环境科学  2017, Vol. 38 Issue (2): 697-702   PDF    
引用本文
魏欣, 薛顺利, 杨帆, 李响, 刘振鸿, 薛罡, 高品. 零价铁对污泥高温厌氧消化过程中四环素抗性基因及第一类整合子的消减影响[J]. 环境科学, 2017, 38(2): 697-702.
WEI Xin, XUE Shun-li, YANG Fan, LI Xiang, LIU Zhen-hong, XUE Gang, GAO Pin. Effect of Zero Valent Iron on the Decline of Tetracycline Resistance Genes and Class 1 Integrons During Thermophilic Anaerobic Digestion of Sludge[J]. Environmental Science, 2017, 38(2): 697-702.
零价铁对污泥高温厌氧消化过程中四环素抗性基因及第一类整合子的消减影响
魏欣 , 薛顺利 , 杨帆 , 李响 , 刘振鸿 , 薛罡 , 高品     
东华大学环境科学与工程学院, 国家环境保护纺织工业污染防治工程技术中心, 上海 201620
收稿日期: 2016-07-31; 修订日期: 2016-08-31
基金项目: 国家自然科学基金项目（51208086）；东华大学“励志计划”项目
作者简介: 魏欣(1991~), 女, 硕士研究生, 主要研究方向为水污染控制及水质安全, E-mail:1300071039@qq.com
通讯联系人, 高品, E-mail:pingao@dhu.edu.cn
摘要: 为研究污泥高温厌氧消化过程中零价铁（Fe0）对抗生素抗性基因的消减影响，采用荧光定量PCR方法定量检测了7种四环素抗性基因（TC-ARGs，包括tetA、tetC、tetG、tetM、tetO、tetW和tetX）及第一类整合子intI1基因在厌氧消化过程中的丰度变化，同时检测分析了挥发性脂肪酸（VFAs）的质量浓度变化，并探讨了目标基因与VFAs之间的相关关系.结果表明，适量Fe0（如0.10 g·g-1，以Fe0/VSS计）不仅可以强化污泥厌氧消化进程，显著提高总VFAs和乙酸的产生量，而且能够增强TC-ARGs和intI1基因的消减效果.尽管如此，过量Fe0（如1.17 g·g-1，以Fe0/VSS计）对污泥高温厌氧消化过程中TC-ARGs和intI1基因消减的增强效果并不显著，推测可能是由于基因水平转移的发生所导致的.通过相关性分析可知，TC-ARGs（除tetO基因外）和intI1基因与乙酸之间存在显著负相关性，表明乙酸可能对TC-ARGs和intI1基因的消减具有促进作用.
关键词: 零价铁      高温厌氧消化      四环素抗性基因      第一类整合子      挥发性脂肪酸     
Effect of Zero Valent Iron on the Decline of Tetracycline Resistance Genes and Class 1 Integrons During Thermophilic Anaerobic Digestion of Sludge
WEI Xin , XUE Shun-li , YANG Fan , LI Xiang , LIU Zhen-hong , XUE Gang , GAO Pin     
State Environmental Protection Engineering Center for Pollution Treatment and Control in Textile Industry, College of Environmental Science and Engineering, Donghua University, Shanghai 201620, China
Abstract: To investigate the effects of zero valent iron (Fe0) on the decline of antibiotic resistance genes during thermophilic anaerobic digestion of sludge, the abundances of seven tetracycline resistance genes (TC-ARGs, including tetA, tetC, tetG, tetM, tetO, tetW, and tetX) and class 1 integron gene (intI1) were quantified by quantitative PCR (qPCR). Also, the concentrations of volatile fatty acids (VFAs) were determined. The correlations between the abundances of TC-ARGs and intI1 gene and the concentrations of VFAs were discussed. The results showed that appropriate dose of Fe0 such as 0.10 g·g-1 VSS could enhance the anaerobic digestion process of sludge, and the production of total VFAs and acetic acid increased significantly. The decrease in the abundances of TC-ARGs and intI1 gene was also enhanced. However, excessive Fe0 such as 1.17 g·g-1 VSS could not further improve the reduction in the abundances of TC-ARGs and intI1 gene, probably resulted from the occurrence of horizontal gene transfer. The abundances of TC-ARGs except tetO gene, as well as intI1 gene exhibited significant negative correlation with the concentration of acetic acid, indicating that acetic acid probably had an enhanced effect on the decline of TC-ARGs and intI1 gene during thermophilic anaerobic digestion of sludge.
Key words: zero valent iron      thermophilic anaerobic digestion      tetracycline resistance genes      class 1 integrons      volatile fatty acids     

近年来，抗生素抗性基因(ARGs)作为一种新型污染物[1]，在环境水体、土壤、大气尘粒等环境介质中被频繁检出[2~6]，已成为生态环境安全和人体健康领域的一个关注热点.污水处理厂被认为是环境中ARGs的一个重要污染源[7]，而活性污泥作为细菌微生物的聚集体，为ARGs的演变和转移提供了良好的场所，同时也为其提供了集中去除的机会[8].

有研究表明[9]，厌氧消化可以有效地削减污泥中的ARGs，并且温度越高，污泥中四环素抗性基因(TC-ARGs)包括tetA、tetO、tetW和tetX，及第一类整合子intI1基因丰度下降越显著.此外，污泥厌氧消化工艺操作参数和环境条件对ARGs的消长行为同样具有较大影响，如污泥停留时间[10]、pH[11]，以及抗生素和重金属[12~14]等选择性因子. Feng等[15]研究发现，零价铁(Fe0)能够强化污泥的厌氧消化，促进乙酸的生成和污泥的减量.然而，目前关于Fe0在增强污泥厌氧消化过程中对ARGs的消减影响还鲜见报道.

本研究考察了Fe0对污泥高温厌氧消化过程的作用影响，采用荧光定量PCR (qPCR)分析方法对TC-ARGs和intI1基因进行定量检测，考察了Fe0对目标基因消减行为特征的影响，并探讨了挥发性脂肪酸(VFAs)与目标基因之间的相关关系，以期为污泥厌氧消化强化去除ARGs的工艺技术提供数据支撑.

1 材料与方法 1.1 接种污泥与反应底物

接种污泥取自上海松江污水处理厂二沉池剩余污泥，在室温下沉降4 h后倒去上清液，沉降污泥VSS质量浓度约为8.55 g·L-1.采用剩余污泥和餐厨垃圾的混合物作为厌氧消化反应底物，其中餐厨垃圾取自东华大学松江校区学生食堂，混合底物中餐厨垃圾：剩余污泥=2.79：1(干物质比)，混合后VSS质量浓度约为37.8 g·L-1，混合液溶解性有机物(SCOD)质量浓度约为25.4 g·L-1.

1.2 厌氧消化体系的建立及运行

厌氧消化装置为圆柱体反应器，容积为1 L，混合底物加入量约为30.3 g (以干物质计)，共3组，分别标记为AD-1、AD-2和AD-3，其中AD-1为对照组，AD-2和AD-3中添加有Fe0(粒径10~40 μm，购自国药集团化学试剂有限公司)，投加量(以Fe0/VSS计，下同)分别为0.10 g·g-1和1.17 g·g-1.采用机械连续搅拌方式，搅拌速度为120 r·min-1，反应温度通过水浴加热控制在(50±1)℃，pH值为7.1~7.6.厌氧消化反应周期为12 d，每隔2 d进行采样检测分析，每组样品设3个平行样.

1.3 检测分析方法 1.3.1 DNA提取

取一定量反应底物，采用TIANamp Siol DNA Kit (TIANGEN)进行DNA提取，提取步骤参照试剂盒操作说明书，所提取的DNA使用1%琼脂糖凝胶电泳和Qubit 2.0核酸蛋白测定仪(Invitrogen)检测其纯度和浓度.

1.3.2 TC-ARGs检测

本研究共选取7种在污泥中被频繁检出的TC-ARGs[9, 16]作为研究对象，分别为tetA、tetC、tetG、tetM、tetO、tetW和tetX基因，其中tetA、tetC和tetG为外排泵基因，tetM、tetO和tetW为核糖体保护基因，而tetX则属于酶修饰基因[17].此外，本研究同样检测了第一类整合子intI1基因，其能够捕获外源性基因以表达出多重抗药性特征[18]，对抗生素抗性基因的水平转移具有重要作用.

目标基因使用qPCR进行定量检测分析，所用扩增引物序列、扩增子大小和退火温度见表 1. qPCR反应体系总体积为20 μL，包括：FastStart Essential DNA Green Master (Roche) 10 μL，上下游引物(4 μmol·L-1)各1.5 μL，DNA模板1 μL，ddH2O 6 μL. qPCR热循环反应程序如下：95℃预变性10 min，95℃变性10 s，共40个循环，退火20 s，72℃延伸30 s，同时利用熔解曲线分析扩增产物的特异性.每组样品3个平行样，使用无菌水作为阴性对照.

表 1 qPCR反应所使用的基因引物信息 Table 1 Sequences of primers used for qPCR reactions

目标基因标准品委托生工生物工程(上海)有限公司合成，按梯度稀释(10-1~10-6)后进行qPCR反应可得各基因的标准曲线，所有qPCR反应扩增效率为88%~101%，相关系数r2>0.99.

1.3.3 VFAs测定

VFAs采用7900型气相色谱(天美)检测，使用氢火焰离子化检测器(FID)，色谱条件如下：TM-FFAP毛细管柱，载气为氮气，流速为60 mL·min-1，分流比为10：1，进样口和检测器温度为250℃.采用程序升温模式，在起始温度100℃下保持2 min，再以10℃·min-1升温速率升至190℃维持1 min，然后以30℃·min-1升温速率升至220℃，保持5 min.

1.4 数据分析

数据分析运用Origin 8.0和SPSS 19.0统计分析软件进行处理，计算因变量和自变量之间的皮尔逊相关系数(r)和P值，设置规定的统计检验显著性水平P=0.05，若P < 0.05认为具有显著相关性，反之则认为相关性不显著.

2 结果与讨论 2.1 Fe0对污泥厌氧消化过程中VFAs生成的影响

在整个污泥厌氧消化过程中，共检出2种不同的VFAs，包括乙酸和丁酸(正丁酸和异丁酸).从图 1可以看出，AD1装置中VFAs生成过程相对稳定，从厌氧消化第2~12 d时，VFAs质量浓度由237.4 mg·L-1逐步提高至436.8 mg·L-1，其中乙酸质量浓度由237.4 mg·L-1升高至377.0 mg·L-1，占VFAs总量比例达86.3%以上，表明本研究中污泥厌氧消化过程以乙酸型和丁酸型发酵为主.有研究显示[22]，乙酸型和丁酸型发酵属于严格厌氧过程，反应体系氧化还原电位(ORP)较低，而丙酸型发酵属于兼氧过程，反应体系ORP通常不宜低于-278 mV，否则不利于有机质转化为丙酸.在本研究中，污泥厌氧消化过程ORP经测定在-400~-300 mV之间，由此可推测丙酸型发酵过程受到抑制，反应环境条件有利于乙酸和丁酸的生成，这与厌氧消化上清液中VFAs检测结果是一致的.

图中数据为3个平行样取平均值，下同 图 1 Fe0对污泥厌氧消化过程中VFAs生成的影响 Fig. 1 Effect of Fe0 on VFAs production during sludge anaerobic digestion

由图 1分析可知，当Fe0投加量分别为0.10 g·g-1(AD2)和1.17 g·g-1(AD3)时，厌氧消化上清液VFAs质量浓度在第2 d时分别约为940.9 mg·L-1和3 277.1 mg·L-1，到第12 d时则分别高达1 594.7 mg·L-1和5 657.6 mg·L-1，与AD1相比分别提高了约2.6和12.0倍.其中，乙酸质量浓度升高显著，到第12 d时分别高达1 326.7 mg·L-1和4 159.0 mg·L-1，表明Fe0的加入不仅可以加快污泥厌氧消化进程，而且可以大幅度提高VFAs的生成量，这主要是因为Fe0是一种性能优良的还原材料[23]，可以快速降低反应体系的ORP，增强污泥有机质的厌氧消化. Feng等[15]研究同样发现，当加入质量浓度为20 g·L-1的Fe0时，污泥厌氧消化体系VFAs产量提高了37.3%，其中乙酸质量浓度由未投加Fe0的759.2 mg·L-1提高至1 303.1 mg·L-1.

2.2 污泥厌氧消化过程中TC-ARGs和intI1基因的变化特征

图 2为7种不同的TC-ARGs和intI1基因丰度在污泥厌氧消化过程中的变化情况.从中可以看出，在厌氧消化周期12 d内，所有TC-ARGs丰度均呈现出逐渐降低的变化趋势，其中tetO基因降幅最小，约0.6个数量级，而tetC基因降幅最大，达3个数量级，表明高温厌氧消化可以有效地降低污泥中的TC-ARGs，这与Ma等[10]的研究结果相似.与此同时，TC-ARGs在第8 d时已基本降至最低，继续延长反应时间对TC-ARGs的消减影响并不显著(P > 0.05).分析原因推测可知，在污泥高温厌氧消化过程前期，携带有TC-ARGs的细菌微生物进行新陈代谢逐渐消亡，从而导致TC-ARGs丰度的降低.此外，质粒消除和转座过程的发生也有可能是其下降的原因之一[9].活性污泥本身成分复杂，微生物量丰富，细菌细胞之间相互接触紧密，并且含有多种可导致ARGs产生、增殖和传播的选择性因子，能够增强细菌细胞通过基因水平转移获得ARGs，从而改变ARGs在厌氧消化过程中的变化行为[8].因此，当携带有TC-ARGs的细菌微生物消亡速率与其通过基因水平转移转入其他细菌遗传因子的速率达到平衡时，TC-ARGs丰度可基本维持在较为稳定的水平.

图 2 TC-ARGs和intI1基因丰度在污泥厌氧消化过程中的变化情况 Fig. 2 Absolute quantities of TC-ARGs and intI1 genes during sludge anaerobic digestion

此外，intI1基因在污泥厌氧消化过程中同样呈现出逐渐降低的趋势，到第12 d时降幅可达2.2个数量级，去除率高达99.4%，表明高温厌氧过程可以有效地削减intI1基因的丰度.

从图 2分析可知，Fe0的加入不仅加快了TC-ARGs和intI1基因的消减速率，而且增强了其消减效果.当Fe0投加量为0.10 g·g-1(AD2)时，各目标基因丰度降幅达2.0(tetO)~4.3(tetW)个数量级.与未投加Fe0的AD1系统相比，AD2中tetA、tetG、tetO和tetW基因丰度降低显著(P < 0.05)，降幅分别提高了1.2、1.6、1.4和3.2个数量级.尽管如此，当Fe0投加量为1.17 g·g-1(AD3)时，各目标基因丰度降幅为1.6(tetM)~3.1(tetX)个数量级.与AD2系统相比，AD3系统中所有目标基因丰度降幅变小(tetO基因除外，基本维持不变)，且tetA、tetG和tetW基因丰度降幅显著(P < 0.05)，分别达1.2、1.3和2.3个数量级，表明过量的Fe0对污泥厌氧消化过程中TC-ARGs和intI1基因消减的增强效果并不显著，推测可能是因为过量Fe0体系中细菌微生物胞外电子传递过程较为频繁，从而强化促进了TC-ARGs的基因水平转移，具体机制过程还需进一步探讨研究.

2.3 相关性分析

由表 2数据分析可知，在AD1系统中，除tetO基因外，其余TC-ARGs和intI1基因与乙酸之间存在显著负相关性(-0.833 > r > -0.975，P < 0.05)，表明污泥厌氧过程中乙酸的质量浓度变化对TC-ARGs和intI1基因的消减具有较大影响. Ghosh等[24]研究同样发现，两段式高温/中温厌氧消化过程对tetX和intI1基因去除效果显著，但对tetO基因的消减影响稍差.然而，有研究显示[25]，乙酸可与钙、镁等二价阳离子进行结合形成配合物，从而提高四环素分子的微生物可利用性，增强TC-ARGs的抗性表达，表明乙酸可以间接地影响TC-ARGs的变化特征.因此，针对污泥厌氧消化过程中乙酸的存在和变化对TC-ARGs及intI1基因的消减影响及内在作用机制还有待继续深入探讨.

表 2 污泥厌氧消化过程中VFAs与TC-ARGs和intI1基因相关性分析1) Table 2 Correlation analysis between VFAs and TC-ARGs and intI1 genes during sludge anaerobic digestion

此外，从表 2还可以发现，AD2系统中乙酸与tetO基因之间存在显著负相关性，表明Fe0的加入可以强化对tetO基因的消减.尽管如此，在AD3系统中并未发现乙酸与目标TC-ARGs和intI1基因之间存在显著相关性，这与上述Fe0对TC-ARGs和intI1基因丰度变化特征结果是相一致的.与乙酸相比，污泥厌氧消化过程中丁酸与TC-ARGs和intI1基因之间相关性并不显著(P > 0.05)，表明丁酸的产生和变化对TC-ARGs和intI1基因的消减影响较小.

3 结论

(1)在污泥高温厌氧消化系统中加入Fe0不仅能够加快消化反应进程，同时可以大幅度提高总VFAs和乙酸的产生量，并且随着Fe0投加量的增大而升高.

(2)高温厌氧消化可以有效地降低污泥中TC-ARGs和intI1基因丰度，且适量的Fe0可以强化目标基因的进一步消减，但过量的Fe0对目标TC-ARGs和intI1基因去除效果的增强不显著，推测可能是由于基因水平转移的发生所导致的.

(3)由相关性分析结果可知，TC-ARGs (除tetO基因外)和intI1基因与乙酸之间存在显著负相关性，表明乙酸浓度的升高对TC-ARGs和intI1基因的消减具有促进作用.相比之下，丁酸对TC-ARGs和intI1基因的消减影响较小.

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