环境科学  2017, Vol. 38 Issue (2): 752-759   PDF    
引用本文
贺龙, 李艳琴, 李彬春, 李君剑. 矿区不同植被复垦模式对土壤细菌群落结构的影响[J]. 环境科学, 2017, 38(2): 752-759.
HE Long, LI Yan-qin, LI Bin-chun, LI Jun-jian. Effects of Different Vegetation Types and Reclamation Years on Soil Bacterial Community Structure in Reclaimed Mine Areas[J]. Environmental Science, 2017, 38(2): 752-759.
矿区不同植被复垦模式对土壤细菌群落结构的影响
贺龙1 , 李艳琴1 , 李彬春1 , 李君剑2     
1. 山西大学生物技术研究所, 化学生物学与分子工程教育部重点实验室, 太原 030006;
2. 山西大学黄土高原研究所, 太原 030006
收稿日期: 2016-07-28; 修订日期: 2016-09-08
基金项目: 国家自然科学基金项目（41271530，31400684）；山西省基础研究项目（2014021030-3）；山西大学引进人才建设项目（206533801001）
作者简介: 贺龙(1990~), 男, 硕士研究生, 主要研究方向为微生物生态, E-mail:610166918@qq.com
通讯联系人, 李艳琴, E-mail:yanqin@sxu.edu.cn
摘要: 以安太堡露天煤矿复垦区为研究对象，用PCR-DGGE技术分析不同复垦植被（榆树、落叶松、杏树、云杉和刺槐）及复垦年限（15年和20年）对土壤细菌的影响.土壤细菌多样性分析结果表明：复垦20年组，榆树最高，杏树最低，其余3个植被无显著差异；复垦15年组，云杉显著高于刺槐；刺槐随复垦年限延长，其土壤细菌多样性显著增高，而云杉却反之.相似性系数分析、聚类分析和PCA均显示，相同复垦年限的土样细菌群落结构相似性高.相关性分析表明细菌多样性指数和土壤pH显著正相关.优势和差异条带测序鉴定出Nitrospira、Sphingomonas、Arthrobacter、Brachybacterium、Rhizobium以及Mesorhizobium等或参与氮循环、或降解多环芳烃及杂环有机物的细菌属.本研究说明榆树和云杉有利于土壤细菌多样性的恢复；复垦区土壤的优势菌群多为有利于污染土壤的生态修复和肥力恢复的功能细菌属.
关键词: PCR-DGGE      复垦矿区      植被复垦模式      细菌群落结构和多样性      功能细菌     
Effects of Different Vegetation Types and Reclamation Years on Soil Bacterial Community Structure in Reclaimed Mine Areas
HE Long1 , LI Yan-qin1 , LI Bin-chun1 , LI Jun-jian2     
1. Key Laboratory of Chemical Biology and Molecular Engineering of Ministry of Education, Institute of Biotechnology, Shanxi University, Taiyuan 030006, China;
2. Institute of Loess Plateau, Shanxi University, Taiyuan 030006, China
Abstract: Effects of different vegetation types (Ulmus pumila, Larix gmelinii, Armeniaca vulgaris, Picea asperata and Robinia pseudoacacia) and reclamation years (15 and 20 years) on soil bacterial community structure in reclaimed Antaibao opencast mine areas were investigated using polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis (PCR-DGGE) and clone sequencing. For 20-year reclaimed soils, the significantly highest and lowest bacterial diversity were found in U. pumila and A. vulgaris stand, respectively, whereas no significant differences were found between the other three vegetation types. Under 15-year plantations, soil bacterial diversity index of P. asperata was significantly higher than that of R. pseudoacacia. Soil bacterial diversity index significantly increased in R. pseudoacacia planted soils but decreased in P. asperata treatment with the increase of reclaimed years. No significant change of soil bacterial community structure was observed in the same reclamation years based on the similarity coefficient analysis, cluster analysis and principal component analysis (PCA). Pearson correlation analysis demonstrated that bacterial diversity index was significantly positively correlated with soil pH. Nitrospira, Sphingomonas, Arthrobacter, Brachybacterium, Rhizobium as well as Mesorhizobium, which play important roles in the nitrogen cycle, degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons and other organic matter, were identified by clone sequencing of the DGGE bands. Our results indicated that U. pumila and P. asperata were conducive to the recovery of soil bacterial diversity. The most dominant bacterial community from reclaimed mine soil would be beneficial for restoring wasteland contaminated soil and improving soil fertility.
Key words: PCR-DGGE      reclaimed mine areas      vegetation reclamation pattern      bacterial community structure and diversity      functional bacteria     

土壤微生物是土壤肥力发展的主导因素，可以合成、分解代谢有机质，参与碳、氮、磷、钾等元素循环转化，是污染物降解的“清洁工”[1].植物分布决定微生物的分布格局和种群结构，微生物群落组成对地上植物群落的发展、丰度和生物多样性也有一定的影响.露天煤矿开采过程中直接挖掘表土、土石堆积而导致矿区植物覆盖被损毁、地形和地质结构改变、地表和地下水文特征破坏[2].并将适宜耕种的肥沃土地变为不毛之地，造成严重的环境污染和生态破坏，导致生物多样性、生态景观、经济财富锐减[3, 4].矿区生态修复已成为维持人类生存环境稳定、煤炭工业可持续发展的必要措施.王翔等[5]研究发现人工植被恢复显著改善了土壤质量，植被种植时间是影响复垦效果的重要因子，植被恢复时间越长(约18年)，土壤质量改善效果越明显.刘卫华等[6]研究发现刺槐+油松混交林复垦17年后，土壤有机质、全氮、速效钾含量均接近或超过原地貌水平. Zhao等[7]研究了不同植被种类和复垦年限对土壤恢复的情况，涉及土壤理化特征和细菌、真菌、放线菌的平板计数，发现种植灌木、沙棘的样本可以提高微生物群落和总微生物量.李君剑等[8]研究发现不同植被方式对参与氮代谢的3类菌群(固氮菌、硝化细菌和反硝化细菌)均有显著影响.目前对矿区研究主要集中在植被恢复、土壤改良涉及土壤理化性质、土壤养分、酶活性和土壤呼吸等方面，而对生态修复更为重要和敏感的土壤微生物的研究多集中在可培养微生物数量等方面，应用分子生物学方法的相关研究鲜见报道，其中对功能细菌的挖掘尤其少.

因此，本研究以安太堡露天矿区为对象，用聚合酶链式反应结合变性梯度凝胶电泳(polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis, PCR-DGGE)指纹图谱技术分析不同复垦植被及年限对土壤细菌群落结构和多样性的影响，以便比较矿区再利用方式的效果，同时基于测序技术，挖掘一批能在营养贫瘠的环境下生长繁殖，参与碳、氮等元素循环，有效降解污染物等的功能细菌，以期为矿区生态修复，复垦植被筛选，提高复垦土壤肥力尤其是生物学指标等方面提供科学依据.

1 材料与方法 1.1 研究区概况

矿区地处黄土高原东部晋陕蒙接壤的三角地带，山西省北部朔州市境内，地理坐标：39°23′N~39°37′N，112°11′E~113°30′E[5].属于温带半干旱大陆性季风气候，年平均降水量约450 mm，降水主要集中在7~9月，年均蒸发量约2 160 mm；年均温度6.2℃，无霜期为115~130 d；年均风速为2.3~4.7 m·s-1，最大风速可达20 m·s-1[8].

本研究包括7块复垦样地，其中有5种复垦植被类型、2种复垦年限，以乔灌木为主，具体情况和基本理化特征见表 1.

表 1 各样地的植被复垦模式和理化特征1) Table 1 Restoration vegetation pattern and physiochemical characteristics of sample plots

1.2 土样采集

每个样地包括3个重复小区(5 m×5 m)，小区采样方式为多点混合土样处理法，去除地表植被和覆盖物，6个样点随机土钻取样(0~10 cm)并混匀，过2 mm的筛备用[6].一部分自然风干，以测定土壤理化特征；另一部分保存于4℃用于提取土样总DNA.采样时间为2014年9月14日.

1.3 土样总DNA的提取及纯化

提取方法在参照文献[9]的基础上，增加了2次酚-氯仿-异戊醇抽提和1次氯仿-异戊醇抽提，沉淀DNA时，PEG-8000终浓度改为10%，NaCl终浓度改为0.8~1 mol·L-1.纯化DNA粗品采用PVPP柱层析法[10].

1.4 PCR扩增

扩增细菌16S rRNA V3可变区片段，由2次PCR扩增组成.先以总DNA为模板，V3区通用引物(338 f和518 r)[11]进行Touchdown-PCR[12].再以Touchdown-PCR产物为模板，用带GC夹引物(338 f-GC和518 r)，进行Reconditioning-PCR[13]扩增.

1.5 DGGE及条带的回收、克隆测序

采用Bio-Rad电泳系统.变性梯度为40%~60%的8%聚丙烯酰胺凝胶，PCR产物上样量为7 μL[14].在1×TAE缓冲液中，60℃恒温、70 V先预电泳30 min，上样后再正式电泳14 h.胶用银染，图谱成像，切胶回收优势、差异条带，并克隆测序鉴定.

1.6 数据处理

DGGE图谱采用Quantity One软件分析处理，导出相似性系数和聚类分析结果，数字化结果用于多样性分析、主成分分析(principal component analysis, PCA)和冗余分析(redundancy analysis, RDA).

使用Shannon-Wiener指数(Shannon-Wiener Index, H)描述土壤细菌群落多样性，计算公式：

(1)

式中，ni：某个样品第i条带的灰度；N：该样品所有条带的总灰度；Pi：第i条带灰度占该泳道总灰度的比率.

DGGE图谱数字化处理后，获得相对亮度与条带迁移位置的二维矩阵，运用CANOCO排序软件，对细菌群落结构组成进行PCA.再对细菌群落结构和理化特征进行RDA.

不同土样细菌的多样性指数的差异性比较，在SPSS中进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，并采用最小显著差异法，显著性水平为α=0.05.土样细菌多样性指数和理化特征间进行Pearson相关性分析.所有数据统计分析均在Excel 2016和SPSS 19.0中进行.

2 结果与分析 2.1 DGGE图谱分析

通过对7个土样的细菌16S rRNA V3区进行PCR-DGGE指纹图谱(图 1)分析，可以看到每个土样有近百条扩增产物，说明了土壤细菌种类的复杂性.条带B1、B5、B8和B9出现在所有土样中，但亮度有差异；另外，不同土样中优势条带的迁移率也不一样，表明土样之间的优势细菌种群不同.如：条带B6是土样1、2和3的优势条带，条带B13、B14是土样5的优势条带等.

泳道编号同表 1土样编号，图谱中标号B1~B14对应14个切胶回收克隆测序的条带 图 1 土样细菌的16S rRNA V3区DGGE图谱 Fig. 1 DGGE profile of bacterial 16S rRNA V3 region from soil samples

2.2 优势和差异条带的测序结果

为深入挖掘矿区土壤的优势细菌和功能菌属，将DGGE图谱中标号的条带切胶回收、克隆，每条带随机选取6个克隆测序，并在GenBank数据库中Blast鉴定.结果表明(表 2)：共获得46条有效序列，其中1条(克隆编号2-4)与数据库中没有匹配，其余45条(有2条重复)对比相似性为92%~100%之间；约80.00%为不可培养细菌(36条)，与土壤微生物多数为不可培养的理论有一致性.这些序列在门水平上，共分属8个分类单元.其中有1个分类单元未能被鉴定(克隆编号5-6).其它7个分别归属于变形菌门(14条)、放线菌门(8条)、酸杆菌门(7条)、绿弯菌门(6条)、拟杆菌门(4条)、硝化螺旋菌门(3条)和厚壁菌门(2条).

表 2 PCR-DGGE条带序列比对结果1) Table 2 Results of sequence comparison of PCR-DGGE bands

在属水平上，测序细菌共包括39个分类单元，其中有17个(23条)可鉴定到属.在DGGE图谱中，条带亮度高的即为优势条带，其序列比对相似性高的种属可视为该土样的优势种属，如：共有优势条带B5、B8和B9鉴定出的Acidobacterium(酸杆菌属)、Iamia、Sphingomonas(鞘氨醇单胞属)和Nitrospira(硝化螺旋菌属)为所有土样的优势属.条带B11鉴定的Arthrobacter(节杆菌属)为除土样2外其它土样的优势属.条带B13、B14鉴定的Brachybacterium(深海锰氧化细菌)、Rhizobium(根瘤菌属)和Nitrospira为土样5的优势属等.

2.3 Shannon-Wiener多样性指数分析

土样细菌Shannon-Wiener指数分析显示(图 2)：复垦20年组，榆树(土样1)最高，杏树(土样3)最低，其余3个植被没有显著差异；复垦15年组，云杉(土样7)显著高于刺槐(土样6).此外，同为刺槐植被，复垦20年(土样5)显著高于复垦15年(土样6)；然而同为云杉植被，复垦20年(土样4)却显著低于复垦15年(土样7).可见，从土壤细菌多样性的角度来看，榆树和云杉有优势.

数字编号对应表 1土样编号，下同；数值为3个重复的平均值，垂直标线为标准误；不同字母表示不同土样之间P < 0.05水平上差异显著 图 2 土样细菌多样性指数分析 Fig. 2 Shannon-Wiener index analysis of bacteria from soil samples

2.4 相似性系数分析

据DGGE图谱得到各土样细菌之间的相似性系数(表 3).结果表明：土样1、2、3和4相似性较高，土样6和7相似性较高，可见，相同复垦年限的土壤细菌群落结构相似性高.然而土样5和6的相似性亦较高，推测可能与复垦植被同为刺槐有关，还需进一步研究.

表 3 土样细菌的相似性系数 Table 3 Similarity coefficient analysis of bacteria from soil samples

2.5 聚类分析

图 3为7种土样细菌群落结构的聚类分析，土样1、2、3和4，土样5、6和7分别聚为一类，聚为一类的土样之间的细菌群落结构相似性高，这与相似性系数分析的结果一致.

图 3 土样细菌的聚类分析 Fig. 3 Cluster analysis of bacteria from soil samples

2.6 PCA结果

PCA (图 4)显示不同土样细菌群落结构的差异.结果表明：PC1和PC2分别解释了49.7%和15.9%的物种组成变化，共解释总变量的65.6%.在PC1方向上，复垦20年的土样(1、2、3和4)和复垦15年的土样(6和7)分别聚在一起，且在PC2方向上复垦20年的土样(1、2和4)也聚在一起，聚在一起的土样之间的细菌群落结构相似度高，这一结果与相似性系数分析、聚类分析的结果相一致.

图 4 土样细菌群落结构的PCA Fig. 4 PCA of bacterial community structure of soil samples

2.7 土样检测指标间的相关性

土样理化特征和细菌多样性指数间的Pearson相关性分析(表 4)表明，土样细菌的多样性指数和土壤pH显著正相关，而与有机碳(organic carbon, OC)和总氮(total nitrogen, TN)没有显著相关性；土样有机碳和总氮显著正相关.

表 4 土样理化特征和细菌多样性指数间Pearson相关性分析1) Table 4 Pearson correlation analysis for the linear regressions between soil physiochemical characteristics and bacterial Shannon-Wiener index of sample plots

对土样细菌群落结构和理化特征进行RDA (图 5)表明，Axis1和Axis2分别解释了变量方差的46.9%和15.8%，共解释总变量的62.7%.土壤pH、有机碳和总氮对土样的细菌群落演替分布影响均不显著.

图 5 土样细菌群落结构和理化特征间的RDA Fig. 5 RDA of bacterial community structure and physiochemical characteristics of soil samples

3 讨论

本研究结果表明：测序共获得46条有效序列，其中，1条为GenBank数据库中没有的新菌株；约80.00%为不可培养细菌，这与本研究样品来源于土壤相一致.

值得关注的是所有土样的共有优势条带B8和B9所得序列分别与Sphingomonas sp. DKC-5-1(源于石油烃污染土壤)和Nitrospira sp.(源于铜尾矿复垦废弃地土壤)的16S rRNA基因100%和99%相似. Sphingomonas属细菌具有特殊的生态分布和代谢特征，不仅能够在许多极端环境中生存，还能在营养贫瘠的自养环境下生长繁殖. Hsueh等[15]从水稻根茎中分离的Sphingomonas paucimobilis细菌不仅对植物致病菌有拮抗作用，还有固氮基因，参与氮循环.此外，该属细菌是清理土壤中有毒物质最有效的微生物类群之一，能降解来源于煤、焦油和石油的苯系及杂环物质.在被有毒物质污染的土壤中，Sphingomonas属细菌随毒物的空间分布而分布[16]. Nitrospira属细菌为专性化能自养型，能将氨氧化成亚硝酸盐，参与氮循环，还能固定CO2以满足其能量和碳素的需要[17].条带B10、B12为杏树土样的优势条带，克隆10-1与B8的序列99.41%相似，同归于Sphingomonas属.

条带B11出现在除落叶松土样之外的其它土样中.克隆编号11-2与Arthrobacter sp. SLM13(源于矿区)的16S rRNA基因92%相似. Arthrobacter属细菌为化能异养型，通常生长在简单营养加生物素的培养基上，进行氧化代谢.广泛分布于环境、主要是土壤中，是土壤中的优势细菌，至少用平板法估算是如此[17]. Li等[18]从工业废水筛出1株Arthrobacter sp. AD26菌株，在富含莠去津的培养基上生长良好并表现出高效的莠去津降解率，对污染环境的生物修复有重要意义.

有趣的是在植被同为刺槐的情况下，条带B13、B14在复垦20年的土样中亮度很高，而复垦15年的土样却几乎看不到条带. B13所得序列与Brachybacterium sp. CC-LVL15-1(源于根际土壤)的16S rRNA基因99%相似.刘万利等[19]从冰川土壤中筛出1株产脂肪酶活力较高的Brachybacterium sp. DB5菌株.脂肪酶可用于环境如油污污染土壤的治理和生态环境修复[20].克隆编号14-1所得序列与Rhizobium sp. strain CSB_B103(源于根际土壤，内生细菌)的16S rRNA基因99%相似. Rhizobium属细菌为有机化能营养，呼吸代谢.能利用多种碳水化合物，并以铵盐、硝酸盐和大多数氨基酸为氮源.该属的菌株能侵入豆科植物的根毛并刺激形成根瘤，与植物共生，并固氮供寄主植物利用[17].克隆编号14-2所得序列和B9的序列98.91%相似，同归于Nitrospira属.可见，种植刺槐(豆科植物)的复垦地，随复垦年限的延长，Brachybacterium、Rhizobium和Nitrospira等属的细菌相对丰度变大，更有利于矿区污染土壤的生态修复和土壤肥力的恢复.

条带B4只微弱存在于榆树土样中，克隆编号4-2所得序列和Mesorhizobium sp. VG35Dpre (豆科植物根瘤菌)的16S rRNA基因98%相似. Mesorhizobium属细菌是化能有机营养型，好氧、能固氮. Nguyen等[21]从刺槐根际土壤筛出一个新菌株Mesorhizobium soli sp. nov.，在胰胨大豆琼脂斜面上比同属相关菌株生长得好，且耐受重金属. Rangel等[22]研究发现MesorhizobiumUFLA 01-765菌株可以促进植物生长、耐受性强、与生长在多种污染土壤中的银合欢(Leucaena leucocephala)共生并高效固氮，对边缘土地的生物修复具有潜在的应用价值.

综上所述可知，露天煤矿复垦土壤中，优势细菌多为化能自养或化能异养型，对营养要求不严格，能在营养贫瘠的环境下生长繁殖，甚至还能在许多极端环境中生存，并固定CO2，参与氮循环，有的能与豆科植物共生固氮，以满足其能量和碳素的需要，这对于复垦土壤肥力恢复具有重要作用；不仅如此，它们还能有效降解多环芳烃、原油等有机物，对于土壤及海洋的污染治理，尤其是对露天煤矿的土壤修复、生态系统改善具有重要的利用价值.

本研究利用Shannon-Wiener指数直观地反映土壤细菌的多样性.结果表明，复垦20年组，土壤细菌多样性依次为榆树植被>落叶松>刺槐>云杉>杏树.胡婵娟等[23]研究发现刺槐土壤微生物生物量碳和氮均显著高于杏树和沙棘，微生物多样性指数表现为刺槐林地>杏树>沙棘；杨晓娟等[24]得出杏树土壤微生物数量低于樟子松、河北杨等其他林地的结论，这都与本文的研究结果类似.再者，刺槐随年限增加土壤细菌多样性恢复得更好，但云杉在较短年限时效果更好.江元明等[25]研究发现云杉比油松的林地土壤肥力高、土壤微生物生物量高，因此云杉更有利于林地土壤生态服务功能的恢复，这与本文的研究结果类似.此外，Pearson相关性分析表明土壤细菌的多样性指数和土壤pH显著正相关，这与刘丽等[26]的研究结果一致.

Helingerová等[27]研究表明，复垦和未复垦土壤的微生物生物量都会随时间的延长而增大，并且，复垦土壤整体的微生物活性增长更快.而植被生长使得土壤细菌种类趋于丰富，群落多样性更高[28].本研究也有相似的结果，在相似性系数分析、聚类分析和PCA中均显示，相同复垦年限的土样细菌群落结构相似性高.这可能是随着复垦年限的增加，细菌生物量增大，同时植被生长使得土壤细菌种类更丰富，多样性更高.

不同植物种类的根系可影响土壤结构.发达的根系可以增强土壤团粒结构和提高土壤有机质的积累，从而导致发达的根际附近的微生物活性高.本研究中，植被同为刺槐但复垦年限不同的土壤细菌群落结构也比较相似，主要原因可能是刺槐表层根系较发达，有利于改善表层土壤结构，是根系和土壤细菌相互作用的结果，还需进一步研究.

本研究也有一些不足之处，首先是实验条件的局限，实验设计未能如愿，主要是没有采到未复垦对照土样.再者实验样地不够丰富、复垦年限不够连续多样，样本量也不足够大，使研究结果存在一些误差.今后的研究应加大样本量，并在相同植被的样地长期跟踪研究，才能更好地反映复垦植被及年限对土壤细菌的影响规律.此外，由于DGGE技术本身的局限性，导致得到的数据分析结果个别反常、切胶回收的条带序列不一致等均给后续分析带来了困扰，下一步考虑通过高通量测序技术研究.

4 结论

(1)在土壤细菌多样性的恢复方面，榆树和云杉有优势.土壤细菌群落结构相似性方面，相同复垦年限的土样相似性高.

(2)细菌多样性指数和土壤pH之间存在显著正相关性.土壤pH、有机碳和总氮对土壤的细菌群落演替分布均没有显著影响.

(3)露天煤矿复垦土壤的优势菌群多为Nitrospira、Sphingomonas、Arthrobacter、Brachybacterium、Rhizobium以及Mesorhizobium等或参与氮循环、或降解多环芳烃类有机物等有利于污染土壤的生态修复和土壤肥力恢复的功能细菌属.

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