2017, Vol. 38
2. 湖南省农业科学院植物保护研究所, 园艺作物病虫害治理湖南省实验室, 长沙 410125;
3. 中国科学院生态环境研究中心, 中国科学院环境生物技术重点实验室, 北京 100085;
4. 湖南生物机电职业技术学院, 长沙 410127
, JIN De-cai3 , ZUO Hui4 , ZHANG Zhuo2 , TAN Xin-qiu2 , ZHANG De-yong2 , Lu Xiang-yang1 , LIU Yong2
2. Key Laboratory of Pest Management of Horticultural Crop of Hunan Province, Institute of Hunan Plant Protection, Hunan Academy of Agricultural Science, Changsha 410125, China;
3. Chinese Academy of Sciences Key Laboratory of Environmental Biotechnology, Research Center for Eco-Environmental Sciences, Chinese Academy of Sciences, Beijing 100085, China;
4. Hunan Biological and Electromechanical Polytechnic, Changsha 410127, China
近几十年来，农业经营方式发生巨大的转变，精细密集农业经过不断地发展，世界上农药的使用量逐年显著增加.同时随着经济的发展和社会的进步，人类生活水平逐步提高，环境保护意识逐渐增强，营养价值高、无污染、无公害的农产品越来越受到人们的青睐.农药污染危害极大，污染生存环境，破坏生态平衡，损伤种群群落，威胁生物多样性，威胁食品安全，危害人体健康[1].我国四大流域中，珠江流域由于经济发展较快，农业相对处于次要地位，因此农药的使用相对较少，污染较少；长江流域、黄淮海流域和松辽流域等地农业发达，农药的使用量较大，对环境的污染较大[2].农药被施用后，一是作用于靶标生物，并对靶标生物起着控制作用；二是被非靶标生物所接受，其余则是进入环境中.由于大部分农作物生长于土壤中，将农药施用于农作物时不可避免地撒落、飘逸、渗漏进入土壤环境中，有一些农药靶标生物本来就生活在土壤中，农药必须直接施用于土壤，因而土壤成为农药污染最大的目标[3].例如喷施的农药一般有40%~60%直接降落、残留在土壤中，5%~30%的农药飘浮于大气中，最终也通过降水返回地面，进入土壤[4].另外一方面，农药在被施用于水生作物时直接污染水体，或者通过因降水等对土壤的渗透而间接污染水体.生物农药是自然界本身存在的微生物或其产物，对人类和环境的潜在危害比有机农药小，因其种类丰富、分布广泛、适应性强和代谢途径多样的特点显现出自身在农药污染治理方面的优势[5].大力开发和推广生物农药，减少农业对有机农药的依赖，有利于逐步建立现代环保农业生产模式，实现农业的可持续发展，有效减少对环境的污染.研究生物农药对致病菌的作用机制有助于开发新的和有效的生物农药.
辣椒疫病(phytophthora blight)是由辣椒疫霉菌引起的一种全球性病害，对辣椒产生重大危害，现已在世界各辣椒产区普遍发生，经常造成辣椒的大量减产甚至颗粒无收.为了达到控制辣椒疫病的发生，只有采取高效可操作的方法防治辣椒疫病.由于辣椒疫病病原菌的传播途径多样，常呈暴发式发生，唯有采取多种防治方法才能有效地防治辣椒疫病.参考综合国内外文献，防治辣椒疫病主要采取以下几种方法：通过农业栽培措施防治辣椒疫病[6, 7]，采用合适的肥料和选择适当的灌溉方式以及改进栽培措施和种植结构均可以促进辣椒生长，提高辣椒的抗病性，同时也可抑制病原菌生长和繁殖，推迟或减轻病害的发生.目前生产上主要是使用化学药剂，然而化学药剂的大量使用使病菌的抗性逐渐增强、造成环境污染.生物防治被认为是持续控制疫霉菌病害发生的有效途径[8]，对环境无污染，具有很大的发展潜力，越来越受到生产者和研究者的青睐.辣椒疫病的生防资源比较丰富，已筛选并确定许多真菌[9, 10]、细菌[11, 12]、放线菌[13, 14]、植物提取物[15]等均对辣椒疫病有拮抗作用.微生物农药是生物农药中重要组成部分，随着微生物农药研究的深入和应用技术的不断发展，大量微生物农药被用于防治辣椒疫病.光合细菌(photosynthetic bacteria，PSB)是一类在厌氧光照下进行不产氧光合作用的原核生物的总称[16]，广泛地分布于土壤、水田、沼泽、湖泊、江河、海洋等处[17].近年来，光合细菌在产氢固氮[18, 19]、医药[20]、降解农药[21]、处理工业废水[22]、促进作物增产[23]、水产养殖业[24]等方面进行的大量的应用.微生物在生态系统物质循环和能量流动过程中起重要作用, 维持土壤生态系统功能的稳定[25].土壤-作物系统与土壤微生物之间存在相互作用、互为条件的关系.根际土壤与根系密切接触，根际土中的微生物数量与种类受根系的影响较大，根系分泌物对于生物地球化学循环、根际生态过程调控、植物生长发育等均具有重要功能, 尤其是在调控根际微生态系统结构与功能方面发挥着重要作用, 调节着植物-植物、植物-微生物、微生物-微生物间复杂的互作过程[26], 而根际土壤微生物对根系的生长发育也产生了明显影响.本试验从样品及分析方法上对根际土壤微生物进行16S rDNA测序，研究辣椒疫病病株与健康植株的微生物多样性，探究沼泽红假单胞菌PSB06对辣椒疫病根际微生物多样性的影响，有助于从更精确的微观分析中发现作物根部病害与微生物生态的关系，以期为进一步研究光合细菌对辣椒疫病的抗病机制研究提供新的思路，也为光合细菌的制备提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试菌株为保存在湖南省植物保护研究所的沼泽红假单胞菌PSB06.
1.2 试验方法 1.2.1 试验地点试验在位于湖南省长沙市长沙县榔梨镇花垣村的湖南省植物保护研究所基地进行，试验田为常年种植辣椒且辣椒疫病发生严重的田块.
1.2.2 试验设计试验设3个处理，处理1：PSB06发酵液；处理2：PSB06灭活发酵液；处理3：清水为空白对照(CK)，每个处理4次重复，共计12个小区，随机排列，试验小区面积为12 m2.
1.2.3 施药方法施药采用根部喷施处理.在辣椒疫病发病初期喷药，连续喷施3次，分别在喷药后7 d、14 d后采用5点取样法[27]，随机抽取5个点采用抖落法采集辣椒根际土样后，将同一处理4次重复混合后并编号(表 1)，采集土样-80℃冰箱保存.土样采集时间为6月26日和7月3日.
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表 1 供试土壤处理1) Table 1 Origin of the tested soil |
1.3 样品处理 1.3.1 样品土壤DNA提取
土壤DNA的提取采用FastDNA SPIN Kit for soil试剂盒(MP Biomedicals，美国)，具体步骤参照试剂盒使用说明书.取5 μL基因组DNA使用1%的琼脂糖凝胶电泳检测，采用NanoDrop2000(Thermo Scientific，美国)测定浓度，-20℃冰箱保存.
1.3.2 16S rDNA的V4区PCR扩增和测序以样品DNA为模板，利用细菌16S rDNA基因的通用引物515F (5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′)和806R (5′-GGACTACHVGGGTWTCTAAT-3′)进行PCR扩增[28]. 50 μL PCR反应体系：5 μL 10×PCR buffer (含20 mmol·L-1 MgCl2)，4 μL dNTP (10 mmol·L-1)，1 U Taq DNA聚合酶，1 μL DNA模板，灭菌的ddH2O补至50 μL.
PCR反应条件：95℃预变性10 min；95℃变性45 s，55℃退火1 min，72℃延伸45 s，循环35次；最后72℃延伸10 min，4℃保持. PCR扩增产物用1%的琼脂糖凝胶电泳检测. PCR产物送湖南长沙市中南大学生物冶金教育部重点实验室进行高通量测序.
1.4 数据分析原始数据的处理通过Galaxy平台及其集成软件(http://rccc.ou.edu)完成.通过唯一的barcode标记将序列分配到单独的样品上，使用Brim[29]去除小于200 bp的序列.使用FLASHv1.2.5[30]对所得到的序列进行拼接. Uchime (usearch v5.2.3)[31]使用参考序列去除内嵌子序列.调用UPARSE[32]程序划分OUT，在97%的序列相似度水平下对序列进行归并.通过RDP-Classifer软件完成样品序列的分类注释，置信度参数设置为50%.一般认为遗传距离小于3%的序列对应微生物属于同一物种.使用Mothur软件构建稀释曲线用来评估各样品在测序强度之间的差异.根据每个样品文库的OTU丰度信息，完成α和β多样性分析.通过香农指数多样性和辛普森指数多样性评估序列文库的多样性.通过DCA (detrended correspondence analysis)和NMDS (non-metric multidimensional scaling)来分析3组不同处理之间的微生物群落结构之间的差异.
2 结果与分析 2.1 高通量测序数据预处理结果本研究利用高通量测序方法，原始数据在Galaxy网站处理得到各样品序列测序量在13 671和130 336条之间，平均为61 637条.如图 1所示，各样品的稀释曲线趋于平缓，也就可以认为测序深度已经基本覆盖到样品中所有的物种，测序数据量足以反映样品中的物种多样性.
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图例含义同表 1 图 1 稀释曲线 Fig. 1 Rarefaction curves for OTUs |
目前普遍认可种(species)的分类水平为97%序列相似度[33]，在该相似度水平下使用获取的OTU计算了各样本的α多样性.本研究共鉴定到3 851个OTUs，在97%的序列相似度水平下，使用Shannon指数、Simpson指数对土壤微生物多样性进行评估.如图 2和图 3所示：在第7 d和第14 d，CK发病土样多样性指数均最低，PSB06发酵液健康植株土样微生物多样性最高且Simpson指数远远高于其他不同处理的样品.分别对第7 d和第14 d喷晒PSB06发酵液、PSB06灭活发酵液和清水健康植株的Shannon指数和Simpson指数比较，PSB06发酵液微生物多样性均最高，而灭活发酵液和清水健康植株相比多样性较低, 两者差异不显著；分别对第7 d和第14 d喷晒PSB06发酵液、PSB06灭活发酵液和清水健康植株和相对应的发病植株的Shannon指数和Simpson指数比较，健康植株的微生物多样性均大于发病植株，且各样品在第7 d和第14 d的微生物多样性无明显差异.
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图 2 各样品香农指数对比 Fig. 2 Shannon index of different samples |
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图 3 各样品辛普森指数对比 Fig. 3 Simpson index of different samples |
Beta多样性指标用来比较多组样品之间差异，DCA分析结果(图 4)表明：在第7 d和第14 d采集的相同处理的样品均能较紧密的结合在一起，有很高的相似性，几种不同处理的菌群群落可以明显地区分开来.非度量多维尺度分析结果(图 5)表明，除了清水处理的发病土样在第7 d和第14 d两个样品稍有差异外，其他来自同一处理的样品均能聚在一起，相似性较高，几种不同处理的菌群群落可以明显地区分开来，并且来自同种环境的样本基本聚集紧密.这说明相同处理的微生物群落结构在第7 d和第14 d群落结构变化不大，而不同处理的样品间微生物群落结构有明显差异.
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图 4 去趋势对应分析 Fig. 4 Detrended correspondence analysis (DCA) |
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图 5 非度量多维尺度分析 Fig. 5 Non-metric multi-dimensional scaling (NMDS) |
采用RDP classifier对序列进行分类地位的鉴定，共鉴定到微生物的22个门，如图 6，其中主要的门包括Proteobacteria (变形菌门)、Thaumarchaeota (奇古菌门)、Acidobacteria (酸杆菌门)、Planctomycetes (浮霉菌门)、Actinobacteria (放线菌)、Chloroflexi (绿弯菌门)、Verrucomicrobia (疣微菌门)、Bacteroidetes (拟杆菌门)和Gemmatimonadetes (芽单胞菌门)等.
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图 6 各样品在门水平的群落相对丰度 Fig. 6 Relative abundance of different samples at phylum level |
进一步对各样品在属水平(OUT条数丰度大于1.5%)相对丰度研究，结果表明不同样品的主要土壤微生物群落结构存在显著差异(图 7).在门水平下，PSB06发酵液健康植株土样相比较其他样品，在第7 d和第14 d中Actinobacteria (放线菌门)分别占11.8%和12%，发生了明显的增加，而其他样品均在10%以下(图 8).分别对喷洒PSB06发酵液, PSB06发酵液灭活液, 清水健康植株土样进行比较，在第7 d和第14 d之间放线菌没有显著，且其中Actinobacteria (放线菌)丰度从大到小依次为：PSB06发酵液>清水>PSB06发酵液灭活液.在属水平上，其中Nitrososphaera、Subdivision3_Genera_incertae_sedis、Gemmatimonas在各样品中均占优势地位.
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图 7 各样品在属水平的群落分布 Fig. 7 Relative abundance of different samples at genus level |
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图 8 各样品第7 d和第14 d放线菌门相对丰度 Fig. 8 Relative abundance of Actinobacteria in different samples on the seventh day and fourteenth day |
从以上分析结果可知，同一处理的第7 d的和第14 d的样本的分类鉴定结果表明，来自同一处理的样品间差异不大.在β多样性分析中，来自同一处理的样品间相似性显著高于不同处理间的微生物群落相似性，说明该数据集是可靠的，分析结果也合理可信. α多样性分析和β多样性分析结果表明：在第7 d和第14 d来自同一处理样品之间的为微生物群落结构没有显著差异，而不同处理间的微生物群落结构相差较大.喷洒PSB06发酵液、PSB06灭活发酵液和清水健康植株和相对应的发病植株的Shannon指数和Simpson指数比较，发现健康植株的土壤微生物多样性均大于发病植株.在对分别喷洒PSB06发酵液、PSB06灭活发酵液、清水的健康土样的Alpha多样性分析中发现，喷洒PSB06发酵液的多样性最高, 并且远远高于PSB06灭活发酵液和清水健康植株土壤微生物多样性.结果表明沼泽红假单胞菌PSB06能明显提高土壤微生物多样性，有助于下一步研究沼泽红假单胞菌抗辣椒疫病的抗病机制.
微生物群落遗传多样性分析结果表明：高通量测序共鉴定到22个门，其中主要的门包括Proteobacteria (变形菌门)、Thaumarchaeota (奇古菌门)、Acidobacteria (酸杆菌门)、Planctomycetes (浮霉菌门)、Actinobacteria (放线菌门)、Chloroflexi (绿弯菌门)、Verrucomicrobia (疣微菌门)、Bacteroidetes (拟杆菌门)和Gemmatimonadetes (芽单胞菌门).尹敬芳等[34]在辣椒上的研究及段春梅等[35]、王玲娜等[36]和段佳丽等[37]在其他作物上的研究结果表明发病植株和健康植株根际土壤的微生物群落的数量和种类发生了变化，与本研究得出的结论一致.放线菌在健康植株根际土壤中丰度均高于发病植株根际土壤，PSB06发酵液健康植株根际土壤中微生物中放线菌的丰度远远高于其他样品，这一结果也与杨芳等[38]和张信娣等[39]在光合细菌上的研究相一致.郭小强等[40]和张鹏等[41]对连作辣椒的微生物数量做了研究，马云艳等[42]进一步对病株和健株根区土中的可培养微生物进行测序并对其群落多样性进行比较，但是只对其中可培养微生物的多样性进行比较，并未对总体微生物进行多样性分析.本研究运用高通量测序技术检测样品中群落结构，有助于深层次地探明辣椒疫病病株与健株的微生态差异，精准地探明辣椒疫病发生的微生态机制.
4 结论(1)光合细菌菌剂PSB06能显著提高土壤中放线菌的丰度.
(2)同等条件处理，辣椒疫病发病植株根际土壤微生物多样性均小于正常植株土壤微生物多样性.
(3)通过对不同处理的土壤根际微生物的α和β多样性分析表明，不同处理样品之间的微生物群落结构存在显著差异，喷洒光合细菌PSB06发酵液的土壤根际微生物多样性最高，能显著提高土壤微生物群落多样性.
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