2017, Vol. 38
利用城市生活污水培养富油微藻，在净化水质的同时收获微藻以制取生物柴油，是当前解决水环境污染和能源危机的一个有效途径.微藻生物柴油属于可再生能源，且净能量回收率更高[1].就整体工艺而言，微藻生物柴油的生产包括微藻培养、收获、提脂与转脂，但与其他原料不同的是，微藻个体微小(直径约为2~20μm)，在水中不易沉淀絮凝，几乎所有微藻培养方式所获得的都是固体含量在0.02%~0.05%的稀溶液[2]，微藻质量浓度低(0.3~5 g·L-1)[3]，使得微藻收获成本巨大. Richardson等[4]研究表明，在户外培养生产系统中收获费用所占比例在运营成本里排名第一，在整个资本输出中排名第二.因此找到高效节能收获方式已成为降低微藻生物柴油成本，实现其工业化的重要挑战.
除传统的离心沉降、絮凝过滤、浮选等方法外[5]，2012年Zhang等[6]证明丝状真菌能够共培养收获微藻，Zhou等[7]也利用丝状真菌收获微藻并显示pH对菌藻共成球影响巨大. Xie等[8]利用刺孢小克银汉霉孢子悬液收获微藻，Zhou等[9]利用米曲霉分别探索在自养条件和异养条件小球藻的收获效率. Xia等[10]对不同条件下毛霉菌的球化生长及脂肪累计进行研究得到细胞成球与生物质积累成正相关.除接种丝状真菌孢子悬液共培养收获微藻外，Wrede等[11]还发现可先将烟曲霉单独培养成球，再将球状真菌加到藻液中，在适宜条件也能收获微藻且效率良好.刘洁霞[12]研究通过降低培养基pH值诱导原位絮凝采收高生物量微藻，最佳采收效率达90%，利用自絮凝藻在酸性条件下有效提高目标藻的采收效率，使淡水小球藻和若夫小球藻的采收效率上升到80%.本研究利用卷枝毛霉孢子悬液与小球藻共培养，通过过滤含藻菌球来收获微藻.优化了最佳收获条件，验证了丝状真菌收获微藻在实际污水中的可行性，并初步探究得出卷枝毛霉共培养收获微藻机制主要为电中和吸附.
1 材料与方法 1.1 材料11培养基进行保存.所用卷枝毛霉(Mucor circinelloides)从广东微生物菌种中心购买(菌种号GIM3.521)，接种于综合马铃薯培养基(Synthetic Potato Medium)斜面内培养3代活力恢复后使用.
实验所用人工污水配方为：依次取尿素、MgSO4·7H2O、葡萄糖、(NH4)2SO4、CaHPO4·2H2O、NaHCO2各0.150、0.075、0.300、0.075、0.030、0.300 g，微量元素液6 mL，溶解于1 000 mL自来水中.微量元素液配制方法：依次取CoCl2·6H2O、FeCl3·6H2O、Na2MoO4·2H2O、Na2EDTA、MnCl2·4H2O、ZnCl2·6H2O各2.0 mg、97.0 mg、4.0 mg、0.75 g、41.0 mg、5.0 mg溶解于1 000 mL蒸馏水中[13, 14].配水水质见表 1，大学城实际生活污水水质见表 2.
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表 1 人工污水水质 Table 1 Water quality of artificial sewage |
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表 2 大学城生活污水水质 Table 2 Water quality of University City sewage |
1.2 实验方法 1.2.1 丝状真菌孢子悬液的配制
将稳定后的真菌接种于SPM培养基平板内，28℃恒温培养6~7 d，在无菌操作台(SW-CJ-2FD苏州净化设备有限公司)内用10 mL灭菌蒸馏水将平板内的孢子洗至50mL灭菌锥形瓶内，用血球计数板计数并记录.
1.2.2 菌藻共培养实验前分别对小球藻藻液和卷枝毛霉孢子悬液进行计数，确定藻液体积后即可按初始真菌孢子数与微藻细胞数之比(菌藻比)计算得到卷枝毛霉孢子悬液的接种体积.实验条件下得到共培养混合液后置于28℃，150 r·min-1恒温摇床内培养48 h观察测定记录数据.
1.3 分析方法 1.3.1 微藻光学密度的测定根据朗博比尔定律，在一定的质量浓度范围内，微藻质量浓度与光学密度(optical density，D值)成正比，研究表明微藻细胞密度与藻种在特征波长下的D值之间存在着一定的线性关系[15].可以用D值来近似表征微藻的生物量反应微藻的生长情况.经本课题组前期光谱扫描结果，选择在681 nm波长用紫外分光光度计(UV765上海精密科学仪器有限公司)，测量小球藻的D值.
1.3.2 微藻叶绿素浓度的测定由于实际污水中其他颗粒物以及微生物的存在，D值误差过大，不能很好地表征污水中微藻细胞浓度的变化.而在生活污水中几乎不存在其他含有叶绿素的微生物，因此在生活污水中选择使用叶绿素仪(YSI600CHLYSI美国维赛仪器公司)测定叶绿素浓度来表征微藻的生物反应其生长情况.
1.3.3 微藻收获效率的测定收获效率计算公式如下：
R=[1-(N0/Nt)]×100
式中，R为收获效率(%)；N0为收获前藻液的初始细胞密度；Nt为收获后藻液的细胞密度.采用共培养前藻液与菌藻成球后经纱布过滤后滤液的D值或叶绿素浓度来代表细胞密度进行计算.
1.3.4 多糖与单糖的测定本研究采用蒽酮-硫酸法测定水样中的多糖质量浓度，灵敏度高，糖含量在30 μg左右就能进行测定[16].以葡萄糖为标准物质用蒽酮硫酸法绘制标准曲线；取培养液在离心机(H-185长海湘仪离心机仪器有限公司)内以8 000 r·min-1转速离心10 min；取上清液以0.45 μm滤膜过滤得到水样用蒽酮硫酸法测定其多糖质量浓度.采用3，5-二硝基水杨酸(DNS)法测定水样中的还原糖质量浓度，操作简便快速，杂质干扰小[17].同样以葡萄糖为标准物质利用DNS法绘制标准曲线，随后取上述水样用DNS法测算其还原糖质量浓度.
实验对卷枝毛霉、小球藻单独培养时与二者共培养前后培养基多糖质量浓度进行测定时，为排除其他干扰，采用人工配水培养的藻液进行实验.取小球藻液接入卷枝毛霉孢子悬液，作为菌藻共培养液；取藻液离心后，上清液经0.45 μm的滤膜过滤，滤液接入卷枝毛霉孢子悬液，作为真菌卷枝毛霉单独培养液；取小球藻藻液，不接入卷枝毛霉孢子悬液，作为小球藻单独培养液.
1.3.5 样品中Zeta电位的测定本研究采用英国马尔文公司生产的型号为Zetasizer Nano ZS90的纳米粒度及Zeta电位分析仪对微藻及丝状真菌细胞表面的Zeta电位进行测量.
2 结果与讨论 2.1 卷枝毛霉收获微藻的条件优化 2.1.1 初始pH对收获效率的影响由于pH对真菌成球影响较大，根据前期实验选定7.0、6.5、6.0、5.5这4个pH梯度，命名为1、2、3与4组，以小球藻藻液为空白组进行实验.设定菌藻混合液菌藻比为1：350，葡萄糖质量浓度为1.0 g·L-1.实验结果如表 3、图 1和图 2所示.
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表 3 不同pH各组生长收获记录1) Table 3 Harvest record with different initial pH conditions |
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图 1 不同pH各组培养前后pH变化 Fig. 1 The pH change before and after the culture with different initial pH conditions |
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图 2 初始pH对收获效率的影响 Fig. 2 Effect of initial pH on harvest efficiency |
由表 3可知，当菌藻混合液初始pH为7.0时，卷枝毛霉能够生长但是不能成球；当菌藻混合液初始pH为6.5时3组平行有一组能够成球，其余两组均未能成球；当菌藻混合液初始pH为6.0时均能菌藻共生长成球，且微藻生长良好；而当混合液初始pH为5.5时，3组平行均能菌藻共生长成球，但微藻死亡，因此确定卷枝毛霉与小球藻共培养的最适pH为6.0.
由图 1可知，随着菌藻混合液初始pH降低，除1组外，混合液终末pH也随之降低，且pH变化率逐渐增大，当初始pH为6.0和5.5时，变化率接近50%.
由图 2可知，随着混合液初始pH的下降，微藻收获率呈先增加后降低的趋势，在pH为6.0时，收获效率达最大为81.23%.可以理解为当菌藻混合液的初始pH为7.0时，由于溶液环境为中性，卷枝毛霉不能成球收获小球藻，但由于将藻液的pH值由9.43降低至7.0，改善了微藻生活环境，故小球藻浓度较之前有所增长，因此收获效率为负.而当菌藻混合液初始pH小于6.0以后，由于终末pH剧烈下降，导致微藻生活环境恶化，部分微藻死亡，故微藻收获效率有所下降.
2.1.2 菌藻比对收获效率的影响选定1：250、1：300、1：350、1：400、1：450这5个水平，依次命名为1、2、3、4和5组，以小球藻藻液为空白组进行实验.菌藻混合液初始pH为6.0，保持葡萄糖质量浓度为1.0 g·L-1.实验结果如表 4、图 3和图 4所示.
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表 4 不同菌藻比各组生长收获记录1) Table 4 Harvest record with different bacteria and algae ratios |
由表 4可知，除空白组外，不同梯度的菌藻比培养后卷枝毛霉与小球藻均能成球.由图 3可知，不同梯度的菌藻比，其始末pH变化率相差不大，随着菌藻比的降低，pH的变化率逐渐增大.由图 4可知，随着菌藻比的下降，小球藻的收获效率呈现出一个先降低后增加的趋势，在菌藻比为1：250时，收获率达最大值为86.12%.
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图 3 菌藻比实验pH变化 Fig. 3 The pH change with different bacteria and algae ratios |
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图 4 菌藻比对收获效率的影响 Fig. 4 Effect of bacteria and algae ratio on harvest efficiency |
选定0.5、1.0、1.5、2.0、3.0 g·L-1这5个水平进行实验，依次命名为1组、2组、3组、4组、5组，以小球藻藻液为空白组进行实验.菌藻混合液初始pH为6.0、菌藻比为1：250.实验结果如表 5、图 5和图 6所示.
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表 5 不同葡萄糖质量浓度生长收获记录1) Table 5 Harvest record with different glucose concentrations |
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图 5 葡萄糖质量浓度实验pH变化 Fig. 5 The pH change with different glucose concentrations |
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图 6 葡萄糖质量浓度对收获效率的影响 Fig. 6 Effect of glucose concentration on harvest efficiency |
由表 5可知，当菌藻混合液中无葡萄糖时，卷枝毛霉因缺少碳源不能生长，其余各组菌藻均能共培养成球.由图 5可知，随葡萄糖质量浓度不断增大，pH变化率逐渐增大，即在相同菌藻混合液pH条件下，葡萄糖质量浓度越大，终末pH越低.因此，混合液中酸性物质主要来源于真菌代谢葡萄糖所产生的某些副产物.由图 6可以看出，随葡萄糖质量浓度的上升，微藻收获率呈先增加后下降的趋势，在葡萄糖质量浓度为1.0 g·L-1和1.5 g·L-1时，收获率达最大分别为92.76%和93.19%.故选取葡萄糖质量浓度1.0~1.5 g·L-1为最适葡萄糖范围.
2.1.4 多因子对收获效率的影响考虑到pH、菌藻比以及葡萄质量浓度之间的相互作用，根据单因子试验结果，对3个因子及其最佳水平范围进行正交试验，以L27(313)正交表进行实验，所选因子及对应水平如表 6所示.对各因子的水平进行随机化处理，实验条件及结果如表 7所示.
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表 6 正交试验因子及水平 Table 6 Factors and levels of orthogonal experiment |
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表 7 正交试验结果 Table 7 Result of orthogonal experiment |
从正交试验结果表 7来看，菌藻共培养的最优条件为：pH=6.0，葡萄糖质量浓度1.25 g·L-1，菌藻比为1：250.这与Zhou等[9]在异养培养条件下，当米曲霉孢子浓度为1.2×104个·mL-1、葡萄糖质量浓度为20 g·L-1、pH为4~5时，小球藻的收获效率最佳的实验结果相比，pH更接近中性更易调控，且葡萄糖的用量减少了93.75%，在保证了收获效率的同时，收获成本得到降低.
为估计试验误差大小并判断各因素及其交互作用的显著程度，对正交试验结果数据进行方差分析，提高F检验的灵敏度.结果如表 8所示：因素pH、葡萄糖质量浓度以及pH与葡萄糖质量浓度的交互作用对收获效率影响高度显著，其中pH的影响最大；而菌藻比、pH与菌藻比的交互作用对收获效率有影响；葡萄糖与菌藻比的交互作用影响不显著.这与之前的实验结果相吻合，pH对卷枝毛霉能否成球起关键作用，而葡萄糖是卷枝毛霉生长的必备碳源，故二者及二者的交互作用对收获效率有着决定性的作用.
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表 8 正交试验方差分析 Table 8 Variance analysis of orthogonal result |
2.1.5 收获条件的污水验证
由于实际生活污水水质水量的波动，对小球藻培养及采收存在一定影响，因此在前期的实验中主要以人工配水为主以便排除干扰，对卷枝毛霉收获小球藻的条件进行定性定量分析以及重复实验.为了确定在人工污水实验条件下得出的共培养收获条件，能否适用于在实际生活污水中培养的微藻，将正交试验优化出的最佳收获条件应用于实际污水培养的小球藻收获.将大学城实际生活污水用纱布过滤，取适量滤液按10%比例接种小球藻后置于室外培养，每天测定其D值待小球藻生物量稳定后进行收获实验.实验条件为2.1.4节的最优条件.
结果证明，以人工配水为培养基培养的小球藻和卷枝毛霉共培养的收获效率为91.08%；以生活污水为培养基培养，收获效率略高于以人工配水培养的小球藻，为92.33%.因此在以人工配水为培养基的条件下得出的最佳收获条件仍然适用于实际污水中小球藻的收获.同时生活污水水质变化导致收获效率波动较大.
2.2 收获机制的初步探索 2.2.1 胞外聚合物多糖对收获的影响菌藻共培养组命名为G组，真菌卷枝毛霉单独培养组命名为J组，小球藻单独培养组命名为Z组.菌藻共培养条件为正交试验优化所得的最佳收获条件.每组3个平行，置于28℃，150r·min-1恒温摇床内培养48 h，测定各组培养前后，培养基内多糖的质量浓度.实验结果如图 7和图 8所示.
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图 7 蒽酮硫酸法所测多糖对比 Fig. 7 Polysaccharide measured by anthrone-sulfuric acid method |
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图 8 DNS法所测多糖对比 Fig. 8 Polysaccharide measured by DNS method |
由图 7和图 8可知，蒽酮硫酸法测定培养前溶液的多糖质量浓度约为1.32g·L-1，经过48 h培养后，除Z组外，其余两组的多糖质量浓度都接近于零，其中J组的葡萄糖质量浓度变化率最大，降幅比达98.33%；用DNS法测定培养前溶液多糖质量浓度约为1.16 g·L-1，经过48 h培养后，同样，除Z组外，其余两组多糖质量浓度趋于零，两组下降幅度均接近100%.
蒽酮硫酸法测定的是溶液中总糖质量浓度，DNS法主要测的是溶液中还原糖质量浓度，主要为其中葡萄糖质量浓度，因此不论培养前后，溶液中蒽酮硫酸法所测结果均高于DNS法所测结果. DNS法测定的多糖质量浓度变化情况主要反映的是溶液中所添加的葡萄糖变化情况.因此由蒽酮硫酸法所测定总糖质量浓度减去所添加的葡萄糖总量，剩余多糖质量浓度反映的才是小球藻与卷枝毛霉分泌的多糖变化情况，两者相减后数值变化如图 9所示.
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图 9 蒽酮硫酸法与DNS法所测多糖质量浓度的差值变化 Fig. 9 Difference between the polysaccharide concentrations measured by anthrone-sulfuric acid method and DNS method |
由图 9可知，Z组在培养48 h后多糖质量浓度有所增加，增加量0.047 g·L-1，而J组与G组培养后多糖质量浓度均大幅度下降，G组培养后多糖质量浓度为0.024 g·L-1，略高于J组的0.019 g·L-1.由此推断，微藻单独培养时会向溶液中分泌某种多糖物质，这种多糖物质正好可以被卷枝毛霉分解利用.因此，培养后Z组多糖质量浓度有所增加，J组多糖质量浓度大幅下降；菌藻共培养时，小球藻仍会向外分泌此类多糖供卷枝毛霉利用，二者有一定共生作用.因此培养后G组中多糖质量浓度高于J组.
2.2.2 细胞表面电荷对收获的影响实验取适量小球藻藻液离心，取上清液过滤液作为培养基，添加少量葡萄糖后接种适量卷枝毛霉孢子悬液，培养一段时间待真菌长成，用盐酸调节溶液呈不同pH值，测定卷枝毛霉细胞表面的Zeta电位值；另取适量藻液直接用盐酸调节溶液pH，测定小球藻细胞表面的Zeta电位值.结果如图 10所示.
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图 10 不同pH条件下菌藻细胞表面Zeta电位值 Fig. 10 Zeta potential of the Bacterial and algal cell surface under different pH conditions |
由图 10可知，小球藻细胞表面的Zeta电位值变化波动不大，基本维持在-25 mV至-20 mV范围内，全部为负.卷枝毛霉细胞表面的Zeta电位值，当培养液pH值大于7.0时，没有明显变化；当培养液pH值小于7.0时，随着pH值的变小，Zeta电位值急剧增大.
Zeta电位一般用来评价或预测微粒分散体系的物理稳定性，是对颗粒之间相互排斥或吸引力强度的度量.当其数值维持在一个相对稳定的范围时，分散体系趋于稳定，Zeta电位的绝对值越高，体系越稳定，越低越倾向于凝聚或凝结[18].因此单独培养时，微藻细胞表面电荷随藻液pH变化无明显波动，Zeta电位相对稳定，使溶液体系内排斥力占主导地位，故微藻细胞稳定分散于藻液中；而卷枝毛霉细胞表面电荷量随溶液进入酸性后，急剧下降，Zeta电位绝对值不断降低，排斥能不断下降，最终导致菌体间吸引力超过了排斥力，因而分散被破坏，使得真菌发生凝结或凝聚.
由上可知，当调节菌藻混合液初始pH为弱酸性菌藻共培养时，卷枝毛霉利用小球藻分泌的葡萄糖生长代谢并不断向混合液分泌释放酸性物质致使混合液pH不断下降，使得真菌细胞表面电荷不断被中和，Zeta电位逐步下降，同时也破坏了小球藻细胞间稳定性，使得菌藻细胞间排斥能不断下降，最终导致小球藻向卷枝毛霉细胞周围凝聚最后在重力作用下沉淀.这也正是当调节菌藻混合液pH=6.0后静置培养时，长出的卷枝毛霉菌块上会吸附着大量小球藻的原因.
这与Liu等[19]通过投加硝酸降低培养液pH使自絮凝藻细胞表面接收质子而使得其电荷为正，从而吸引目标藻形成絮体而沉降下来的研究有类似之处.本文中的真菌与Liu等研究中自絮凝藻具有相似之处.本文中菌藻二者Zeta电位值均为负，故而排除正负胶体以及异号电荷间的吸附架桥作用.由此推断，致使菌藻相互吸附的主要机制为电中和吸附；但卷枝毛霉菌丝的存在，不排除菌丝通过氢键、共价键作用对微藻进行吸附的可能性.
2.2.3 卷枝毛霉菌丝对收获的影响对卷枝毛霉收获微藻后形成的菌球进行镜检，结果如图 11，小球藻紧密地围绕在卷枝毛霉菌丝四周，而各菌丝又相互缠绕，使得小球藻被牢固地固定在菌球内，形成了蓝绿色菌球.
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图 11 含藻菌球镜检图 Fig. 11 Microscopic examination of algae-bacteria pellets |
在混合液摇晃过程中，小球藻与卷枝毛霉菌丝相互碰撞，并在电中和作用下被吸附至菌丝周围；同时，菌丝在液体摇动的过程中相互缠绕形成絮状小球，并通过卷扫作用逐步吸附其余藻体，最终形成菌藻密不可分的真菌微藻球使得微藻被大量收获.
综上所述，解释了前文正交试验结果中pH与葡萄糖质量浓度对收获效率影响高度显著的原因，对收获条件变化会导致收获效率变化的规律有了一定了解.由此可以根据具体收获情况，调整收获条件同时保证一个较高的收获效率，例如在卷枝毛霉收获小球藻时，可以提高葡萄糖质量浓度，维持原菌藻混合液初始pH.
3 结论(1)以人工配水为培养基，收获效率为指标，通过单因子试验和正交试验得到最佳收获条件为：pH=6.0，葡萄糖质量浓度为1.25 g·L-1，菌藻比为1：250，收获效率为91.08%.并验证此收获条件完全适用于实际污水中小球藻的收获，其收获效率可达92.33%.
(2)对培养前后溶液中多糖质量浓度进行测定，发现小球藻在培养48 h后多糖质量浓度较培养前增加了约0.047 g·L-1.而菌藻共培养后的混合液中多糖质量浓度为0.019 g·L-1.由此可知在菌藻共培养过程中，小球藻会向外分泌某些水溶性多糖物质供卷枝毛霉利用，二者有一定的共生作用.
(3)对小球藻和卷枝毛霉细胞表面Zeta电位进行测量发现，小球藻细胞表面Zeta电位值随藻液pH变化波动不大.而卷枝毛霉细胞表面Zeta电位值，随pH值变小，电位值可由原先最高-37.7 mV升至-9.87 mV.由此推断菌藻相互吸附主要机制为电中和吸附.
(4)通过上述实验确定卷枝毛霉收获过程.首先卷枝毛霉利用小球藻分泌的多糖进行代谢活动，产生酸性物质导致混合液pH不断降低，直至产生电中和作用致使小球藻被吸附至卷枝毛霉菌丝周围；然后，菌丝随液体摇动相互缠绕将吸附在其表面的小球藻不断包裹进去形成絮状小球，同时絮状小球还可通过卷扫作用进一步吸附其余藻体，最终形成菌藻密不可分的真菌微藻球.
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