受沉积物中NH4+含量的影响[32]，从泄水期到蓄水期上覆水NH4+-N 含量(0.05~0.66 mg·L-1)[30]、 沉积物中NH4+-N 含量(4.70~11.50mg·kg-1)日益充足，上覆水温度的降低，DO含量的增加等各种适宜硝化反应的条件在蓄水期形成，最终蓄水期硝化速率显著高于泄水期.
3.3 水量季节性反硝化速率变化泄水期(8月)反硝化速率普遍显著高于蓄水期(11月)，主要是由于反硝化过程是在缺氧或者厌氧条件下将NO3-还原为N2O和N2的过程.上覆水中DO的水量季节性变化与水温的变化呈显著负相关[33]，而随着泄水期到蓄水期温度的降低，DO含量逐渐增加，沉积物氧化层深度加大，从最初的缺氧环境逐步向富氧环境转化[34]，泄水期到蓄水期反硝化速率势必削弱.同时大量研究表明[35, 36]，反硝化速率与温度成正比关系，温度高的地方，反硝化速率也高，随着温度的降低，反硝化速率也明显减小，而泄水期上覆水温度明显高于蓄水期.反硝化反应还需要NO3--N，覃超梅等[37]和Luo等[38]研究珠江口淇澳岛海岸带反硝化作用发现反硝化作用实际是受到NO3--N利用率高低的限制，而不是NO3--N的绝对浓度，NO3-的利用率高，反硝化速率也高.同时上覆水中高NO3--N含量和高DO浓度的体系会抑制沉积物中反硝化[39, 40]，过高的有机碳含量促进NO3-异化还原为NH4+与反硝化作用竞争NO3-[41]，而蓄水期上覆水[35]和沉积物NO3--N、 DO以及有机质含量显著高于泄水期，最终在一系列因素共同作用下导致泄水期反硝化速率显著高于蓄水期.
3.4 沉积物理化性质与硝化及反硝化速率的关系在蓄水期与泄水期，沉积物理化性质均与硝化及反硝化速率存在相关性，这表明沉积物理化性质直接影响硝化及反硝化速率.本实验结果表明沉积物理化性质与硝化速率正相关，而与反硝化速率负相关.这一研究结果与其他学者研究结果有共同之处，也有不同之处.如郭永坚等[42]研究草鱼不同混养模式下底泥硝化、 反硝化速率得出，硝化速率与NH4+-N浓度显著正相关，反硝化速率与水体TN显著正相关.Herbert[43]研究认为在一定温度范围内NO3-浓度是决定氨化作用为主还是反硝化作用为主的关键因素，其浓度高时以反硝化为主，浓度低时以氨化为主.这与实验泄水期NO3--N含量低，反硝化速率远大于硝化速率结果恰好相反，出现这种现象的原因可能是由于耦合硝化和反硝化过程.耦合硝化-反硝化受沉积物中生物量影响十分明显，生物量越丰富耦合硝化-反硝化反应越明显[44, 45]，而蓄水期沉积物主要以污泥为主，泄水期沉积物主要以泥沙为主，且从样品中测得的TOC含量(蓄水期: 9.61~11.65 g·kg-1＞泄水期: 3.87~5.26 g·kg-1)可以看出蓄水期沉积物生物量明显大于泄水期，则耦合硝化-反硝化存在的可能性就比较大.Law等[46]研究表明过高的有机碳含量则会降低耦合硝化-反硝化作用.要具体证明耦合硝化-反硝化反应程度还需后续实验，实验结果与其他学者矛盾之处除了耦合硝化-反硝化这一重要原因，造成这一结果的其他因素还需进一步实验才能予以说明.
综上本实验与其他学者有相似研究结果如: Kim等[31]对日本广岛湾研究显示，夏季(8月)硝化速率出现最低值，反硝化速率出现最高值.但环境因子(温度、 DO、 NO3--N、 NH4+-N、 TOC等)对沉积物硝化、 反硝化作用的影响，并不是单一的对硝化、 反硝化作用，而是通过复杂的反应机制影响其反应进程[47, 48]，本实验并未对环境因子影响泄水期与蓄水期硝化和反硝化反应机制进行实验研究，应在后续实验中加强对环境因子影响其机制研究，弄清环境因子如何影响泄水期与蓄水期硝化、 反硝化的机制，以及环境因子对其影响程度.
4 结论(1) 三峡库区南河小江支流沉积物理化指标存在明显的蓄水期和泄水期差异: 蓄水期外源汇入对其理化性质有一定影响，除pH外其余理化指标呈现蓄水期显著高于泄水期的特征，沉积物理化指标相关性显著.
(2) 三峡库区南河小江支流沉积物硝化速率存在明显的蓄水期和泄水期特征，最高值出现在蓄水期(11月)，最低值出现在泄水期(8月).硝化速率与沉积物性质(TN、 NO3--N、 NH4+-N及TOC)呈现显著正相关关系.
(3) 三峡库区南河小江支流沉积物反硝化速率存在明显的蓄水期和泄水期特征，最高值出现在泄水期(8月)，最低值出现在蓄水期(11月)，外源影响下导致沉积物反硝化速率与沉积物理化性质(TN、 NO3--N及NH4+-N)呈现显著负相关关系.
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