2017, Vol. 38
2. 江苏省厌氧生物技术重点实验室, 无锡 214122;
3. 江苏高校水处理技术与材料协同创新中心, 苏州 215009;
4. 宁波市城市排水有限公司, 宁波 315000
2. Jiangsu Key Laboratory of Anaerobic Biotechnology, Jiangnan University, Wuxi 214122, China;
3. Jiangsu College of Water Treatment Technology and Material Collaborative Innovation Center, Suzhou 215009, China;
4. Ningbo Municipal Drainage Co., Ltd., Ningbo 315000, China
随着工业及社会经济的迅速发展，水体富营养化污染日益严重，水中氮素污染的去除已成为当今水污染防治领域的热点问题.近年来，污水处理排放标准日益严格，污水中总氮的去除难度也将逐渐提高.理论认为，生物脱氮由硝化反应和反硝化反应协同完成[1]，反硝化作用通过反硝化酶系在缺氧/厌氧条件下的活性表达而实现总氮的去除[2].传统活性污泥法、好氧颗粒污泥[3]和人工湿地[4]等技术都是基于硝化反硝化的脱氮技术.然而近年来涌现的厌氧氨氧化和好氧反硝化等技术则有别于传统生物脱氮理论，其中随着Robertson等[5]对好氧反硝化菌和好氧反硝化酶系的研究逐步深入，越来越多的研究发现反硝化过程不仅可以在缺/厌氧条件下发生，在好氧条件也能进行并具有较好的脱氮效果[6~9].
完全混合式曝气系统具有占地面积较小，投资和能耗较低[10]，抗冲击负荷能力较强的优点，曝气系统内各点底物浓度，污泥浓度和需氧速率相同，为系统内同步硝化反硝化发生提供了基础.到目前为止对同步硝化反硝化作用机制存在不同认知：微环境理论认为物质传递(有机物、电子受体)、菌胶团结构及各类微生物分布和活动等致使菌胶团内部形成多种多样的微环境类型，为同步硝化反硝化的存在创造可能[11]；而从生物学角度阐释同步硝化反硝化机制则始于对好氧反硝化菌株Thiosphaera pantotropha的研究，好氧反硝化菌细胞内存在不受DO抑制的反硝化酶系统，其好氧反硝化能力与胞内特殊硝酸盐还原酶--周质硝酸盐还原酶表达密切相关[12]，Huang等[13]对具有好氧反硝化功能的菌株DNA进行周质硝酸盐还原酶亚基基因napA扩增，得到了明显的DNA特异条带，证明了好氧反硝化菌可以表达周质硝酸盐还原酶.但目前基于完全混合式曝气系统同步硝化反硝化的形成条件和污泥微生物菌种结构解析的研究还相对较少，从而限制了完全混合式曝气系统的发展与应用.
因此，本文以无锡市某污水处理厂100 t·d-1完全混合式曝气系统的运行为出发点，通过进出水水质分析，研究系统对污染物的去除效能；结合反硝化速率静态试验，阐明系统污泥在好氧条件下的反硝化脱氮能力；通过周质硝酸盐还原酶PCR扩增和高通量测序技术，对系统污泥微生物菌群结构和多样性进行解析，并确定系统内优势菌群，以期为完全混合式曝气系统的反硝化脱氮应用提供理论依据和技术支撑.
1 材料与方法 1.1 完全混合式曝气系统运行完全混合式曝气系统(中试规模)在无锡某城镇污水处理厂运行，系统为钢板池体，长约为10 m、宽为1.5 m、高为3.5 m，设计处理能力为100 t·d-1，工艺流程如图 1所示.原水通过进水泵进入生化罐，然后依次流经生化池1、生化池2和生化池3，生化罐及各生化池底部均布置穿孔管曝气，最后进入过滤沉淀池进行泥水分离(利用沉淀池中部微孔过滤器进行泥水分离，微孔滤料孔径为0.45 μm，对反应器内污泥进行截留)，处理后出水外排.系统包括两套回流系统，分别维持生化罐和生化池内的污泥浓度.系统自2011年启动运行，效果稳定，2015年春节前停止运行，春节后再次启动，运行参数如下：进水流量为3 m3·h-1，HRT为10~12 h，SRT大于30 d，反应器内污泥浓度为7~10 g·L-1，回流比Q1为150~200%，Q2为200%，DO设定为1~3 mg·L-1，滤料反冲洗频率为8 h.污泥来源于污水处理厂好氧池.
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图 1 系统工艺流程 Fig. 1 Schematic diagram of completely mixed aeration system |
完全混合式曝气系统进水取自污水处理厂提升泵房之前深度约4.5 m左右的污水，水质如表 1所示.
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表 1 污水处理厂进水水质/mg·L-1 Table 1 Influent quality of wastewater treatment plant/mg·L-1 |
1.3 试验方法 1.3.1 污染物指标测定
COD、NH4+-N、TN、NO2--N和NO3--N通过标准方法进行测定[14]；DO、pH采用Multi3410型溶氧仪测定.
1.3.2 反硝化模拟试验为了验证完全混合式曝气系统中污泥在不同DO梯度下的反硝化活性差异，对系统污泥进行反硝化模拟试验.共设置3组试验，控制温度为20℃，初始硝态氮浓度45 mg·L-1，以无水乙酸钠为碳源，按C/N=7投加，采用微曝气供氧，反应过程DO浓度分别控制为0.1~0.2、1.0~2.0和2.0~3.0 mg·L-1，污泥浓度均控制为4 000 mg·L-1左右(MLVSS/MLSS=0.52).分别在反应第0、30、60、90、120、150、180、210和240 min取样，将取出的混合液过滤后测定其硝酸盐浓度.最后根据不同时刻硝酸盐浓度变化与测定混合液中MLVSS的值，计算反硝化速率.
1.3.3 同步硝化反硝化能力测定[15]完全混合式曝气系统的同步硝化反硝化能力(simultaneous nitrification and denitrification，SND)可以通过计算同步硝化反硝化率[式(1)]和同步硝化反硝化速率[式(2)]得到：
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(1) |
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(2) |
式中，Efficiency(SND)为同步硝化反硝化率(%)；R(SND)为同步硝化反硝化速率mg·(L·h)-1；NH4(oxidized)+为NH4+-N的消耗量(mg·L-1)；NOx(produced)-为NO3--N和NO2--N的生成量(mg·L-1)；t为运行时间(h).
1.3.4 总DNA提取及测序取适量系统污泥样品放入2 mL离心管内，充分振荡30 s，在10 000 r·min-1条件下离心1 min，弃去上清液.样品经预处理后采用MoBio PowerSoil DNA Isolation Kit试剂盒提取污泥样品中微生物总宏基因组，然后用NanoDrop 2000超微量分光光度计检测DNA的浓度和纯度，最后置于-20℃下保存备用.测序工作由上海晶能生物技术有限公司完成，测序仪器(平台)为Illumina MiSeq，采用Trimmomatic软件对序列进行去杂，采用Qiime软件进行群落丰度计算.
1.3.5 周质硝酸盐还原酶亚基基因(napA)的PCR扩增由于污泥长期在完全混合式曝气系统中驯化，因此对系统污泥中是否存在好氧反硝化菌进行鉴定.采用周质硝酸盐还原酶亚基基因保守区的一部分序列为引物[16]，引物NAP1(5′-TCTGGACCATGGGCTTCAACCA-3′)和NAP2(5′-ACGACGACCGGCCAGCGCAG-3′)，扩增产物长度为877bp. PCR反应体系(50 μL)：10×buffer 4 μL，dNTP2 μL，引物NAP1和引物NAP2各1 μL，模板DNA 1 μL，Taq酶(10 000 U·mL-1)0.8 μL，重蒸水38.2 μL. PCR程序如下：94℃变性5 min；然后进行30个循环：94℃，30 s；59℃，30 s；72℃，60 s；最后72℃延伸7 min. PCR产物采用1.5%琼脂糖凝胶电泳进行验证.
2 结果与讨论 2.1 COD去除效果完全混合式曝气系统对冲击负荷表现出较好的抵抗能力，系统稳定运行后，尽管进水COD浓度波动较大，但出水COD较稳定，基本维持在7.8~35.3 mg·L-1，平均值为17.1 mg·L-1，优于GB 18918-2002的一级A排放标准，COD去除率为82.4%~98.3%，平均去除率为93.2%.结果表明维持系统较高的污泥浓度(7~10 g·L-1)可以保证生物降解的稳定性，使整个工艺对COD的去除保持在较高水平.
图 2显示了系统沿程COD变化趋势.原水COD浓度约346 mg·L-1，进入系统后迅速下降，经过回流稀释作用及曝气条件下异养菌对碳源的消耗，生化罐中混合液COD浓度已降至86 mg·L-1，系统出水COD浓度约为20 mg·L-1.由此可见，完全混合式曝气系统具有较强的COD去除能力，其原因在于：① 系统采用完全混合曝气的模式，强化了异养菌对有机物的降解与消耗；② 系统具有较大的回流，延长了污水实际水力停留时间，从而强化了系统对有机污染物的去除能力.完全混合式曝气系统可以为包括好氧反硝化菌在内的异养微生物提供适宜的生长环境，而大部分好氧反硝化菌同时具有异氧硝化及代谢降解有机物的能力[7, 17, 18]，可以在曝气条件下表现出对有机底物较高的去除能力.
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图 2 进出水COD浓度及沿程变化特征 Fig. 2 Variations of COD in influent and effluent along with the wastewater treatment process |
完全混合式曝气系统进出水NH4+-N、TN变化曲线如图 3所示.系统进水NH4+-N为1.33~57.1 mg·L-1，均值为30.3 mg·L-1，出水NH4+-N为0.2~5.6 mg·L-1，均值为0.89 mg·L-1，平均去除率达96.9%，出水NH4+-N超标率低于2%.系统进水TN波动较大，在7.7~58.3 mg·L-1之间，均值为33.6 mg·L-1，出水TN在1.9~26.9 mg·L-1范围波动，平均去除率为75.2%，均值为7.8 mg·L-1，出水氨氮和TN均优于GB 18918-2002的一级A排放标准，表明系统具有较强的脱氮能力.当系统运行至第70 d左右时，出水TN浓度高于20 mg·L-1，这是由于滤池内滤料出现堵塞现象，增加系统反冲洗频率后使反冲洗过程中部分污泥颗粒随出水流出，导致系统TN升高.但在恢复反冲洗频率后，出水水质得以改善.
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图 3 进出水NH4+-N和TN浓度的变化 Fig. 3 Variations of NH4+-N and TN in influent and effluent along with the wastewater treatment process |
为了考察完全混合式曝气系统各单元对氮转化的作用和贡献，对其各单元出水中氮组分及浓度进行测定，结果如图 4所示.根据式(1)和(2)计算得生化罐的同步硝化反硝化率为99.6%，同步硝化反硝化速率为32.9 mg·(L·h)-1，生化罐中具有良好的同步硝化反硝化能力，氨氮进入生化池1后持续降低，最终出水氨氮低于1 mg·L-1.生化池1的同步硝化反硝化率为94%，同步硝化反硝化速率为1.1 mg·(L·h)-1.由图 4中总氮，硝态氮及亚硝态氮的变化可知，系统同时具备较强的反硝化脱氮能力，而且不存在亚硝酸盐的积累现象.系统仅在单一曝气条件下就能实现同步硝化反硝化，有效节省了占地面积并在系统碱度维持方面更具有经济性.
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图 4 不同形态氮浓度的沿程变化 Fig. 4 Variations of Nitrogen concentrations along with the wastewater treatment process |
为进一步研究系统各反应单元的实际运行状态，对每个反应单元的DO进行24 h连续监测，结果如表 2所示.生化罐和生化池1内溶解氧较低，其DO均低于0.5 mg·L-1，生化池2和生化池3的DO浓度较高，一般维持在1~4 mg·L-1.其原因在于进水有机物浓度较高，异养菌在曝气条件下快速降解有机物并消耗大量溶解氧，导致在系统前段(生化罐和生化池1)溶解氧明显低于设定值.随着有机物的消耗，系统后段(生化池2和生化池3)的DO浓度逐渐上升.通过核算发现生化罐和生化池1中硝酸盐浓度分别降低1.82 mg·L-1和1.67 mg·L-1，而在生化池2和生化池3中硝酸盐浓度略有上升，但总氮呈降低趋势，系统中可能存在好氧反硝化菌群.研究表明不同菌属的好氧反硝化菌对DO的耐受能力存在显著差异，大部分好氧反硝化菌在DO浓度低于3 mg·L-1时仍具有较高的反硝化活性[19, 20].根据系统氮平衡分析，生化罐和生化池1中的同步硝化反硝化现象明显强于生化池2和生化池3，其原因可能基于以下两方面：第一，系统前段C/N明显高于后段，较高的C/N能保证充足的碳源，进而有利于反硝化反应顺利进行，Ahmad[21]也在研究中发现，好氧反硝化菌的反硝化活性同样随着C/N的升高而增大；第二，较低的DO浓度有利于活性污泥絮体内部形成缺氧微环境，从而使缺氧反硝化与好氧反硝化相协同，进一步强化同步硝化反硝化效果.
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表 2 系统DO分布/mg·L-1 Table 2 Distribution of DO concentrations in the system/mg·L-1 |
2.3 反硝化特性
反硝化模拟试验的硝态氮浓度随时间变化曲线如图 5所示，在DO浓度为0.1~0.2 mg·L-1时，完全混合式曝气系统中污泥在最初的2 h内硝酸盐还原效果明显，其脱氮速率(以NO3--N/MLVSS计，下同)为4.09 mg·(g·h)-1.当DO浓度在1.0~2.0 mg·L-1和2.0~3.0 mg·L-1时，污泥脱氮速率分别为0.73和0.67 mg·(g·h)-1，系统污泥在低DO浓度条件下的脱氮能力约为高DO浓度条件下的5.8倍.这是因为系统污泥中的反硝化菌群适应低DO条件，从而表现出更高的活性；同时，DO会优先于NO3--N被异养微生物利用，且相对较高DO浓度会有利于异养菌消耗有机物，从而使反硝化菌群在高DO条件下的反硝化能力受到抑制[22].当DO较高时，系统污泥仍具有较好的反硝化效果，表明系统中可能存在好氧反硝化菌群.
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图 5 不同DO条件下污泥反硝化效果 Fig. 5 Denitrification capacity of sludge under different DO concentrations |
取污水处理厂污泥与系统污泥反硝化能力进行对比发现，当控制DO浓度为0.1~0.2 mg·L-1时，两座污水处理厂缺氧池污泥反硝化能力明显受到抑制，其脱氮速率仅为0.58和1.43 mg·(g·h)-1，反硝化能力明显低于完全混合式曝气系统污泥.
完全混合式曝气系统一般运行约30 d即可实现对COD、氨氮和总氮的稳定高效去除，随着进水冲击负荷的变化，污染物去除效果稳定.系统运行过程中极少出现污泥上浮与污泥膨胀等不利现象，适用性较高.
2.4 微生物特性由图 6可知，完全混合式曝气系统在有氧条件下的反硝化能力明显优于传统活性污泥，因此对活性污泥进行周质硝酸盐还原酶亚基基因(napA)的PCR扩增.
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图 6 系统污泥与传统活性污泥在低DO条件下的反硝化效果 Fig. 6 Denitrification capacity of different sludge under low DO concentration |
试验结果如图 7所示，编号1、2和3为系统春季运行时污泥样品；4和5为污水处理厂A缺氧池污泥样品(系统所在污水处理厂)；6和7为污水处理厂B缺氧池污泥样品；8和9为系统秋季运行时污泥样品.系统污泥得到明显清晰的877 bp的DNA特异条带，表明系统污泥存在周质硝酸盐还原酶亚基基因napA，可以表达周质硝酸盐还原酶，污泥中含有典型的好氧反硝化细菌，其在好氧条件下经由周质硝酸盐还原酶的催化还原硝酸盐，产生氮气实现好氧反硝化，提高系统的总氮去除能力.污水处理厂A中活性污泥显示存在特异性条带，表明污水处理厂A中存在少量好氧反硝化菌，但是其强度较低，未在反硝化微生物中占优势，无法显著增强污水处理厂A的总氮去除效果，而污水处理厂B几乎不存在好氧反硝化菌.
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图 7 PCR扩增产物的琼脂糖凝胶电泳图像 Fig. 7 Image of PCR agarose gel electrophoresis |
为准确反映完全混合式曝气系统内的微生物群落结构，对系统稳定运行的不同时期(春季和秋季)的微生物群落结构进行解析.通过高通量测序发现，系统污泥中微生物共有42个纲，污泥微生物比例分布如图 8所示(选取比例超过1%的纲绘入图中).不同时期系统污泥微生物菌群结构基本一致，以变形菌纲为主，其中β变形菌纲、γ变形菌纲、δ变形菌纲和α变形菌纲比例分别占变形菌纲54.45%、10.60%、7.80%和7.85%；鞘脂杆菌纲占6.02%，厌氧绳菌纲占2.71%，放线菌纲占1.66%，酸杆菌纲占1.03%.其中β变形菌纲与污水处理过程密切相关，是污水处理厂脱氮的重要菌群，可以在低溶解氧条件下利用有机物生长繁殖[23].测序结果表明(表 3)，系统污泥微生物中动胶菌属(Zoogloea)，陶厄氏菌属(Thauera)和Dechloromonas菌属始终处于优势地位，其中Zoogloea属与菌胶团的形成有密切关系，可能会促进系统实现同步硝化反硝化作用；Thauera属是β变形菌中的一类革兰氏阴性细菌，大部分为杆状且以反硝化菌居多[24]，如T. aromatica、T.mechernichensis和T. terpenica等，而其中T. mechernichensis是一类典型的好氧反硝化菌；Dechloromonas菌属具有良好的反硝化功能[25]，主要功能菌D. agitate和D. denitrificans都具有较强的硝酸盐还原能力[23].随着季节的变化，仅Azohydromonas和Longilinea菌属存在较大波动，但污泥微生物群落结构整体变化较小，使完全混合式曝气系统始终保持良好的脱氮效能.完全混合式曝气系统内污泥微生物多样性丰富，为系统的高效脱氮奠定了基础.
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图 8 系统中污泥微生物纲的分布比例 Fig. 8 Distributions of microbial strains in the system at the level of class |
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表 3 系统污泥微生物优势菌属及其比例/% Table 3 Dominant microorganisms and their proportions in the system/% |
3 结论
(1) 采用完全混合曝气系统处理污水，在无外加碳源的情况下，取得较好的有机物去除效果和脱氮效果，COD、NH4+-N和TN的去除率分别为93.2%、96.9%、75.2%，出水COD、NH4+-N和TN均优于一级A排放标准.
(2) 完全混合式曝气系统中污泥在低DO浓度(0.1~0.2 mg·L-1)条件下具有较高的反硝化能力，其脱氮速率是污水处理厂污泥的2.86倍以上.当DO浓度大于1 mg·L-1时，系统污泥仍具有一定反硝化能力，其脱氮速率与污水处理厂污泥相当.
(3) 周质硝酸盐还原酶亚基基因napA的PCR扩增结果表明，系统内存在一定浓度的好氧反硝化菌.系统内污泥微生物结构稳定，以变形菌纲为主，动胶菌属(Zoogloea)，陶厄氏菌属(Thauera)和Dechloromonas菌属为优势菌属.
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