2017, Vol. 38
甲状腺是脊椎动物重要的内分泌器官，其分泌的甲状腺激素在人类和动物的生理过程中发挥着重要的调节作用. 一些环境化合物具有潜在的甲状腺激素干扰活性，如酚类化合物、 邻苯二甲酸酯类化合物、 溴阻燃剂等[1]，这些具有甲状腺激素干扰活性的化合物通常被称为甲状腺激素干扰物(TDCs). TDCs已经成为继环境雌激素后一类重要的内分泌干扰物[2]. 最新研究证实一些重金属离子，如Zn2+、 Cd2+、 Hg2+具有甲状腺激素干扰活性，能够抑制甲状腺激素三碘甲状腺原氨酸(T3)和甲状腺激素受体(TR)结合[3]. 重金属在水环境中的广泛分布可能会对水生生物甲状腺系统产生干扰，因此急需开展环境水体中重金属甲状腺激素干扰效应的影响因素及其相关机制研究.
有研究证实腐殖酸是影响环境水体重金属生物学毒性的重要因素，重金属的生物学毒性不仅与总量有关，更大程度上由其赋存形态决定，不同的形态产生不同的环境效应[4]. 水体中重金属形态主要分为溶解态和颗粒态，文献[5]报道了重金属的溶解态含量更接近天然水体中生物有效态的部分. 腐殖酸是一种广泛分布于地球生物环境中的复杂大分子有机物，具有丰富的活性功能基团，包括羧基、 羟基、 胺基、 酚羟基等，能够与水体中的重金属离子发生络合反应，影响重金属离子在水环境中的形态转化、 迁移和生物有效性. 例如水体中铜、 锌的毒性与游离的金属离子浓度有关，当与腐殖酸形成络合物时降低了金属离子的浓度，从而抑制了金属离子的毒性[6]. 腐殖酸与重金属离子的作用方式是形成络合物，络合物的形成可能会增加或降低金属离子的溶解性，这主要取决于pH值及重金属离子的饱和度[7]. 目前已开展水体中重金属形态对其生物效应的影响研究[8, 9]，但关于腐殖酸对重金属形态及其甲状腺激素干扰效应的影响研究报道较少.
阳极溶出伏安法(ASV)是检测水体中生物有效态重金属的重要方法. 其基本原理可表述为：ASV将金属形态按其电极行为特征分为电极有效态和惰性态，电极有效态包括游离态和一些简单无机络合物，是可能的致毒形态[10]. 鉴于ASV中电极动力学过程类似重金属通过生物膜进入细胞的过程，所以ASV的测试结果和生物毒性测试结果有较好的一致性[11]. 本文还采用三维荧光光谱中的激发-发射矩阵(3DEEM)技术考察腐殖酸与重金属的作用机制，腐殖酸含有几种不同的荧光基团，在一定条件下能发射荧光，其荧光特性包含了与结构、 官能团、 构型、 分子间相互作用的动力学等信息[12, 13]，3DEEM能够获得腐殖酸荧光强度随激发和发射波长同时变化的信息，已被广泛用于定性或定量描述腐殖酸的物理化学特性.
本文选择重金属锌作为研究对象，采用ASV、 3DEEM技术和重组TR基因酵母方法，开展腐殖酸对锌抗甲状腺激素干扰效应的影响及机制分析，以期为区域水环境中锌的生物学毒性及锌水质基准的制定提供基础数据和理论支持.
1 材料与方法 1.1 模拟水样的配制模拟水样是由腐殖酸(化学纯，国药集团化学试剂有限公司)、 氯化锌(97%，Strem Chemicals)和去离子水(Millipore)配制而成的混合水样. 称20 mg腐殖酸粉末，加入0.1 mol·L-1 NaOH(分析纯，国药集团化学试剂有限公司)溶解于去离子水中，0.1 mol·L-1 HNO3(分析纯，北京化工厂)调节pH值为6.7，0.45 μm滤膜过滤，定容于100 mL容量瓶中，得到浓度为200 mg·L-1的腐殖酸母液，去离子水稀释母液至腐殖酸浓度为5mg·L-1. 向腐殖酸溶液中添加不同浓度的氯化锌(7×10-6、 2×10-5、 7×10-5、 2×10-4、 2×10-3 mol·L-1)，配制模拟水样于暗处保存，12 h内完成测试.
1.2 紫外照射参考文献[14]方法，将模拟水样装入石英蒸发皿中，254 nm紫外照射4 h，紫外灯强度为30 W，照射距离为3 cm. 利用日立高新科技公司的F-7000型荧光分光光度计对模拟水样进行三维荧光光谱扫描.
1.3 阳极溶出伏安法(ASV)ASV方法参考文献[15]进行，并对富集时间、 缓冲液pH值等条件进行了优化. 采用三电极系统，其中玻碳电极为工作电极，Ag-AgCl为参比电极，铂片电极为辅助电极.
1.3.1 测定条件富集时间：2 min； 起始电位： -1.5 V； 终止电位： 0 V； 电位增量：0.008； 振幅：0.05； 脉冲宽度：0.02 s； 采样宽度：0.017 s； 脉冲周期：0.2 s； 静置时间：10 s； 测试缓冲液选择pH 4.5的醋酸-醋酸钠(HAc-NaAc)缓冲液.
1.3.2 测定方法将模拟水样置于50 mL容量瓶中，加入测试缓冲液5 mL，摇匀备用. 将溶液倒入电解槽中，插入电极，利用CHI660D型电化学工作站(上海辰华仪器有限公司)进行溶出伏安法扫描，实验在N2的保护下进行.
1.4 重组基因酵母体外快速测试重组TR基因酵母由中国科学院生态环境研究中心环境水质学国家重点实验室提供. 模拟水样的重组基因酵母体外快速测试方法参考文献[16]进行，可简述为：选择对数生长期的酵母细胞，调节细胞密度使得600 nm处的吸光度D600 nm值为0.8左右. 量取2 mL酵母细胞，1 000 r·min-1离心5 min，弃去上清液，加入4.5 mL模拟水样及0.5 mL 10×SD/-Leu/-Trp培养基； 检测模拟水样抗甲状腺激素干扰效应时添加25 μL 10-3 mol·L-1三碘甲状腺原氨酸(T3，98%，Sigma)，每个样品设4组平行. 30℃振荡培养2 h后，200 μL溶液转移到96孔板中，测定600 nm处的吸光度，弃去150 μL上清液，加入120 μL测试缓冲液和20 μL氯仿(分析纯，北京化工厂)，30℃，1 300 r·min-1预培养10 min后加入40 μL 2-硝基苯-β-D-吡喃半乳糖苷(ONPG，98%，百灵威科技有限公司)启动酶反应，30℃，800 r·min-1反应1 h，酶标仪(TECAN GENios A-5002，Austria)测定420nm处吸光度值.
1.5 数据处理实验数据采用Origin、 Excel软件进行统计处理. ASV方法中，以氯化锌溶液浓度为横坐标，峰电流值为纵坐标，绘制校准曲线，模拟水样中生物有效态锌的浓度通过比对校准曲线得出.
模拟水样类/抗甲状腺激素干扰效应分别采用相对百分诱导活性P和相对百分抑制活性I表征，计算公式如下：
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式中，u为加标水样检测的β-半乳糖苷酶活性值，计算公式参考文献[17]； umax为T3诱导的β-半乳糖苷酶活性值.
2 结果与讨论 2.1 ASV测试方法的建立配制一系列浓度为1.0×10-6~2.0×10-3 mol·L-1的ZnCl2溶液，按实验方法进行检测，并绘制校准曲线，如图 1. ZnCl2的线性范围为3.0×10-6~2.0×10-4mol·L-1，相关系数R为0.999 2. 参考文献[18]报道的方法，以3倍的标准偏差法(3σ)得出ASV方法的检测限为1.3×10-7 mol·L-1. 本文测定锌的线性范围与文献[19]报道范围2.143×10-6~3.57×10-4mol·L-1的结论类似. 但与文献[20~22]报道锌的线性范围和灵敏度存在差异，这可能是由于ASV方法所用电极、 缓冲液、 测定参数等的选择不同.
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图 1 ZnCl2的校准曲线 Fig. 1 Calibration curve of ZnCl2 |
采用快速测试方法对模拟水样甲状腺激素干扰效应进行检测，所有样品均未检出显著的酵母细胞急性毒性，实验空白控制较好(数据未列出). 实验结果如图 2所示，氯化锌被检出有具有显著的抗甲状腺激素干扰效应，其RIC20(抑制率为20%时氯化锌的浓度)值为1.70×10-5mol·L-1，与文献[23]报道的RIC20值(9.1×10-5mol·L-1)较为一致.
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图 2 不同条件处理对ZnCl2抗甲状腺激素干扰效应的影响 Fig. 2 Effect of different treatment conditions on antagonistic thyroid receptor activities of ZnCl2 |
当模拟水样中加入腐殖酸后，其抗甲状腺激素干扰效应明显降低，降低的百分比在30%~50%之间，可能的原因是腐殖酸与锌离子发生了络合反应，使游离态锌离子含量下降，从而降低其甲状腺激素干扰毒性. 腐殖酸中含有羧基、 羟基等官能团，金属离子能够和腐殖酸中的官能团发生络合反应[6]，使得游离态金属含量下降，而有机结合态的金属含量增加； 游离态金属离子与有机结合态相比，其对生物体更具有毒性[24]，范文宏等[25]的研究也发现腐殖酸能够促进重金属由非稳定态向稳定态转化，降低其生物学有效性，进一步佐证了本文的结论.
为了确保实验结果的可靠性，排除腐殖酸本身具有的类/抗甲状腺激素干扰效应而造成测试结果的假阳性，利用快速测试对不同浓度梯度腐殖酸溶液的甲状腺激素干扰效应进行检测，测试结果如图 3所示，并未检测到腐殖酸具有显著的类/抗甲状腺激素干扰效应(P>0.05)，表明腐殖酸并未对测试体系造成干扰，实验结果具有可靠性.
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图 3 腐殖酸类/抗甲状腺激素干扰效应 Fig. 3 Agonistic/Antagonistic thyroid receptor activities of humic acid |
为了佐证上述结论，采用ASV方法对模拟水样中生物有效态锌浓度进行检测，结果见表 1. 实验结果表明，当腐殖酸和氯化锌溶液混合后，ASV检测到溶液中生物有效态锌的浓度显著降低，表明腐殖酸可能和锌发生了络合反应，形成腐殖酸-锌络合物. 当腐殖酸浓度为5mg·L-1时，随着氯化锌溶液浓度的升高，腐殖酸对锌的络合量增加，但生物有效态锌含量降低的百分比逐渐变小，与已有报道的实验结果一致，可能的原因是在同一条件下，腐殖酸体系中的结合位点是一定的，加入的锌离子越多，结合的百分比就越小[26].
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表 1 5 mg·L-1腐殖酸对生物有效态锌含量的影响 Table 1 Effect of humic acid (5 mg·L-1) on the concentration of bio-available zinc |
ASV的测试结果与甲状腺激素干扰效应测试结果间表现出相同的趋势，进一步证实溶解态腐殖酸能够降低水体中锌的甲状腺激素干扰效应.
2.4 紫外照射对锌抗甲状腺激素干扰效应的影响腐殖酸分子中含有大量的发色团，能够直接吸收紫外和可见光，将所吸收的光能转化为化学能，并形成不稳定的激发态，引起自身降解，从而释放出与之结合的重金属离子，改变金属离子形态[27]. 因此，本研究对模拟水样进行紫外照射后采用快速测试方法检测甲状腺激素干扰效应. 测试结果(图 2)表明，模拟水样经紫外照射后，水样的抗甲状腺激素干扰效应显著增加，但仍低于未加腐殖酸水样的抗甲状腺激素干扰效应. 这说明紫外照射能够破坏腐殖酸与锌的络合键位[28]，从而释放出部分锌，导致照射后模拟水样的甲状腺激素干扰效应增强. 但是由于紫外照射并不能使腐殖酸完全降解，所以照射后模拟水样的甲状腺激素干扰效应仍低于未加腐殖酸水样的抗甲状腺激素干扰效应.
为了更加直观地表征腐殖酸与氯化锌的作用机制，对上述样品开展三维荧光光谱扫描. 测试结果如图 4和图 5，5mg·L-1腐殖酸存在3个荧光峰，分别记为荧光峰A、 B、 C. 荧光峰A的激发波长、 发射波长分别为298~306 nm、 345~356 nm处，即Ex/Em为(298~306) nm/(345~356) nm，荧光峰B位于Ex/Em为(265~278) nm/(424~447) nm处，荧光峰C位于Ex/Em为(221~226) nm/(328~342) nm处，与Hudson等[29]报道腐殖酸的峰的位置相近，其中荧光峰A、 C可能为类蛋白荧光基团，与芳香族氨基酸相关[30]，荧光峰B可能为类富里酸基团，与陆地还原性醌类相关[31]. 文献[32]报道了重金属可以和腐殖酸中的糖类官能团、 醌基、 羟基发生配位作用，形成复杂的络合物. 当5 mg·L-1腐殖酸溶液中加入氯化锌后，荧光峰A、 B、 C的荧光强度均降低，表明Zn2+可能与荧光峰A、 B、 C所代表的有机物官能团发生了络合配位作用[33]. 其中荧光峰B强度下降的趋势较大，可能的原因是荧光峰B富含醌基，与Zn2+的络合能力较强. 三维荧光光谱直观地反映出腐殖酸对Zn2+的络合作用，可在此基础上进一步开展溶解态腐殖酸影响锌抗甲状腺激素干扰效应的作用机制研究.
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图 4 5 mg·L-1腐殖酸溶液的三维荧光光谱 Fig. 4 3D fluorescence spectrum of humic acid(5 mg·L-1) |
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图 5 5 mg·L-1腐殖酸和2×10-3 mol·L-1 ZnCl2混合溶液的三维荧光光谱 Fig. 5 3D fluorescence spectrum of the mixed solution of humic acid (5mg·L-1) and ZnCl2 (2×10-3 mol·L-1) |
(1) ASV方法能检测出水体中生物有效态的锌含量，本文建立的ASV方法对ZnCl2检测的线性范围为3.0×10-6~2.0×10-4 mol·L-1，检测限为1.3×10-7 mol·L-1，适用于工业废水中锌含量的检测.
(2) 腐殖酸和锌发生络合反应后，会明显降低锌的抗甲状腺激素干扰效应，紫外照射会使腐殖酸发生降解，释放出部分锌，使得模拟水样的抗甲状腺激素干扰效应上升，但由于紫外照射并不能完全降解腐殖酸，照射后模拟水样的甲状腺激素干扰效应仍低于未加腐殖酸水样的抗甲状腺激素干扰效应.
(3) 3DEEM技术能够捕获溶解态腐殖酸与Zn2+作用前后的荧光特性，能够直观地反映腐殖酸对氯化锌的络合作用，有利于进一步开展溶解态腐殖酸影响Zn2+甲状腺激素干扰效应的作用机制研究.
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