2017, Vol. 38
在石油的开采、运输及使用过程中由于泄漏或者运输不当造成了各种环境污染.石油进入土壤后一方面会影响土壤中的微生物组成和结构，另一方面会阻碍植物根系呼吸及对营养的吸收.导致植物生长不良甚至死亡.微生物修复法具有成本低、效率高、无二次污染等优点，目前已成为广泛采用的石油污染土壤修复技术[1~3].
在利用微生物法修复油污土壤时，土壤的菌群结构发生相应的变化，石油烃的去除作用与土壤微生物菌群结构的变化有关. Liu等[4]研究认为，在利用微生物法修复油污土壤前期，细菌菌群对易降解石油烃的去除起主要作用，修复后期对难降解石油烃组分的去除，主要依靠土壤真菌的代谢作用完成.本研究结果表明，当向油污土壤中同时投加降解菌并补充氮营养时，对土壤中的石油烃去除效果较好[5].微生物修复作用会导致土壤中石油烃降解菌数量及微生物多样性指数的变化，石油烃的降解效率和降解菌数量之间存在相关关系[6, 7].
因此，土壤微生物因素的变化，与石油烃的降解效率之间存在着相互作用关系.研究修复前后土壤菌群结构的变化，对于深入理解修复对土壤微生物的影响作用机制具有较重要的理论意义.
土壤中氮的含量对于微生物降解污染物具有重要的作用.有研究认为，当土壤中碳氮比值为100/10时，微生物对石油烃的去除效果最好[8, 9].目前的文献研究多集中在向土壤中补充氮素进行生物刺激修复方面[10]，对于修复过程中不同形态氮素含量变化的研究，目前报道相对较少.
本文对石油污染土壤进行了微生物修复处理，利用MiSeq高通量测序平台对土壤微生物群落结构变化进行了详细研究，同时对修复过程中土壤不同形态氮含量变化进行了沿程测定.研究结果对于明确修复过程中土壤中不同形态氮素的转化规律，以及微生物群落变化特征具有较重要的意义，以期为石油污染土壤的微生物修复提供一定的理论基础.
1 材料及方法 1.1 土壤石油污染土壤采自甘肃庆阳某油井周围，土壤为黄绵土.土壤经碎散、除杂、过筛(0.85 mm)、混匀、密封储存于塑料袋中备用. 表 1为供试土壤理化性质的测定结果.
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表 1 油污土壤理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of oil-polluted soil |
1.2 降解菌菌源
所用的12株降解菌是前期研究中从甘肃庆阳(GQ)、陕北子长(SZ)和陕北清涧(SQ)石油污染土壤中分离获得的，包括5株假单胞菌和7株杆菌[11].
1.3 实验方案设计将12株菌制成D值为0.5(600 nm处测定值)的混合菌悬液[4].实验方案如表 2所示，采用花盆模拟实验进行修复研究，称取9份供试土壤各900 g，分装于9个花盆中.其中3份在自然条件下放置作为控制实验(CK)；另外3份在保持含水率为20%的条件下，补充氮磷营养液使土壤C/N/P比为100/10/1，并同时投加12株混合降解菌悬液进行微生物修复(BA+BS)；其余3份土壤通过定期向土壤中加入灭菌水保持土壤含水率为20%(water hold capacity，WHC).实验具体方案见表 2.
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表 2 石油污染土壤生物修复处理方案 Table 2 Experiment design for bioremediation of oil-polluted soil |
室温条件下每天翻动土壤进行连续修复研究.每隔7 d取一次土壤样品，置于通风橱中风干，取1 g用于测定石油烃的不同组分.
利用超声波萃取法提取土壤中的总石油烃[12]，参照EPA 3611B[13]方法，将提取的总石油烃采用柱层析法分离成不同组分，利用GC-MS测定不同组分含量.
GC-MS测定烷烃如下.色谱柱：HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；进样量：1 μL；不分流进样；载气(氦气)流量：1 mL·min-1；进样口温度：300℃；升温程序：初始温度为65℃，保持5 min，以10℃·min-1的速率升至300℃，保持5 min；电子轰击(EI)离子源能量：70 eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：5 min；选择离子监测(SIM)模式：特征离子质荷比(m/z)57、85.
GC-MS测定多环芳烃条件.色谱柱：HP-5毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)；进样量：1 μL；不分流进样；载气(氦气)流量：1.2 mL·min-1；进样口温度：300℃；升温程序：初始温度为50℃，保持1 min，以15℃·min-1的速率升至170℃，保持2 min，然后以8℃·min-1的速率升至210℃，最后以3℃·min-1的速率升至300℃，保持5 min；电子轰击(EI)离子源能量：70 eV；离子源温度：230℃；四级杆温度：150℃；溶剂延迟：5 min；碰撞气(氦气、氮气)流量：1.5 mL·min-1；多重反应监测(MRM)模式.
1.4 高通量测序分析利用Illumina MiSeq平台对修复18周的不同处理石油污染土壤进行高通量分析测定，以研究其菌群结构差异.具体测定步骤如下.
利用OMEGA试剂盒(Life，USA)提取土壤的总DNA，利用琼脂糖凝胶电泳检验DNA的完整性.
利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒(Life，USA)对基因组DNA精确定量，以确定PCR反应应加入的DNA量.利用341F/805R引物进行PCR扩增，341F引物：5′-CCCTACACGACGCTCTTCCGATCTG-3′；805R引物：5′-GACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGA ATTCCA-3′.
PCR扩增程序如下：94℃预变性3 min，94℃变性30 s，45℃退火20 s，65℃延伸30 s，重复5个循环；94℃变性20 s，55℃退火20 s，72℃延伸30 s，重复20个循环；引入Illumina桥式PCR兼容引物，95℃预变性30 s，95℃变性15 s，55℃退火15 s，72℃延伸30 s，重复5个循环.利用琼脂糖凝胶电泳分析，选用0.6倍磁珠处理，纯化回收所需的PCR产物.
利用Qubit 2.0 DNA检测试剂盒对回收的DNA精确定量，并等量混合，每个样品DNA质量取10 ng，最终上机测序量为20 pmol.
1.5 土壤不同形态氮的测定每周取不同处理土壤，风干、研磨过2 mm筛后，准确称取1 g土壤.利用凯氏定氮法测定土壤中总氮的含量；利用氯化钙浸提-紫外光度法测定土壤硝态氮的含量；利用氯化钾浸提-靛酚蓝比色法测定土壤中氨氮的含量.详见文献[14].
1.6 数据分析利用Origin 9.0软件对数据进行统计分析和计算，利用Prinseq软件对高通量测序结果进行质量控制，利用Usearch软件校正序列并将所有样本序列按照序列间的距离进行聚类，根据序列之间的相似性将序列分成不同的操作分类单元(operational taxonomic unit，OTU)，物种分类和Alpha多样分析分别使用RDP classifier和Mothur软件进行.
2 结果与讨论 2.1 不同组分烃的降解不同修复处理土壤中烷烃、多环芳烃的含量变化如图 1所示.修复18周，经过微生物修复处理的土壤中(BA+BS)烷烃含量由25 987.8 mg·kg-1降低至12 788.6 mg·kg-1，烷烃总去除率为50.8%；多环芳烃的含量由初始时的5 322.9 mg·kg-1降低至2 917.2 mg·kg-1，总去除率为45.2%.在保持土壤湿度为20%条件下处理的土壤中(WHC)，烷烃含量由25 987.8 mg·kg-1降低至21 661.3 mg·kg-1，烷烃总去除率为16.7%，多环芳烃由5 322.9 mg·kg-1降低至4 342.8 mg·kg-1，多环芳烃总去除率为18.4%.控制实验(CK)中烷烃含量由25 987.8 mg·kg-1降低至23 267.5 mg·kg-1, 烷烃总去除率为10.5%；多环芳烃由5 322.9 mg·kg-1降低至4 952.3 mg·kg-1, 多环芳烃总去除率为7.0%.结果说明与CK处理相比，微生物修复作用可有效去除土壤中大部分的烷烃和多环芳烃.保持土壤含水率为20%的WHC处理对于土壤中烷烃、多环芳烃的去除效果并不明显.
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图 1 不同处理土壤中烷烃和多环芳烃含量变化曲线 Fig. 1 Concentrations of alkanes and polycyclic aromatic hydrocarbons in soil with different treatments |
多数研究认为土壤湿度是影响微生物修复作用的主要因素[15]，在本研究中，土壤湿度为20%时，对于不同组分石油烃的去除没有明显促进作用，笔者在前期工作中也得出了相似的研究结果[4].可能是由于西北地区半干旱的环境条件已经使当地的土壤微生物适应了缺水环境，其具体原因有待于进一步的研究.
2.2 微生物群落多样性分析 2.2.1 基因序列优化统计及质量评估利用PCR技术扩增细菌16S rDNA基因，并进行高通量测序.对测序质量进行评价，结果如表 3所示，处理前测定的3个土壤样品序列总数均在43 000条以上.为了提高后续分析质量和可靠性，利用Usearch剔除掉靶区域外序列，同时去除嵌合体，对原始序列进行去接头、质量剪切等处理. 3个土壤样品有效序列分别为42 996、43 347、44 233条，序列优化率均在89%以上，说明本次序列优化的步骤合理. 3种不同处理的土壤样品的测序覆盖率均大于99%，说明本次MiSeq测序深度足够.
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表 3 优化序列统计及测序质量评价 Table 3 Sequence statistics and quality estimation of 3 soil samples |
2.2.2 群落多样性分析
多样性指数是用于评价土壤微生物丰富度和群落均匀度的综合指标[16]. ACE指数和Chao1指数用来评价土壤微生物的丰富度，ACE指数和Chao1指数值越大，表明土壤微生物丰富度越大. Shannon和Simpson指数用来评价土壤微生物的均匀度，Shannon指数值越大，Simpson指数值越小，表明土壤微生物均匀度越高[17].根据表 4可知，经过修复处理的土壤样品(BA+BS)，其ACE指数和Chao1指数值分别为1 031.17和648.64，低于未经处理的土壤指数(CK土壤中的两个指数分别为1 148.91和871.91)，然而经过修复的土壤Shannon指数值大于自然条件下修复的土壤，说明微生物修复作用可降低石油污染土壤中微生物的丰富度.另外，土壤微生物群落的均匀度经过生物修复处理有所提高.
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表 4 不同处理土壤的微生物群落多样性指数 Table 4 Diversity indices of bacterial communities of soils with different treatments |
比较CK处理和WHC处理的土壤微生物群落多样性指数可知，WHC处理的ACE、Chao1指数相对CK较低，但其Shannon指数值增加，说明提高土壤含水率可在一定程度上降低土壤微生物群落的均匀度，但土壤微生物群落的丰富度略有增加.
2.2.3 土壤的微生物群落结构(1)门水平微生物群落结构分析
3种不同处理的油污土壤样品中微生物归属于33个门，其中12个门为3种处理样品所共有，分别为放线菌门(Actinobacteria)、变形菌门(Proteobacteria)、暂定螺旋体门(Candidatus Saccharibacteria)、拟杆菌门(Bacterodetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、浮霉菌门(Planctomycetes)、酸杆菌门(Acidobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)、栖热球菌门(Deinococcus-Thermus)、芽单胞菌门(Gemmatimonadetes)以及一种未知菌门(unclassified).
对不同处理土壤前10种优势菌门的相对丰度图进行了分析，所得结果如图 2所示，经过修复处理(BA+BS)的微生物群落结构在门水平丰度分布上发生了较大变化.未经修复处理的土壤(CK)中的优势菌群主要是放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)，所占比例分别为64.4%和29.6%.经过微生物修复处理的土壤(BA+BS)中，放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)仍然是土壤中的最优势菌群，但是其所占比例分别降低为48.5%和15.4%.另外，螺旋体菌门(Candidatus Saccharibacteria)、拟杆菌门(Bacterodetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)所占丰度在微生物修复处理的土壤(BA+BS)中显著提高.
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图 2 土壤微生物门水平相对丰度 Fig. 2 Relative abundances of the 10 most abundant phyla in three soil samples |
放线菌群处在多个生态位上，因此它们广泛存在于各种土壤中，有报道指出在多环芳烃污染的土壤中通常含有较多放线菌门[18].根据报道，厚壁菌门(Firmicutes)是常见的石油解菌之一，广泛存在于油井附近的污染土壤中；拟杆菌(Bacterodetes)是石油污染土壤中降解PAHs的优势菌群[19].本研究中，经过微生物修复处理(BA+BS)的土壤中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacterodetes)所占丰度高于自然条件下放置的土壤，说明土壤中石油烃去除率的提高与土壤中烃类降解菌的增加有关.
(2)属水平微生物群落结构分析
对不同处理土壤样品中20种最优势菌属进行分析，结果如图 3所示.在属水平上，CK处理的土壤优势菌属是类诺卡氏菌属(Nocardioides)原小单孢菌属(Promicromonospora)，次优势菌属包括假单胞菌属(Pseudomonas)、微孢菌属(Microcella)、未知菌属(unclassified)、根瘤菌属(Rhizobium)、螺旋体门未知属(Saccharibacteria)；WHC处理的土壤优势菌属为类诺卡氏菌属(Nocardioides)，次优势菌属包括螺旋体门未知属(Saccharibacteria)、迪茨氏菌属(Dietzia)、赖氏菌属(Leifsonia)、未知菌属(unclassified)、红色杆菌属(Olsenella)、粘质赛氏杆菌(Saccharofermentans)；经过微生物处理的土壤，其微生物群落结构在属水平上发生了较大的变化，其优势菌属为类诺卡氏菌属(Nocardioides)、螺旋体门未知属(Saccharibacteria)及迪茨氏菌属(Dietzia).
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图 3 土壤微生物属水平相对丰度 Fig. 3 Relative abundances of the 20 most abundant genera in three soil samples |
刘健[20]研究发现，迪茨氏菌属(Dietzia)分布在PAHs污染含量相对较高的油井井口处，在高盐环境条件下迪茨氏菌属(Dietzia)能有效降解石油烃，Wang等[21]从石油污染环境中发现新型迪茨氏菌能有效降解芳香族化合物，并且对烷烃也具有较宽的降解谱(C6~C40)，对采油区土壤生物修复效率的提高尤为重要.本研究中利用微生物法修复甘肃油田石油开釆区盐碱土壤，显著提高了土壤中迪茨氏菌属(Dietzia)的相对丰度.
从属水平微生物均匀度来看，BA+BS处理土壤菌群在属水平上相对丰度相差较小，均匀度较高.除了几种优势菌群，还包括有赖氏菌属(Leifsonia)、里氏杆菌属(Riemerella)、不动杆菌属(Acinetobacter)等，其中赖氏菌属(Leifsonia)和不动杆菌属(Acinetobacter)已成为现今众多科研者筛选用以石油污染土壤生物修复的特定降解菌群[22, 23].
2.3 土壤中不同形态氮的变化规律对修复过程中不同处理的土壤中氮素含量变化进行了分析测定，结果如图 4所示.在微生物修复处理的土壤中(BA+BS)，总氮含量在修复初期显著增加，2~6周时迅速降低，12周后基本保持不变，修复后期土壤中的总氮含量约为1 630 mg·kg-1；氨氮含量先增加，在第四周达到最大(53.86 mg·kg-1)，第6周时迅速降低至2.5 mg·kg-1，并在6周后保持不变；硝态氮含量在修复的前4周呈下降趋势，4周后基本保持不变，含量降低至6.5 mg·kg-1.自然放置的土壤(CK)中，总氮、氨氮及硝氮含量变化不大，分别为750、0.9和38.5 mg·kg-1.在WHC处理中，总氮、氨氮含量变化趋势与自然放置土壤的变化基本一致；硝态氮含量在修复前期降低，修复后期保持不变.
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图 4 土壤中不同形态氮的含量变化 Fig. 4 Concentration of different types of nitrogen in different soils |
综合氨氮、硝氮及总氮变化来看，修复初期BA+BS处理中总氮与氨氮含量明显高于CK及WHC处理，随后BA+BS处理中氨氮和硝氮的含量显著降低，而总氮含量基本趋于稳定.原因可能是由于本次修复研究中外加氮源为尿素，属酰胺态氮肥，在脲酶的作用下会部分水解为铵态氮，这一部分铵态氮及其通过硝化作用产生的硝态氮能为大多数微生物的新陈代谢所直接利用.因此BA+BS处理的土壤中氨氮含量在修复前期也呈显著增加趋势，修复4周后由于微生物新陈代谢作用、生物质土壤胶质的固定作用以及土壤淋洗流失等原因，导致氨氮含量迅速降低[24].但可能由于本次供试土壤中氨化类细菌数量较少或者脲酶活性降低，使得这一转化过程无法继续进行，土壤中的氮素在发生部分氨化后，大部分仍以有机氮的形式存在，所以微生物仅能利用土壤中原有的无机氮源及少量有机氮源进行正常的新陈代谢作用，引起氨氮及硝氮含量的显著降低.另外，尿素的水解产物均属不稳定化合物，在一定条件下会有相当量的氮以氨气的形式逸出损失，但铵态氮相对于总氮而言含量很低，因此并没有表现出总氮的显著减少[25, 26].
3 结论(1)微生物修复处理的土壤中，烷烃和多环芳烃的去除率分别为50.8%和45.2%，不经微生物处理的土壤中烷烃和多环芳烃的去除率分别为10.5%和7.0%，说明微生物修复处理可有效去除土壤中大部分烷烃和多环芳烃.
(2)未经处理的油污土壤中，优势菌门主要为放线菌门(Actinobacteria)和变形菌门(Proteobacteria)，土壤优势菌属为类诺卡氏菌属(Nocardioides)和原小单孢菌属(Promicromonospora).微生物修复处理提高了土壤中厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacterodetes)所占丰度，土壤中的优势菌属为类诺卡氏菌属(Nocardioides)、螺旋体门未知属(Saccharibacteria)及迪茨氏菌属(Dietzia).经过微生物修复处理的土壤中烃降解菌所占丰度明显增加，烷烃和多环芳烃降解效果的提高与土壤中烃降解菌所占丰度的增加有关.
(3)经过修复处理的土壤中总氮、氨氮含量都呈现先增加、后降低的趋势，而硝态氮的含量在修复前期呈降低趋势，修复后期基本保持不变.说明修复过程中存在着部分总氮向氨氮的转化，而石油烃的降解与土壤硝氮含量相关.
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