2017, Vol. 38
挥发性有机污染物(volatile organic compounds，VOCs)是指熔点低于室温，沸点50~260℃的有机化合物，包括芳香烃、有机硫化物、卤代烃、醛、醇、酯、醚等物质，逸散到大气中，会引发光化学烟雾、灰霾等环境问题，严重危害人体健康[1~4].氯苯(chlorobenzene，CB)是一种典型的VOC，它作为重要的有机溶剂和化工生产的中间体，被广泛应用于塑料、染料、医药、农药等行业中.由于氯苯易挥发、生物毒性大并且对人体有三致作用，已被美国环保署(EPA)列入优先控制污染物名单中[5]，因此探索有效的氯苯处理技术具有重要意义.
常用的氯苯处理方法主要有：光化学氧化法[6]、吸附法[7]、催化氧化法[8]和生物法[9]等.其中，生物法因具备反应条件温和、运行费用低、二次污染小等优点而备受关注.许多国内外学者在获得和选育氯苯高效降解菌方面做了大量研究工作，已报道的菌株主要包括假单胞菌(Pseudomonas sp.)[10]、动性球菌(Planococcus sp.)[11]、考克氏菌(Kocuria sp.)[12]、红球菌(Rhodococcus sp.)[13]、不动杆菌(Acinetobacter sp.)[14]和罗尔斯顿菌(Ralstonia sp.)[9]等.然而，由于氯苯生物毒性较大，上述微生物降解活性偏低，世代时间较长.本研究从前期处理氯苯的生物滴滤塔中分离出1株能以氯苯为唯一碳源和能源生长的菌株，并且对其降解特性、动力学和中间产物进行了分析，以期为进一步利用该菌处理含氯苯废气奠定基础.
1 材料与方法 1.1 培养基无机盐培养基：CaCl2，0.023 g·L-1；MgSO4·7H2O，0.2 g·L-1；(NH4)2SO4，2.5 g·L-1；KH2PO4，1.0 g·L-1；Na2HPO4·12H2O，4.5 g·L-1；微量元素母液[15] 1 mL·L-1；溶剂为水，pH 7.0~7.5.
R2A培养基：酵母粉，0.50 g·L-1；胰蛋白胨，0.50 g·L-1；干酪素，0.50 g·L-1；葡萄糖，0.50 g·L-1；可溶性淀粉，0.50 g·L-1；丙酮酸钠，0.30 g·L-1；KH2PO4，0.45 g·L-1；MgSO4，0.05 g·L-1；琼脂，15~18 g·L-1；溶剂为水，pH 7.2.
1.2 氯苯降解菌的分离纯化从实验室前期处理氯苯的生物滴滤塔中取生物膜样品，将其转入以氯苯为唯一碳源的无机盐筛选培养基中(氯苯浓度为100 mg·L-1)，于30℃、160 r·min-1摇床中培养.在同样条件下，每2 d转接1次.经过多次传代富集后的菌液，在R2A固体培养基上稀释涂布，于30℃恒温培养箱中培养2~3 d，依据菌体群落的差异性，挑取平板上长出的单菌落接种至无机盐筛选培养基中，考察降解效果，选择具有氯苯降解能力的菌株进一步分离纯化，最终获得1株具有高效氯苯降解活性的菌株LW26.
1.3 菌株鉴定形态学观察：将菌株接种于R2A固体培养基，培养两天后观察菌落形态.挑取单菌落，加入无菌水制成菌悬液，利用透射电镜观察其细菌形态及大小.
生理生化试验：测定方法见文献[16].
菌株16S rDNA的扩增和鉴定：利用DNA提取试剂盒(上海申能博彩生物科技有限公司，中国)提取总DNA作为PCR模板，选用细菌通用引物F8和R1541进行PCR扩增.PCR程序为：94℃预变性4 min，35个循环(94℃变性60 s、59℃退火60 s、72℃延伸90 s)，72℃延伸10 min，4℃保温10 min.扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶检验后交由生工生物工程(上海)有限公司测序.利用BLAST将测序结果与GenBank中的基因序列进行同源性比对.
Biolog细菌鉴定：利用Biolog细菌鉴定系统(Biolog Hayward，美国) GenⅢ微板进行鉴定，具体方法见文献[17].
1.4 菌株对多种碳源的降解能力在50 mL已灭菌的无机盐培养基中加入培养至对数生长期的菌悬液(使初始D600达到0.01)，并分别加入甲酸、乙酸、丙酸、二氯甲烷、二氯乙烷、四氯化碳、正己烷、环己烷、苯、甲苯、乙苯、二甲苯、苯酚、邻苯二酚等工业中常见的有机污染物作为唯一碳源，初始浓度均为100 mg·L-1，同时以不加菌悬液作为空白对照，密封后置于160 r·min-1、30℃的摇床中培养，定时取样，检测底物浓度和菌体浓度.所有实验均设置3个平行样.
1.5 菌株降解氯苯特性及其动力学实验考察了温度(20、25、30、35、40℃)，pH (4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0)，氯苯初始浓度(100、200、300、400、500 mg·L-1)以及Cl-浓度(0、0.068、0.14、0.28、0.55、1.10 mol·L-1)对菌株生长及其降解氯苯性能的影响.在50 mL已灭菌的无机盐培养基中加入氯苯作为唯一碳源，并加入培养至对数生长期的菌悬液(使初始D600达到0.01)，同时以不加菌悬液的体系作为空白对照，密封后置于相应条件下恒温培养24 h.其中，分析温度、pH和Cl-浓度影响时，氯苯初始浓度设为100 mg·L-1；分析温度、氯苯初始浓度和Cl-浓度影响时，体系初始pH为7.实验过程中定时取样，测定氯苯浓度和菌体浓度.
动力学实验中，在50 mL已灭菌的无机盐培养基中加入一定量的氯苯，配置不同氯苯浓度梯度的反应体系，并加入培养至对数期的菌悬液(使初始D600达到0.03)，密封后于摇床中恒温培养(160 r·min-1、30℃)，定时取样，测定氯苯浓度和菌体浓度.
上述实验均设置3个平行样.
1.6 分析方法氯苯浓度的测定：采用Agilent 6890气相色谱仪(Agilent，美国)定量分析气相中氯苯浓度.色谱柱为HP-Innowax型毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.5 μm).气相色谱条件：进样口温度200℃，柱温100℃，检测器温度(FID)180℃，柱流量为1 mL·min-1，分流比30 :1.
菌体浓度的测定：采用Hitachi U-2910型紫外/可见分光光度计(Hitachi High Technologies，日本)在600 nm波长下测定菌体的吸光度(D600)，根据吸光度与生物量干重间的标准曲线计算出菌体细胞干重.
中间产物分析：采用Agilent 6890-5973气相色谱-质谱仪(Agilent，美国)对代谢产物进行分析.色谱柱为HP-5MS (30 mm×0.25 mm×0.25 μm).程序升温：100℃保留1 min，5℃·min-1升高到280℃并保留10 min.质谱条件：EI源，电离能量70 eV，离子源250℃，辅助温度280℃，倍增电压1 000 V，扫描质量数50~650 u.采用DIONEX2000离子色谱仪(DIONEX，美国)分析小分子酸及氯离子.色谱柱为Ionpac AS19-HC型分离柱，淋洗液为KOH (浓度梯度为10~40 mmol·L-1)，电导检测器30℃.流速1.00 mL·min-1，进样量25 μL.
2 结果与讨论 2.1 氯苯降解菌株的筛选与鉴定经多次分离纯化，筛选出1株能以氯苯为唯一碳源和能源生长的菌株，并将其命名为LW26.该菌株在R2A固体平板上30℃培养72 h后，菌落呈圆形，乳白色，有凸起，边缘平整，形态饱满，光滑湿润.用透射电镜观察(图 1)，细胞呈短杆状，大小为(0.6~0.8)μm×(1.0~1.5)μm，无芽孢.菌株LW26的生理生化特征为：接触酶反应为阳性，V-P反应、甲基红反应、硝酸盐还原反应、吲哚试验、柠檬酸盐利用试验均为阴性，革兰氏染色显阴性.
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图 1 菌株LW26透射电镜照片 Fig. 1 Transmission electron microscope image of strain LW26 |
对菌株的DNA进行扩增并测序，获得1 442 bp的16S rRNA基因序列(GenBank登录号：KP966097).利用BLAST将所得结果同GenBank中的基因序列进行同源性比对，发现它与Delftia tsuruhatensisDYJL11(GenBank登录号：HQ317154)的基因序列相似度达99%，推测LW26可能是Delftia属.为进一步确定LW26的种属，本研究利用Biolog细菌鉴定系统对LW26进行鉴定，测试结果显示菌株LW26与标准菌株Delftia tsuruhatensis的相似度(最大相似度为1.000)达到0.779，一般相似率大于0.5可认为两菌株匹配度较高.因此，结合菌株形态观察、生理生化试验以及 16S rRNA 序列分析结果，可以确定筛选获得的高效氯苯降解菌LW26为Delftia tsuruhatensis.查阅相关研究，尚未发现有利用菌株Delftia tsuruhatensis降解氯苯的报道.目前已将该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为M2015113.
2.2 菌株LW26底物广谱性分析实际工业过程产生的三废常常同时含有多种污染物，而生物降解对底物具有较强的专一性，因此考察菌株LW26对一些常见污染物的降解能力显得格外重要.菌株LW26对小分子有机酸、苯系物(BTEX)、卤代烃及其他碳氢化合物的直接代谢情况见表 1.
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表 1 菌株LW26的底物广谱性1) Table 1 Diversity of degradable substrates by strain LW26 |
由表 1可知，菌株LW26不仅能降解甲酸、乙酸等小分子有机酸，而且能不同程度地代谢苯酚、邻苯二酚以及BTEX、正己烷、环己烷等碳氢化合物，具有良好的底物广谱性.微生物对有机污染物的降解能力通常取决于有机物污染物的分子结构及其失电子或得电子的能力[18].由于BTEX、苯酚和邻苯二酚都含有苯环，与氯苯结构类似，菌株LW26含有降解此类物质的相关酶系，因而它能不同程度地降解这些物质.虽然正己烷和环己烷与氯苯的结构迥异，但是它们结构较为简单，菌株同样能够以它们为唯一碳源生长.针对二氯甲烷、四氯化碳等卤代烃，菌株LW26无法直接利用，可能与这类物质的空间位阻有关，对称的结构、氯代程度的提高使得这些物质不易被生物降解.
2.3 环境因素对菌株LW26降解氯苯的影响微生物的生长对环境条件的变化较为敏感，因此研究了温度和pH对菌株LW26生长及降解氯苯性能的影响.在温度20~40℃的范围内，随着温度的增加，菌体生长和降解氯苯的速率先增大后减小.其中，菌株LW26降解氯苯的最适温度为25~30℃，培养24 h后氯苯去除率均达到99%以上，菌体生长量则在温度为25℃时达到最大.考察了pH的影响，发现菌株LW26在pH值为4和10的条件氯苯去除率均小于30%；pH值为7时，其生长和降解速率最快，培养24 h后氯苯去除率高达99.7%.上述实验现象可能是因为微生物体内的酶主导了氯苯的降解以及自身的新陈代谢.低温或者高温、过酸或者过碱的体系都可能会使酶失活甚至变性，进而影响对氯苯的处理效果[19].
本实验还考察了不同氯苯初始浓度的影响.结果表明，当氯苯初始浓度小于200 mg·L-1时，无明显迟缓期，菌株LW26能在24 h内将氯苯完全降解.随着氯苯浓度的不断增加，迟缓期也随之变长，氯苯降解速率变慢.这可能是由于高浓度氯苯对菌株LW26有毒害作用，抑制了菌体的生长.该菌株对氯苯的耐受浓度可达500 mg·L-1.李明堂等[14]筛选出1株可以氯苯为唯一碳源生长的乙酸钙不动杆菌A.calcoaceticus CB001，菌株CB001培养24 h后对50 mg·L-1的氯苯的去除率不到20%.可见，本研究筛选出的菌株LW26对氯苯的处理效果远优于上述报道.
微生物降解氯苯的过程中伴随脱氯作用，培养基中大量积累Cl-和H+，进而降低微生物对氯苯的降解活性[20, 21].在实际应用中，常用NaOH稀溶液调节pH，为微生物提供一个相对稳定的生长环境[22].然而，因此产生的NaCl却会在培养基中不断积累，抑制微生物生长.为研究Cl-浓度对菌株LW26降解氯苯的影响，在无机盐培养基中加入不同浓度NaCl，考察氯苯浓度及菌体浓度的变化情况，结果如图 2所示.当Cl-浓度低于0.14 mol·L-1时，Cl-对菌株LW26的生长几乎没有影响，但随着Cl-浓度进一步增加，氯苯降解速率明显下降.当Cl-浓度增加到1.10 mol·L-1时，培养16 h后氯苯的去除率仅为8.2%.因此，为保证菌体生长不受抑制，应将Cl-浓度控制在0~0.14 mol·L-1的范围内.在利用菌株LW26构建生物反应器处理氯苯的工程实践中，可根据Cl-的浓度，指导培养基的更换，避免因代谢产物积累导致处理效果变差.
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图 2 Cl-浓度对菌体生长和氯苯降解的影响 Fig. 2 Effects of Cl- concentration on cell growth and CB degradation |
对于细胞反应来说，高浓度底物可能会对菌体产生毒害作用，抑制菌体生长.这些抑制作用或改变了微生物体内酶的活性，或影响酶的合成，或使细胞中酶的聚集体发生解离等[23].因此本研究考察了不同氯苯初始浓度对菌株LW26比生长速率和比降解速率的影响.由图 3可知当氯苯浓度较低时，LW26的比生长速率随着氯苯浓度的增加而增加；当氯苯浓度超过一定值后，菌体生长代谢受到抑制，比生长速率也随之减小，这表明LW26降解氯苯的过程符合非竞争性底物抑制模型所描述的规律.因此，采用底物抑制Haldane模型[24, 25]对实验数据进行拟合，其表达式为：
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(1) |
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图 3 菌株LW26降解氯苯的比生长速率和比降解速率 Fig. 3 Specific growth rate and specific degradation rate of strain LW26 for chlorobenzene degradation |
式中，μ为比生长速率，h-1；X为细胞浓度，mg·L-1；t培养时间，h；μmax为最大比生长速率，h-1；S为底物浓度，mg·L-1；KS为半饱和系数，mg·L-1；KI为抑制系数，mg·L-1.
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(2) |
式中，γ为比降解速率，h-1；γmax为最大比降解速率，h-1.
菌株LW26降解氯苯的动力学拟合结果如图 3所示，模型相关系数R2均在0.9以上，拟合曲线与实验数据相关性良好.最大比生长速率为0.42 h-1，最大比降解速率为2.53 h-1，半饱和系数KS为25.46 mg·L-1，抑制系数KI为227.02 mg·L-1.文献[9]报道的氯苯降解菌Ralstonia pickettii L2最大比生长速率为0.26 h-1，明显低于LW26的最大比生长速率，说明LW26对氯苯具有较高的降解能力.
单位基质生成细胞的量称为细胞得率，是对碳源等物质生成细胞的潜力进行定量评价的重要参数，其定义式为：
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(3) |
式中，X为菌浓度，mg·L-1；X0为初始菌浓度，mg·L-1；YX/S为产率系数，mg·mg-1；S0为初始底物浓度，mg·L-1；S为底物浓度，mg·L-1.图 4反映了氯苯浓度和菌体生长量之间的关系，根据公式(3)线性回归，求得LW26对氯苯的细胞得率为0.163 mg·mg-1，R2为0.995.
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图 4 菌株降解氯苯的细胞产率系数 Fig. 4 Cell yield coefficient of strain LW26 for chlorobenzene degradation |
静息细胞法是利用微生物在只含有底物的缓冲溶液或者去离子水中进行生化反应，通过控制培养基成分，使某些产物得到大量积累，有利于代谢产物的分析[26].本实验利用静息细胞降解氯苯，采用GC-MS、IC等分析方法对菌株代谢过程的中间产物进行定性分析，并结合酶活特性，推测可能的氯苯生物降解途径.实验中检测到的中间产物见表 2.菌株LW26在降解氯苯的过程中，会产生邻氯苯酚，己酸、2-羟基丙酸等结构相对简单的有机物以及氯离子.一般地，在好氧生物降解单取代基苯的衍生物的过程中，氧原子会首先攻击苯环中的C C双键，形成相应的邻二苯酚的衍生物，进而在邻苯二酚双加氧酶的作用下邻位开环或者间位开环[21, 27].由于GC-MS未能检测到关键的开环产物，为了推测氯苯降解过程中的开环途径，利用提取的粗酶液进行了邻苯二酚双加氧酶酶活测定.邻苯二酚1, 2-双加氧酶和邻苯二酚2, 3-双加氧酶的酶活分别以反应产物cis, cis-粘康酸和2-羟基粘康酸半醛在260 nm处和375 nm处吸光度来表示[28].结果表明，邻苯二酚1, 2-双加氧酶的酶活为(0.29±0.020) U·mg-1，但没有检测到邻苯二酚2, 3-双加氧酶的活性，证明了苯环是通过邻位开环的方式裂解.
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表 2 中间产物及分析方法 Table 2 Metabolic intermediates and analytic methods |
基于检测到的中间产物及酶活分析，并且结合相关报道[9, 21, 27]，推测菌株LW26降解氯苯可能的途径如图 5所示.氯苯的苯环先被激活，生成邻氯苯酚，继而转化为氧化开环的中间体3-氯邻苯二酚，再在邻苯二酚1, 2-双加氧酶的作用下邻位开环生成2-氯-粘康酸.开环产物脱氯后，被逐步降解成己酸、2-羟基丙酸等结构较为简单的有机物，最终矿化为CO2或转化为生物质.
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图 5 菌株LW26降解氯苯的可能代谢途径 Fig. 5 Proposed pathway for degradation of CB by strain LW26 |
(1)筛选到1株能高效降解氯苯的菌株LW26，经鉴定为Delftia tsuruhatensis.该菌株对于BETX、正己烷和环己烷等常见的有机污染物均能利用，具有良好的底物广谱性.
(2)菌株LW26较为适宜的生长和降解条件为：温度25℃、pH 7.0、Cl-浓度0~0.14 mol·L-1.LW26能降解初始浓度为0~500 mg·L-1的氯苯，降解过程符合Haldane模型，最大比生长速率和最大比降解速率分别为0.42 h-1和2.53 h-1，细胞产率系数为0.163 mg·mg-1.
(3)菌株LW26降解氯苯时首先将其转化为邻氯苯酚，邻苯二酚1, 2双加氧酶是关键开环酶，中间经历邻位开环、脱氯、氧化等过程，最终将其矿化为CO2或转化为生物质.
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