2017, Vol. 38
硅酸盐类矿物占自然界所有已知矿物种类的1/3，占地壳比重的75%，是我国两大岩石矿物类型之一[1]. 由于人类过度的开采活动，造成岩矿区土地退化，植物多样性锐减[2]，裸岩遍布，最终导致土地生产力完全丧失，出现矿区石漠化现象[3]. 据统计，我国矿山占用土地面积为581×104 hm2，其中矿区废弃地面积高达288×104 hm2，且以每年约4.67×104 hm2的增幅扩大，而矿区复垦整治率极低[4]. 为解决岩矿区生态环境破坏的问题，日本等国家开发出多种生态修复工程技术，其原理就是以植物修复为基础，结合喷播技术在裸岩表面喷射形成具有一定厚度并包含多种植物生长所需物质的基质层，人为创造可促进植物生长的环境[5]. 但目前生态修复工程技术的绿化效果均存在难以长期维持的问题，因为目前的修复措施仅能使植物根系生长于岩石上部，依靠吸收基质中的有限养分生长，养分吸收殆尽后，植物将枯死，喷播覆盖层也将从岩体表面脱落[6]. 因此，加快岩石的土壤化进程，形成植物持续生长所需的土壤环境，是克服目前工程技术中绿化效果只作用于岩石表面，无法长期维持这一问题的关键.
微生物广泛存在于硅酸盐岩石矿区的贫瘠生境中，并将难以利用的营养元素转化为易于被吸收利用的形态[7]. 其中，硅酸盐岩分解细菌可通过风化硅酸盐矿物，促进岩石的分解，并获得其生长所需的营养物质[8]. 因此，硅酸盐岩分解细菌的研究对矿区被破坏生境的修复具有重要意义. 目前细菌风化岩石的途径主要有以下4种：细菌代谢分泌有机酸类物质，改变环境pH，加速岩石溶解[9]； 细菌分泌胞外多糖与低分子有机酸，通过络合作用促岩石风化[10]； 细菌与矿石接触并产生酶类物质(如碳酸酐酶等)，通过表面接触交换作用，破坏岩石矿物结晶构造，促进岩石溶蚀[11]； 细菌具有的生物膜结构可形成特殊微环境，加快岩石风化[12].
现有研究已证明芽孢杆菌等细菌对硅酸盐矿物的高效分解作用[13, 14]，但多集中于简单对比接入实验菌株后产生的差异性. 而不同菌株对不同岩石具有不同的促溶作用与机制[15]，简单的大小对比并不能说明细菌促进岩石溶蚀的主要因素，因此也无法阐述菌株的溶岩机制. 本研究引入增强回归树(boosted regression tree analysis,BRT)分析，以科学探究实验菌株的促溶机制. 此外，多数研究中的岩石风化菌种分离自土壤[15, 16]. 而已有实验表明，苔藓根际微生物的次级代谢产物种类丰富，其中包括大量可降低环境pH的有机酸类物质[17]，以及生长素、 赤霉素、 脱落酸、 吲哚乙酸等能有效促进植物生长的活性物质[18, 19]. 本研究的实验菌株分离自岩矿区岩生苔藓表面，通过对高效溶岩细菌的筛选、 鉴定与其溶蚀机制的探究，选出可以应用于废弃岩石矿区生境修复的菌株，以期为该地区的生态修复提供菌种资源.
1 材料与方法 1.1 采样区概况庐山地处长江中下游鄱阳湖平原西北部,位于江西省北部，北临长江，东濒鄱阳湖，地理坐标为东经115°52′~116°08′，北纬29°26′~29°41′. 近年来由于过度的岩石开采，生态环境遭到严重破坏，土壤流失，植被减退，导致大量岩石裸露.
1.2 实验材料 1.2.1 岩石样品取采自庐山矿区的裸露岩石，用去离子水对矿物进行反复清洗，直至上层溶液澄清. 再用0.1 mmol·L-1的盐酸溶液酸洗岩石粉(浸泡1 h)，从而降低矿物表面杂质影响且不改变矿物表面形貌及其化学属性[20]； 再用去离子水冲洗至淋洗液呈中性，自然风干，经粉碎机粉碎，过200目筛，121℃高压灭菌20 min后备用.
上述处理后的矿粉经X射线衍射仪(XRD，Ultima IV，日本理学)测定,得到其组成成分(实验衍射条件为:起始角10b，终止角45b，扫描速度10 mm·min-1，温度20.0℃，湿度55.0%)：钾长石52%，石英36%，云母10%，绿泥石2%. 同时对岩石的组成元素进行岩石全矿分析，得到岩石的主要组成元素(表 1).
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表 1 岩石主要组成 Table 1 Main components of the rock sample |
1.2.2 苔藓样品
采集庐山矿区生长于岩石表面较为完整的苔藓，使用已灭菌的土壤刀轻轻将苔藓层铲下，将其置于无菌自封袋中带回，4℃冰箱中短暂保存备用，其余样品则置于-20℃冰箱保存.
1.2.3 实验培养基(1) 亚历山大罗夫培养基 蔗糖5.0 g，Na2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，FeCl3 0.005 g，CaCO3 0.1 g，岩石矿粉1.0 g，琼脂15.0 g，去离子水1 000 mL，调节pH至7.0~7.2.
(2) 细菌富集培养基 牛肉膏5.0 g，蛋白胨10.0 g，NaCl 5.0 g，琼脂粉18 g，去离子水1 000 mL，调节pH至7.2~7.4.
(3) 有氮培养基 蔗糖10 g，K2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，NaCl 0.1g，(NH4)2SO4 1.0 g，酵母膏0.5 g，CaCO3 0.5 g，琼脂20 g(液体培养基不加)，去离子水1 000 mL，调节pH至7.2.
(4) 细菌发酵培养液 蔗糖10 g，Na2HPO4 2.0 g，MgSO4·7H2O 0.5 g，CaCO3 0.1 g，NaCl 0.1 g，(NH4)2SO4 0.5 g，去离子水1 000 mL，调节pH至7.2~7.4.
1.3 实验方法 1.3.1 样品的处理与菌种分离取苔藓样品，用无菌水反复冲洗样品表面，将多遍洗涤后的清洗液用无菌水梯度稀释(10-4、 10-5、 10-6)后取200 μL均匀涂布于基亚历山大罗夫培养基上，置于培养箱内28℃ 条件下进行培养. 根据菌落形态、 颜色等特征初步判断分离出的菌株种类，并按常规方法挑取单菌落纯化后保存，每个样品进行3次平行处理.
1.3.2 硅酸盐矿物分解细菌初筛(1) 菌株产吲哚乙酸(IAA)能力的测定
配制浓度为2.5 mg·mL-1的色氨酸溶液，无菌有机滤膜过滤. 试管分装高压灭菌(121℃，20 min)处理的有氮培养液4.0 mL，加入色氨酸溶液1.0 mL，配制浓度为0.5 mg·mL-1的色氨酸培养液. 分别将实验菌株接种于上述培养液，180r·min-1，28℃ 条件下振荡培养72 h. 将样品10 000 r·min-1离心10 min，取上清液1.0 mL，加入50μL 10mmol·L-1的正磷酸及2.0 mL Sackowski's显色剂，充分混合后置于恒温25℃ 黑暗处，显色30 min，取出测定530 nm波长下吸光值[21]. 无菌处理作为空白调零，并分别以浓度为5、 10、 20、 40、 60 mg·L-1的IAA标准液绘制标准曲线以计算菌株发酵液中的IAA浓度.
(2) 菌株产铁载体的测定
将实验菌株接种于有氮培养液中，180r·min-1，28℃ 振荡培养48 h. 10 000r·min-1离心10 min取上清液2.0 mL，加入2.0 mL CAS检测液充分混合，1 h后测定630 nm波长处吸光值(A)，以去离子水作为空白对照调零. 另取2.0 mL CAS检测液与2 mL无菌有氮液体培养基充分混合，测定630 nm波长处吸光值，即为参比值(Ar). 同时观察反应液颜色变化，变为黄色说明有铁载体产生，黄色越深则铁载体产量越多. 所用器皿均需先浸泡于浓度为6 mol·L-1的HCl溶液中进行脱铁处理[22].
1.3.3 硅酸盐矿物分解细菌复筛以硅酸盐矿物作为唯一的钾源对分离出的细菌进行培养，发酵液中SiO2的增量作为检测菌株溶蚀矿物能力的指标[23]. 取1.0 mL培养24 h的菌悬液(按6%的接种量)接入装有20 mL细菌发酵培养液和0.2 g硅酸盐岩石粉的50 mL锥形瓶中，另取121℃ 高温灭活的菌悬液1 mL接入培养液作为对照，每种处理方式做3个平行样品. 28℃，150 r·min-1振荡培养7 d，离心取发酵上清液采用硅钼蓝比色法测定其中硅含量.
1.3.4 细菌NLX-4的鉴定(1) 细菌NLX-4的生理生化特性测定
采用Gram染色法光学显微镜下观察菌体形态，并参照文献[24]对菌株NLX-4进行生理生化特性的测定.
(2) 细菌NLX-4的16S rRNA基因序列分析鉴定
菌株NLX-4 DNA提取: 采用CTAB法[25]提取菌株NLX-4的基因组DNA，采用ND-1000微量紫外光度计测定提取到的NLX-4基因组DNA浓度. 取2.5 μL基因组DNA用1%的琼脂糖凝胶电泳检测.
16S rRNA基因的PCR扩增: 扩增16S rRNA基因的正向引物27F(5′-AGAGTTTGATCC/ATGGCTCAG-3′)对应于E.coli 16S rRNA基因的第8~27个碱基位置，反向引物1492R(5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTT-3′)对应于E.coli 16S rRNA基因的第1 492~1 510个碱基位置. 以菌株NLX-4的总DNA为模板进行扩增.
PCR反应体系体积为25 μL：10×Taq DNA polymerase buffer 2.5 μL，25 mmol·L-1 MgCl2 1.5 μL，引物27F和1492R(10mmol·L-1)各0.5 μL，2.5 mmol·L-1 dNTP 2.0 μL，5 U·μL-1 Taq酶 0.15 μL，模板DNA 0.5 μL，ddH2O补足至 25 μL.
PCR反应条件为：95℃ 预变性5 min，95℃ 变性30 s，52℃ 退火30 s，72℃ 延伸1 min，共30个循环； 最后72℃ 延伸10 min. PCR产物用经EB染色的1%琼脂糖凝胶上电泳检测.
PCR产物分析: PCR产物的纯化以及测序交由南京金斯瑞生物科技有限公司完成，将测序结果提交至GenBank，采用BLAST软件进行比对分析.
1.3.5 细菌NLX-4的岩石分解实验取1.0 mL培养24 h的菌悬液(6.0×106 cfu·mL-1)接入装有100 mL细菌发酵培养液和0.5 g硅酸盐岩石粉的250 mL锥形瓶中，另取121℃，20 min灭活的菌悬液1.0 mL接入培养液作为对照，每种处理方式做3个平行样品. 将培养0、 2、 5、 10、 12、 15、 22、 30 d的样品分别离心(5 000 r·min-1，20 min)，取发酵上清液，采用pH计(PB-10，德国SATORIUS)测定pH值. 另取上清液5.0 mL，稀释至25 mL，取稀释液5.0 mL加入1.0 mL 6%的H2O2，70℃ 水浴30 min后定容至10 mL，过滤取滤液加1滴浓硝酸(65%)酸化，采用电感耦合等离子体发射光谱仪(ICP，Vista MPX，美国Varian)测定发酵液中K+、 Al3+的含量. 同时采用硅钼蓝比色法测定发酵上清液中的Si元素含量. 此外，分离出岩石矿粉并加入10 mL 10%的H2O2，充分反应后将容器注满去离子水，静置24 h抽去上层溶液，采用激光粒度分析仪(S3500 SI，美国Microtrac)对不同作用时间的岩石颗粒粒径进行测定.
1.3.6 细菌分解岩石有效物质的测定分别取培养0、 2、 5、 10、 12、 15、 22、 30 d的发酵液，先采用定性滤纸过滤，矿粉和菌体用少量去离子水迅速冲洗几次，将所有滤液和冲洗液移至100 mL容量瓶，定容. 将溶液移至离心管，10 000 r·min-1离心10 min，采用针头无菌过滤器(滤膜孔径0.22 μm)，过滤. 取滤液5.0 mL，置于50 mL的容量瓶中定容，用移液枪吸取1.0 mL移入1.5 mL的色谱瓶中，采用高效液相色谱仪(1260，美国Agilent)对培养液中相关有机酸的浓度进行测定[26].
另取发酵液2.0 mL于10 mL离心管，加入2.0 mL浓度为5%的磺基水杨酸钠混合均匀，静置1 h使蛋白质沉淀，再加入1.0 mL浓度为1%的 EDTA溶液和1.0 mL浓度为0.06 mol·L-1的稀盐酸溶液，5 000 r·min-1离心15 min. 取上清液1.0 mL置于5 mL容量瓶中，蒸干，用1.0 mL(pH=2.2)的缓冲液溶解待测.
取培养0、 2、 5、 10、 12、 15、 22、 30 d平行样品的发酵液，静置沉淀至固液分离，过滤取上清液，加入95%的乙醇，8 000 r·min-1离心10 min收集多糖，并置于50℃烘干，称重可得发酵液中多糖含量.
1.3.7 数据处理采用EXCEL 2010和SPSS 22.0对所得数据进行分析，应用R 3.3.0对岩石溶蚀的相关因子进行增强回归树(BRT)分析[27].
BRT是以分类回归树算法为基础发展而来，包括回归树算法和Boosting方法两个部分[28]. 作为一种自学习方法，BRT可产生多重回归树，提高模型稳定性及预测精度[29]. 即在运算过程中，对一定量数据进行多次随机抽取，分析各自变量对因变量的影响程度，剩余数据用于拟合结果检验，最终生成的多重回归树，取平均值并输出结果. 该分析方法可量化自变量对因变量的影响，分析不同影响因子的贡献率，目前被广泛应用于生态研究中[30~32].
2 结果与分析 2.1 高效溶岩细菌的筛选微生物发酵过程中可产生植物的生长激素，如吲哚乙酸(IAA)，具有促进植物细胞生长、 生根及果实发育的作用[33]. 微生物产生的铁载体对Fe3+具有极强的亲和性[34]，可抑制有害微生物生长，螯合铁、 锰、 锌等金属离子[35]，促进矿物分解[36]，并提供植物生长所需营养元素. 微生物产铁载体的能力以A/Ar比值作定量指标. A/Ar比值越小则说明微生物产铁载体能力越强[22].
对分离到的细菌产IAA及铁载体能力测定结果如表 2所示，22株细菌具有不同程度的产IAA及铁载体的能力. 其中5株细菌菌铁载体显色反应为阴性(-)，不产铁载体； 4株细菌不产IAA. 产铁载体能力较强的菌株有14株(A/Ar： 0~0.6)，产IAA浓度大于10 mg·L-1的菌株共16株，其中，产IAA浓度大于100 mg·L-1的菌株共3株，分别为NLX-19(110.48 mg·L-1)、 NLX-14(106.84 mg·L-1)、 NLX-4(102.29 mg·L-1). 选择产铁载体能力达“+++”以上且产IAA浓度大于10 mg·L-1的12株细菌进行复筛.
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表 2 菌株产IAA与铁载体测定结果1) Table 2 Indoleacetic acid and siderophore productions of the tested strains |
由图 1可以看出，进行复筛的12株细菌中，细菌NLX-4作用下培养7 d的发酵液释放的硅含量比对照组显著增加，同时，对比其他菌株，其促进硅元素释放的作用也最明显(11.90 mg·L-1). 说明在该细菌的生长代谢过程可有效促进岩石的溶解，并导致其中硅元素的释放量增加. 结合两次筛选结果，选择菌株NLX-4作为目的细菌进行下一步研究.
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图 1 菌株对硅酸盐矿物的溶蚀作用 Fig. 1 Dissolution of silicate minerals in 7 days |
经染色镜检，判断NLX-4为革兰氏阴性杆菌. 生理生化特性试验结果如下：过氧化氢酶试验，硝酸盐还原试验，反应为阳性； M.R.试验，V.P.试验，淀粉水解试验，明胶液化试验，糖醇类发酵试验(葡萄糖、 果糖、 乳糖、 半乳糖、 甘露糖、 甘露醇)反应为阴性.
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图 2 发酵液K+，Al3+，SiO2浓度及pH值 Fig. 2 Concentrations of K+,Al3+,SiO2 and pH value in fermentation broth |
对菌株NLX-4(No.KX379232)的16S rRNA基因进行扩增和测序，并将结果与NCBI数据库比对，BLAST表明其与假单胞菌属的Pseudomonas protegens CY01(No.JX082197)相似性极高，达到99%以上. 结合其生理生化特性，该菌株被鉴定为Pseudomonas protegens.
2.3 细菌NLX-4分解硅酸盐岩的能力由于钾(K)、 铝(Al)、 硅(Si)为实验所用硅酸盐岩样本的3大主要组成元素(表 1)，因此选择这3种元素作为细菌风化硅酸盐岩能力的指标. 对发酵中3种元素的浓度进行测定(图 2)，可见相对于对照组，实验组的3种元素浓度在实验过程中均出现显著增加. K2+浓度[图 2(a)]在0~15 d呈现大幅上升，15 d~30 d期间持续上升但增幅减缓，在30 d时浓度已增至85.83 mg·L-1. 实验组发酵液中Al3+与SiO2含量[图 2(b)和2(c)]也呈现相似的变化趋势，均在细菌作用下显著增加，并于30 d时分别达到最大值96.72 mg·L-1与32.18 mg·L-1. 说明细菌作用于岩石，促进岩石溶解并释放其中组成元素. 而在15 d后，K+、 Al3+、 SiO2含量的上升趋势减缓则说明，在密闭环境中，随着环境条件的变化，细菌溶蚀岩石释放元素的速率有所下降[37].
在对不同培养时间下岩石粒径的变化量进行分析时发现(表 3)，受到细菌NLX-4的作用，岩石发生溶解，粒径不断减小，在0~15 d期间岩石粒径的减小量呈上升趋势，并在15 d时达到最大值2.18 μm，此后岩石粒径的减小量不断下降，至30 d时降为1.60 μm. 该结果进一步说明在30 d的实验过程中，细菌NLX-4持续促进岩石分解，但在15 d后其分解岩石作用有所减弱.
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表 3 岩石粒径变化量1) Table 3 Particle diameter variation of the rock sample |
由发酵液pH的变化可知[图 2(d)]，细菌NLX-4具有降低培养液浓度的能力. 对照组培养液pH值在实验过程中变化不显著. 实验组培养液pH值在实验0~15 d显著下降； 15~30 d仍持续下降，但下降速度减缓，至实验结束pH值降至5.03. 结合以上3种元素的释放量以及岩石粒径的变化，可以看出，细菌代谢产生的酸性物质导致环境pH降低，可有效促进岩石的溶蚀.
2.4 细菌NLX-4分解硅酸盐岩的有效物质有研究证明，经实验条件培养的细菌可产生多种有机酸[38]，在其创造的酸性环境中，H+可置换出岩石矿物中的K+、 Al3+等阳离子，加速矿物的溶蚀. 因此，本实验选取草酸、 柠檬酸、 酒石酸、 苹果酸这4种有机酸作为高效液相色谱测定指标. 由测定结果可知(表 4)，细菌发酵液中酒石酸浓度远高于其他3种有机酸，且随时间的变化与培养液pH值呈相反趋势，于培养30 d时达到最大值1 025.87 mg·L-1.
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表 4 发酵液有机酸浓度1) Table 4 Concentrations of organic acids in fermentation broth |
在与岩石混合发酵培养的过程中，细菌NLX-4代谢产生氨基酸与多糖，使发酵液中的氨基酸与多糖含量显著增加. 由图 3(a)可以看出，在培养前期(0~12 d)氨基酸含量显著上升，此后12~15 d期间增幅大幅上升，15 d~30 d持续上升，但增幅明显减缓. 多糖含量则在0~9 d时大幅上升，此后至12 d增幅减缓，12~22 d增幅再次上升，22~30 d多糖含量下降[图 3(b)]. 表明在实验后期，细菌生成并分泌多糖的速率降低，小于多糖被利用分解的速率[39].
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图 3 发酵液中氨基酸及多糖含量 Fig. 3 Contents of amino acid and polysaccharide in fermentation broth |
运用BRT模型分析草酸、 柠檬酸、 酒石酸、 苹果酸、 氨基酸以及多糖这6种因子对岩石钾元素释放的影响. 采用以下调整设置进行生态建模：树复杂性(tree complexity)=5，学习速率(learning rate)=0.01，袋分数(bag fraction)=7. 采用分析软件R 3.3.0进行BRT分析，训练数据的相关性为0.988，验证数据相关性为0.996，二者ROC值均大于0.8，说明BRT分析结果可靠[40]. 分析结果如图 4所示，酒石酸对K元素从岩石的溶出影响最大，对其产生了50.1%的贡献率.其余变量对K元素释放的影响程度分别为：多糖(31.9%)>柠檬酸(7.5%)＞氨基酸(5.3%)＞草酸(3.4%)＞苹果酸(1.7%). 此外，随着酒石酸浓度的增大(＞777 mg·L-1)，该酸对岩石的溶蚀作用越强，释放的K元素越多. 由于酒石酸与pH呈负相关(P＜0.01)，对pH具有显著调控作用，因此，其创造的酸性环境可有效促进岩石中K元素的析出. 同时，多糖(＞8.21g·L-1)也与K元素的溶出呈现正相关关系. 说明本实验中细菌NLX-4促进岩石溶蚀是多种因子共同作用的结果[41].
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图 4 菌株NLX-4解钾主要因素的BRT分析 Fig. 4 BRT analysis of the relationship between potassium releasing and six factors |
在采用BRT模型对岩石Al元素释放的影响因子分析中可以看出(图 5)，最主要的影响因子是酒石酸，其贡献率为69.3%. 其他因子贡献率依次为：多糖(16.2%)>柠檬酸(5.1%)＞草酸(4.6%)＞氨基酸(4.3%)>苹果酸(0.6%). 且随着酒石酸浓度的增加(＞777 mg·L-1)，该变量对Al元素溶出的促进作用越显著，呈现正相关关系. 此外，多糖含量大于8.21g·L-1时，随着其含量增加，该变量与Al元素释放量呈正相关. 因此，岩石中Al元素的溶出受到多种变量共同影响.
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图 5 菌株NLX-4释铝主要因素的BRT分析 Fig. 5 BRT analysis of the relationship between aluminum releasing and six factors |
在细菌NLX-4释放Si元素的BRT分析中可以发现(图 6)，贡献率最大的影响因子为多糖(50.7%)，其次为酒石酸(31.2%)，其余4种变量的贡献率分别为：柠檬酸(9.1%)，氨基酸(4.9%)，草酸(3.1%)，苹果酸(1.1%). 多糖(＞8.21g·L-1)与酒石酸(＞777 mg·L-1)含量均与Si元素释放量呈正相关关系. 由于Si元素及其氧化物的特殊理化性质，在细菌对硅酸盐岩的促溶作用中，Si元素的析出主要通过多糖与小分子有机酸的络合作用实现[42].
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图 6 菌株NLX-4脱硅主要因素的BRT分析 Fig. 6 BRT analysis of the relationship between desilicification and six factors |
综上所述，酒石酸是促进岩石溶解并释放K、 Al元素的主要因素，且在浓度高于777 mg·L-1时起到显著促进作用. 多糖使促进岩石溶蚀并释放Si元素的主要因素，且在含量高于8.21g·L-1时促进作用明显.
3 讨论 3.1 高效菌株的筛选特性岩石矿区蕴藏丰富的含硅矿物，但其中大部分以稳定的铝硅酸盐状态存在，无法被植物直接吸收利用[43]. 硅酸盐岩分解细菌能高效促进该类矿物溶解，并释放多种营养元素[44]. 同时，一些特定的微生物在其生命过程中能产生如吲哚乙酸(IAA)、 赤霉素等生长激素促进植物生长[45]，此外，还可产生能够与Fe3+等金属离子发生络合反应的铁载体，使元素从岩石析出，从而促进岩石分解[34].不同岩石风化实验中的矿物材料来源不同，而岩石矿物结构复杂多样，不同实验室筛选到的菌株溶蚀岩石能力强弱可能存在差异，无法对不同类型的硅酸盐岩矿物均产生良好的分解效能[11]. 这一问题将导致筛选出的菌株在实际应用中产生效果不稳定，因此，应综合多项指标对菌株进行定向筛选. 本研究不仅考量了菌株NLX-4对岩石的风化效果，还选择了可代谢产生IAA和铁载体两种植物促生物质作为指标进行定向筛选，以期开发硅酸盐岩菌种更为丰富的潜在功效.
3.2 菌株NLX-4促进岩石溶蚀的作用机制岩石表面的生存环境对微生物而言更为严苛，为了维持正常的生命活动与种群延续，岩表微生物主要采取是相互协作或共生方式，而非土壤中常见的互相竞争或抑制，从而不同类群的微生物可保留各自所需微量水分与有限养分[46]，而一旦温度、 养分及湿度等环境条件变得适宜微生物生长，则将促使其进入岩石缝隙以扩大生存的空间，加速矿物的风化进程. 因此，在岩石分解细菌的生命过程中，会分泌一些有效物质，促进岩石溶蚀，获得自身生长繁殖所需的营养与空间环境[47]. 本实验探究的高效分解岩石细菌选自岩生苔藓表面，在对其岩石分解能力的研究中发现，该菌株的代谢活动降低了发酵液pH，创造酸性环境，促使岩石发生溶蚀，释放其中的K、 Al、 Si元素，最终导致岩石粒径不断减小.
已有研究表明，硅酸盐岩分解细菌可代谢分泌如草酸、 柠檬酸、 酒石酸等有机酸，对硅酸盐矿物产生显著促溶作用[48]. 此外，细菌代谢产生的小分子有机酸、 氨基酸及胞外多糖等，还可通过与溶液中的阳离子进行络合而促进风化岩石的反应正向进行[49]. 经研究发现[50]，相同酸性条件下，有机酸对矿物的溶蚀能力是无机酸的10倍以上，络合作用被认为在这一过程中起到了重要作用. 本研究筛选的高效菌株NLX-4分泌的酒石酸可显著降低发酵液pH. 此外，通过BRT分析，可以发现，岩石中K、 Al元素的溶出主要是由于酒石酸创造酸性环境，岩石被酸解，且当酒石酸浓度大于777 mg·L-1时对岩石促溶作用显著. 岩石中Si元素的析出则主要由于细菌分泌多糖对其产生络合作用，且当多糖浓度高于8.21g·L-1时促进元素释放、 岩石分解效果显著. 说明有机酸与多糖均需在环境中达到一定浓度才能对岩石发挥良好的促分解效果[9].
3.3 菌株NLX-4在矿区修复中的潜在作用过度的开采活动导致岩石矿区土壤流失，植被减退，岩石裸露，对其生境造成严重的破坏[51]. 因此，微生物对岩石的风化作用在环境极度恶化地区具有重要意义. 岩石分解菌株可将岩石分解为细粒，进而形成土壤[16]. 同时，将岩石中难以被植物吸收利用的营养元素转化为离子形式，以促进植物在贫瘠地区的生根繁殖[52]. 此外，硅酸盐岩分解菌株NLX-4还可产生吲哚乙酸及铁载体这2种促进植物生长的物质，对岩石矿区被破坏生境具有极大的修复潜力. 但应用于破坏生境修复中的菌种不仅需具备高效性，也需具备对环境的良好适应性[53]. 因此，进一步的应用研究中，需探究细菌NLX-4对岩矿区环境的适应能力，以及对该菌株的驯化改良.
4 结论(1) 菌NLX-4分离自岩生苔藓表面，具有高效产植物促生物质IAA及铁载体的功能，并经生理生化特性测定与16S rRNA基因序列分析鉴定该菌株为Pseudomonas protegens.
(2) Pseudomonas protegens NLX-4可通过分泌酒石酸及多糖显著促进岩石溶蚀，释放其中K、 Al、 Si这3种主要组成元素. 其中，酒石酸在浓度大于777 mg·L-1时显著促进K、 Al元素从岩石中析出，且浓度越大，释放元素作用越强. 多糖在含量高于8.21g·L-1时对Si元素释放具有显著促进作用，且其浓度变化与解硅作用呈正相关. 此外，参与分析的其余变量也分别对岩石溶解，元素释放具有一定贡献率. 说明不同促溶物质对岩石的不同组成成分产生的作用强度不同，同时发挥作用的有效物质需积累达到一定的浓度，此外，促进岩石溶解是多种因素共同作用的结果.
(3) 本研究筛选并鉴定了高效产植物促生物质并分解硅酸盐矿物的菌株Pseudomonas protegens NLX-4，结合生态统计分析方法BRT探究其促溶机制，进一步证明其有效性. 为解决岩石矿区生境中突出的水土流失、 裸岩遍布等问题提供了良好的菌种资源与新的思路.
| [1] | 杜乐天, 黄志章. 硅酸盐岩石中价岐化法则[J]. 地球化学, 1984(3) : 273–281. Du L T, Huang Z Z. Valence dipolarization in silicate rocks[J]. Geochimica, 1984(3) : 273–281. |
| [2] | 方瑛, 马任甜, 安韶山, 等. 黑岱沟露天煤矿排土场不同植被复垦土壤酶活性及理化性质研究[J]. 环境科学, 2016, 37(3) : 1121–1127. Fang Y, Ma R T, An S S, et al. Heidaigou opencast coal mine:soil enzyme activities and soil physical and chemical properties under different vegetation restoration[J]. Environmental Science, 2016, 37(3) : 1121–1127. |
| [3] | 王晓学, 李叙勇, 吴秀芹. 基于元胞自动机的喀斯特石漠化格局模拟研究[J]. 生态学报, 2012, 32(3) : 907–914. Wang X X, Li X Y, Wu X Q. Pattern simulation of karst rocky desertification based on cellular automata[J]. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(3) : 907–914. DOI: 10.5846/stxb |
| [4] | 冷菁. 吉林省梅河矿区废弃地生态恢复评价研究[D]. 长春:吉林大学, 2013. Leng J. Research on the assessment of ecological restoration for the mining wasteland in Meihe mining area of Jilin province[D]. Changchun:Jilin University, 2013. |
| [5] | Borland H, Ambrosini V, Lindgreen A, et al. Building theory at the intersection of ecological sustainability and strategic management[J]. Journal of Business Ethics, 2016, 135(2) : 293–307. DOI: 10.1007/s10551-014-2471-6 |
| [6] | 赵耀娟. 抚顺市闭坑矿山环境恢复治理研究[D]. 长春:吉林大学, 2014. Zhao Y J. Research on closed mine environmental recovery and management in Fushun city[D]. Changchun:Jilin University, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10183-1014270874.htm |
| [7] | von Herrath M G, Fujinami R S, Whitton J L. Microorganisms and autoimmunity:making the barren field fertile?[J]. Nature Reviews Microbiology, 2003, 1(2) : 151–157. DOI: 10.1038/nrmicro754 |
| [8] | 王琪. 不同微生境钾质粗面岩表生细菌群落结构与细菌对岩石的风化效应研究[D]. 南京:南京农业大学, 2013. Wang Q. Potassic trachyte-associated bacterial communities and their involvement in rock weathering[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2013. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10307-1016037805.htm |
| [9] | 肖国光, 孙德四, 曹飞. 硅酸盐细菌代谢产物影响斜长石风化作用的模拟试验[J]. 矿物岩石, 2013, 33(1) : 8–15. Xiao G G, Sun D S, Cao F. Wearthering of silicate minerals by metabolites produced by siliccate bacteria in culture experiments[J]. Journal of Mineralogy and Petrology, 2013, 33(1) : 8–15. |
| [10] | 孔明明. 两种细菌和两种有机酸对层状硅酸盐矿物分解的影响[D]. 武汉:华中农业大学, 2012. Kong M M. Effects of two silicate mineral-solubilizing bacteria and two kinds of organic acids on decomposition of phyllosillicates[D] Wuhan:Huazhong Agricultural University, 2012. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10504-1012457981.htm |
| [11] | 申泰铭, 邢必果, 李为, 等. 不同种类微生物及其碳酸酐酶对CO2-H2O-碳酸盐系统中碳酸盐岩的溶蚀作用[J]. 矿物岩石地球化学通报, 2014, 33(6) : 797–800. Shen T M, Xing B G, Li W, et al. Characteristics of carbonate rock corrosion by different kinds of microbes and their carbonic anhydras in the CO2-H2O-carbonate system[J]. Bulletin of Mineralogy, Petrology and Geochemistry, 2014, 33(6) : 797–800. |
| [12] | 刘娟, 凌婉婷, 盛月慧, 等. 根表功能细菌生物膜及其在土壤有机污染控制与修复中的潜在应用价值[J]. 农业环境科学学报, 2013, 32(11) : 2112–2117. Liu J, Ling W T, Sheng Y H, et al. Biofilm formation of functional bacteria on root surfaces and its potential applications on organic contaminant control and soil remediation[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2013, 32(11) : 2112–2117. |
| [13] | 赵江曼, 朱明龙, 张旭, 等. 硅酸盐细菌的筛选、鉴定和对铝硅酸盐矿物的作用研究[J]. 高校化学工程学报, 2014, 28(5) : 1036–1043. Zhao J M, Zhu M L, Zhang X, et al. The screening and identification of silicate bacteria and its interaction with aluminosilicate minerals[J]. Journal of Chemical Engineering of Chinese Universities, 2014, 28(5) : 1036–1043. |
| [14] | 李冰, 赵勋, 王岩, 等. 胶质芽孢杆菌工业化发酵研究进展[J]. 农业科学研究, 2014, 35(1) : 68–72. Li B, Zhao X, Wang Y, et al. Research and progress on industrial fermentation of Bacillus mucilaginosus[J]. Journal of Agricultural Sciences, 2014, 35(1) : 68–72. |
| [15] | 郭芯岐. 云母矿区不同生态环境中可培养矿物分解细菌对黑云母的风化作用及其种群结构研究[D]. 南京:南京农业大学, 2014. Guo X Q. Biotite weathering by the mineral-weathering bacteria isolated from the different environments in the mica mine area and the population of the mineral-weathering bacteria[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10307-1016037710.htm |
| [16] | 张文彬. 钾矿区不同生境可培养矿物风化细菌风化矿物效应及其系统发育关系研究[D]. 南京:南京农业大学, 2014. Zhang W B. Mineral weathering and phylogenetic relationship of mineral weathering bacteria from different habitats in potassium mine[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10307-1016041877.htm |
| [17] | 杨琳璐, 王中生, 周灵燕, 等. 苔藓和地衣对环境变化的响应和指示作用[J]. 南京林业大学学报(自然科学版), 2012, 36(3) : 137–143. Yang L L, Wang Z S, Zhou L Y, et al. Response and bioindicator of bryophyte and lichen as cryptogamae plants to environmental change[J]. Journal of Nanjing Forestry University (Natural Science Edition), 2012, 36(3) : 137–143. |
| [18] | 王华磊. 结皮微生物资源菌株筛选及其代谢产物研究[D]. 唐山:河北联合大学, 2013. Wang H L. Crust microbial strains screening and study on its metabolite[D]. Tangshan:North China University of Science and Technology, 2013. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10081-1013030563.htm |
| [19] | 吴凯. 调控烟草根际拮抗菌数量防控土传烟草青枯病效果及其机理研究[D]. 南京:南京农业大学, 2014. Wu K. Study on the mechanisms of manipulating the population of antagonist to suppress tobacco bactetrial wilt[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10307-1016041986.htm |
| [20] | 王朝华. 嗜酸菌与黄铁矿作用的实验研究[D]. 南京:南京大学, 2012. Wang C H. Experimental study on oxidation of pyrite mediated by acidophilic bacteria[D]. Nanjing:Nanjing University, 2012. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10284-1012376051.htm |
| [21] | Bano N, Musarrat J. Isolation and characterization of phorate degrading soil bacteria of environmental and agronomic significance[J]. Letters in Applied Microbiology, 2003, 36(6) : 349–353. DOI: 10.1046/j.1472-765X.2003.01329.x |
| [22] | 王平, 董飚, 李阜棣, 等. 小麦根圈细菌铁载体的检测[J]. 微生物学通报, 1994, 21(6) : 323–326. Wang P, Dong B, Li F D, et al. Detection and determination of the siderophores produced by wheat rhizobacteria[J]. Microbiology, 1994, 21(6) : 323–326. |
| [23] | Welch S A, Ullman W J. The effect of organic acids on plagioclase dissolution rates and stoichiometry[J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1993, 57(12) : 2725–2736. DOI: 10.1016/0016-7037(93)90386-B |
| [24] | 中国科学院微生物研究所细菌分类组. 一般细菌常用鉴定方法[M]. 北京: 科学出版社, 1978. |
| [25] | 王美玲. 一株海洋细菌基因组文库的构建及岩藻多糖酶基因的筛选[D]. 合肥:安徽农业大学, 2013. Wang M L. The study on construction of genomic library of a marine bacteria and screening its fucoidanase gene[D]. Hefei:Anhui Agricultural University, 2013. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10364-1014148162.htm |
| [26] | 游蕊, 梁丽, 覃蔡清, 等. 低分子量有机酸对三峡水库消落区土壤中汞赋存形态及其活性的影响[J]. 环境科学, 2016, 37(1) : 173–179. You R, Liang L, Qin C Q, et al. Effect of low molecular weight organic acids on the chemical speciation and activity of mercury in the soils of the water-level-fluctuating zone of the three Gorges Reservoir[J]. Environmental Science, 2016, 37(1) : 173–179. |
| [27] | Ridgeway M E, Silveira J A, Meier J E, et al. Microheterogeneity within conformational states of ubiquitin revealed by high resolution trapped ion mobility spectrometry[J]. Analyst, 2015, 140(20) : 6964–6972. DOI: 10.1039/C5AN00841G |
| [28] | 佘玉萍, 陈淑清. 基于增强回归树的水藻预测分析[J]. 长春大学学报, 2015, 25(3) : 20–23. She Y P, Chen S Q. Forecast and analysis of algae based on Boosted Regression Tree[J]. Journal of Changchun University, 2015, 25(3) : 20–23. |
| [29] | Cheong Y L, Leitão P J, Lakes T. Assessment of land use factors associated with dengue cases in Malaysia using Boosted Regression Trees[J]. Spatial and Spatio-temporal Epidemiology, 2014, 10 : 75–84. DOI: 10.1016/j.sste.2014.05.002 |
| [30] | Pittman S J, Costa B M, Battista T A. Using Lidar Bathymetry and Boosted Regression Trees to predict the diversity and abundance of fish and corals[J]. Journal of Coastal Research, 2009, 53(S) : 27–38. |
| [31] | Weisberg P J, Shandra O, Becker M E. Landscape influences on recent timberline shifts in the Carpathian Mountains:abiotic influences modulate effects of land-use change[J]. Arctic, Antarctic, and Alpine Research, 2013, 45(3) : 404–414. DOI: 10.1657/1938-4246-45.3.404 |
| [32] | 蔡文华, 杨健, 刘志华, 等. 黑龙江省大兴安岭林区火烧迹地森林更新及其影响因子[J]. 生态学报, 2012, 32(11) : 3303–3312. Cai W H, Yang J, Liu Z H, et al. Controls of post-fire tree recruitment in Great Xing'an Mountains in Heilongjiang Province[J]. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(11) : 3303–3312. DOI: 10.5846/stxb |
| [33] | 邵佳慧. 解淀粉芽孢杆菌SQR9吲哚乙酸合成途径及促生效应的研究[D]. 南京:南京农业大学, 2014. Shao J H. Indole-3-acetic acid synthesis pathways and plant-growth-promotion effects of bacillus amyloliquefaciens SQR9[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10307-1016037595.htm |
| [34] | 王诗忠. 铁载体降低金属生物毒性的机制研究[D]. 广州:中山大学, 2012. Wang S Z. Role of siderophore in reducing metal toxity[D]. Guangzhou:Sun Yat-Sen University, 2012. |
| [35] | Deshmukh G M, Shete A, Pawar D M. Oxidative absorption of hydrogen sulfide using an iron-chelate based process:chelate degradation[J]. Journal of Chemical Technology &Biotechnology, 2013, 88(3) : 432–436. |
| [36] | 何琳燕, 张垠, 盛下放, 等. 一株产铁载体细菌的筛选及其与云母的相互作用[J]. 高校地质学报, 2012, 18(1) : 117–124. He L Y, Zhang Y, Sheng X F, et al. Isolation of a siderophore-producting bacterial strain and mica-bacterial interactions[J]. Geological Journal of China Universities, 2012, 18(1) : 117–124. |
| [37] | 张永东, 钱一雄, 王恕一. 石英在碱性成岩环境中的溶蚀作用规律探讨及实验模拟[A]. 中国矿物岩石地球化学学会. 中国矿物岩石地球化学学会第15届学术年会论文摘要集(5)[C]. 长春:中国矿物岩石地球化学学会, 2015. |
| [38] | 王建萍. 三株细菌胞外聚合物(EPS)对矿物细颗粒表面性质的影响及改性作用[D]. 绵阳:西南科技大学, 2015. Wang J P. The effect and modification of surface properties mineral granules mediated by three common bacteria and extracellular polymeric substances (EPS)[D]. Mianyang:Southwest University of Science and Technology, 2015. |
| [39] | 李欧. Paenibacillus elgii B69胞外多糖结构鉴定及生物合成途径研究[D]. 杭州:浙江大学, 2014. Li O. Structural characterization and identification of biosynthetic pathway of the exopolysaccharide from Paenibacillus elgii B69[D]. Hangzhou:Zhejiang University, 2014. |
| [40] | 焦琳琳, 常禹, 申丹, 等. 利用增强回归树分析中国野火空间分布格局的影响因素[J]. 生态学杂志, 2015, 34(8) : 2288–2296. Jiao L L, Chang Y, Shen D, et al. Using boosted regression trees to analyze the factors affecting the spatial distribution pattern of wildfire in China[J]. Chinese Journal of Ecology, 2015, 34(8) : 2288–2296. |
| [41] | 王明霞, 袁玲, 黄建国, 等. 4株外生菌根真菌对Al3+吸收与吸附的研究[J]. 环境科学, 2015, 36(9) : 3479–3485. Wang M X, Yuan L, Huang J G, et al. Al3+ absorption and assimilation by four ectomycorrhizal fungi[J]. Environmental Science, 2015, 36(9) : 3479–3485. |
| [42] | 马光友. 产酸与产多糖细菌对硅酸盐矿物的风化效应研究[D]. 南京:南京农业大学, 2011. Ma G Y. Silicate mineral weathering by organic acid-or exopolysaccharides-producing bacteria[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2011. |
| [43] | 孙德四, 陈晔, 曹飞. 细菌-矿物接触方式对铝土矿降解的影响[J]. 中国矿业大学学报, 2013, 42(1) : 122–128. Sun D S, Chen Y, Cao F. Influence of microbe-mineral contact model on decomposition of bauxite[J]. Journal of China University of Mining &Technology, 2013, 42(1) : 122–128. |
| [44] | 俞雅君. 砂质红壤剖面矿物风化细菌的分离筛选及其系统发育关系研究[D]. 南京:南京农业大学, 2014. Yu Y J. Isolation and screening of the mineral-weathering bacteria from a sandy red soil profile and study on their phylogenetic relationships[D]. Nanjing:Nanjing Agricultural University, 2014. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10307-1016038518.htm |
| [45] | 陈宝. 内生细菌促进东南景天Zn/Cd的提取效应及其机制研究[D]. 杭州:浙江大学, 2015. Chen B. The effects and mechanisms of endophytic bacteria promoting Zn/Cd phytoextraction by Sedum alfredii [D]. Hangzhou:Zhejiang University, 2015. http://cdmd.cnki.com.cn/Article/CDMD-10335-1015320383.htm |
| [46] | 朱永官, 段桂兰, 陈保冬, 等. 土壤-微生物-植物系统中矿物风化与元素循环[J]. 中国科学:地球科学, 2014, 57(5) : 888–896. Zhu Y G, Duan G L, Chen B D, et al. Mineral weathering and element cycling in soil-microorganism-plant system[J]. Science China:Earth Sciences, 2014, 57(5) : 888–896. DOI: 10.1007/s11430-014-4861-0 |
| [47] | 刘成禹, 李宏松. 岩石溶蚀的表现特征及其对物理力学性质的影响[J]. 地球与环境, 2012, 40(2) : 255–260. Liu C Y, Li H S. Study on the expressive characteristics of rock corrosion and Its effect on physical and mechanical properties of rock surface layer[J]. Earth and Environment, 2012, 40(2) : 255–260. |
| [48] | 王秀林, 孙德四, 曹飞. 硅酸盐细菌代谢产物对不同结构硅酸盐矿物风化作用的影响[J]. 非金属矿, 2013, 36(1) : 1–4. Wang X L, Sun D S, Cao F. The influence of silicate bacterial metabolites on weathering of silicate minerals with different crystal structures[J]. Non-Metallic Mines, 2013, 36(1) : 1–4. |
| [49] | Welch S A, Barker W W, Banfield J F. Microbial extracellular polysaccharides and plagioclase dissolution[J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1999, 63(9) : 1405–1419. DOI: 10.1016/S0016-7037(99)00031-9 |
| [50] | Wieland E, Wehrli B, Stumm W. The coordination chemistry of weathering:Ⅲ. A generalization on the dissolution rates of minerals[J]. Geochimica et Cosmochimica Acta, 1988, 52(8) : 1969–1981. DOI: 10.1016/0016-7037(88)90178-0 |
| [51] | 杨振意, 薛立, 许建新. 采石场废弃地的生态重建研究进展[J]. 生态学报, 2012, 32(16) : 5264–5274. Yang Z Y, Xue L, Xu J X. Advances in ecology restoration of abandoned quarries[J]. Acta Ecologica Sinica, 2012, 32(16) : 5264–5274. DOI: 10.5846/stxb |
| [52] | Rey P F. Opalisation of the Great Artesian Basin (central Australia):an Australian story with a Martian twist[J]. Australian Journal of Earth Sciences, 2013, 60(3) : 291–314. DOI: 10.1080/08120099.2013.784219 |
| [53] | 秦莉, 高茹英, 徐亚平, 等. 堆肥中高效降解纤维素及金霉素和土霉素的复合菌系的构建[J]. 农业环境科学学报, 2014, 33(30) : 465–470. Qin L, Gao R Y, Xu Y P, et al. Construction of a high-efficiency complex microbial system to degrade cellulose and chlortetracycline and oxytetracycline in compost[J]. Journal of Agro-Environment Science, 2014, 33(30) : 465–470. |