2016, Vol. 37
2. 北京大学深圳研究生院, 深圳 518055
2. Shenzhen Graduate School, Peking University, Shenzhen 518055, China
城市是人类与自然相互作用的综合耦合系统(Coupled Human and Natural Systems)[1]，城市土壤是人类活动的基础，人类活动驱动的城市小气候、大气化学、水文、营养盐循环等因素直接作用于城市土壤，改变土壤的物理化学性质，影响土壤的生态结构和健康状况.
土壤健康状态指的是土壤能够正常提供各种生态服务功能的状态，如维持生产植物性和动物性产品，改善水和大气的能力等[2].大量研究表明，土壤微生物与土壤健康状态的维持有着紧密的关系[3].球囊霉素相关土壤蛋白(glomalin-liked soil proteins, GRSP)是一种耐热性糖蛋白[4~7]，具有改善土壤结构、固定土壤中有毒离子的功能[8]，因其在环境中存在状态稳定而被认为是土壤碳库的重要组成部分.有充分的证据表明，球囊霉素相关土壤蛋白的主要成分蛋白质来源于以丛枝菌根真菌为代表的微生物代谢活动[5, 9, 10]，因而广泛用于土壤健康状态的表征[10, 11].
目前，关于土壤球囊霉素相关土壤蛋白的定性和定量研究，使用较多的方法是聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)[12]、酶联免疫吸附(ELISA)[4]以及考马斯亮蓝显色[13]等.然而，Jorge-Araúujo等[14]的研究表明传统方法提取的球囊霉素相关土壤蛋白，因其包含大量其他有色有机物(如腐殖质类物质)成分，易干扰蛋白定量导致蛋白质含量被高估，影响其评估土壤状态的准确性和科学性，因而实现球囊霉素相关土壤蛋白中蛋白质成分与其他干扰成分的有效区别，对进一步研究球囊霉素相关土壤蛋白的生态效应及其对土壤健康状态的表征作用有着重要的意义.
三维荧光光谱(EEM)与平行因子模型(PARAFAC)联用技术，通过分离不同有机物在不同波长段的荧光特征，识别有机物的组分和含量[15, 16]，广泛运用于环境中有色有机物的检测和识别[15, 17, 18]. Hudson等[19]讨论了使用PARAFAC模型代替BOD5指标评估水体健康状况的可能性，认为相比较于传统的物理化学检测手段，EEM-PARAFAC指标更为简单快速. Jorge-Araújo等[14]率先使用三维荧光分析土壤样品组分，从中识别出了腐殖酸. Wang等[20]使用平行因子方法建模，从土壤样品中得到的球囊霉素相关土壤蛋白样品中识别出了多种有机物，丰富了人们对球囊霉素相关土壤蛋白的认识.
为了解城市发展过程中人类活动对城市土壤健康状况的影响，本研究采集了北京市山区、城区和郊区的土壤样品，分析土壤样品物理化学指标的同时，使用EEM-PARAFAC技术识别土壤样品中球囊霉素相关土壤蛋白的荧光组分特征，探讨使用球囊霉素相关土壤蛋白指标评估土壤健康状况的可能性.
1 材料与方法 1.1 调查地概况和取样方法本研究按照山区、城区和郊区的采样方案，将所采集的土壤分为3类，山区土壤采集于北京市北五环外的山区，共采集24份土壤样品；城区土壤采集于北京市城区内没有施工的路边绿化带草地土壤，共采集22份土壤样品；郊区土壤采集于北京市南六环外大兴区和通州区南部郊区的4个区域，区域内主要的土地利用类型为耕地，共采集20份土壤样品.每个样点按照1/4样圆法进行取样[21]，取样时去除表面3 cm附着物和植被以及部分土壤，土样装入锡箔纸袋密封带回实验室.避光晾干研磨后，过2 mm筛子，检测前避光4℃保存，所有检测在一个月内完成.
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图 1 北京市采样点分布示意 Fig. 1 Location of sampling sites in Beijing |
本研究使用的试剂购置于国药集团化学试剂有限公司，纯度均为分析纯.所使用仪器包括: 721可见分光光度计(上海菁华科技仪器有限公司)，2600+紫外可见分光光度计(日本岛津公司)，932火焰原子吸收分光光度计(澳大利亚GBC科学仪器公司)，AL204电子分析天平(瑞士梅特勒-托利多公司)，Cary三维荧光检测仪(美国瓦里安公司).
1.3 土壤物理化学性质测定测定的土壤物理性质包括土壤密度和含水率.密度采用环刀法测定，含水率按照烘干法测定，检测方法见于土壤农业化学分析方法[22].土壤的化学性质包括pH、有机质、全钾、全氮、全磷以及水解性氮. pH的测定使用复合甘汞电极法测定，水土比为2.5 :1.有机质采用重铬酸钾法测定，全钾采用火焰原子分光光度计测定，全氮采用半微量开氏法，全磷采用钼锑抗比色法，水解性氮使用容量法测定.
1.4 土壤类球囊霉素的提取与蛋白浓度检测球囊霉素相关土壤蛋白的提取按照Janos等[23]改进过的提取方法进行，1 g过筛土壤加入8 mL碱性柠檬酸钠提取液(50 nmol ·L-1柠檬酸溶液，pH=8.0)，高压灭菌锅121℃热提1 h，6 000 r ·min-1离心4 min取上清液，提取液呈现标准的红棕色，以上步骤重复若干次，直到上清液完全变为无色为止.
提取的球囊霉素相关土壤蛋白使用酸沉降法纯化[20]，具体步骤为:收集到的蛋白粗提液加入0.1 mol ·L-1盐酸溶液直到pH值降至2.1，6 000 r ·min-1离心4 min，去除上清液，加入0.1 mol ·L-1 NaOH溶液中直到沉淀完全溶解，提纯后的蛋白样品保存于4℃冰箱，后续检测在一周内完成.
球囊霉素相关土壤蛋白浓度使用Bradford方法检测，以牛血清蛋白为标准蛋白物质[24].
1.5 三维荧光(EEM)检测以及平行因子模型(PARAFAC model)为了避免浓度过高导致的内滤效应干扰，所有提纯后的球囊霉素相关土壤蛋白荧光检测前使用超纯水稀释50倍保证所有样品的254 nm吸光度(A254)小于0.3[14].荧光检测参数如下:激发波长范围210~550 nm, 检测步长5 nm；发射波长范围250~650 nm，检测步长2 nm.使用Parker提出的内滤效应矫正模型对荧光信号进行内滤校正[25~27].检测每个样品的紫外-可见吸收光谱，检测波长范围为200~700 nm，检测步长1 nm.使用扫描得到的紫外-可见吸收光谱通过以下公式建立内滤效应校正矩阵IIFE用于后续标准化:
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原始数据EEM矩阵与IIFE的张量积即为内滤效应校正后的矩阵FIFE:
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之后使用空白水样中提取得到的拉曼散射峰进行拉曼标准化转化，得到拉曼单位的荧光矫正数据，记为Fcal(RU)，公式如下[26]:
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平行因子模型建立:平行因子模型是一种多线性分解方法(multi-linear decomposition methods)，模型通过将三维数据解构为3个具有实际意义的载荷向量的向量积和残差的和，进而对数据进行更为简单的解释[28, 29].其公式如下:
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式中，k为样品数，i为激发光波长数，j为发射光波长数，Xijk表示第k个样品在第i个激发光激发下第j个发射波长的荧光值.在PARAFAC模型中X被分解成了F个荧光物质的荧光强度和
实验数据的整理、编辑使用Excel完成；部分图的绘制使用OriginPro 9完成.平行因子模型的建立使用Matlab 2012b平台与drEEM工具包完成.相关性分析、总体大小的比较和单因素方差分析使用SPSS 20完成.
2 结果与分析 2.1 土壤球囊霉素浓度及其荧光特征分析模型使用Stedman提出的拆半生效(half-split validation)方法，所有用到的数据随机分为两组，分别使用随机初始化，当模型收敛判别准则(convergence criteria, CC)小于10-8时表明模型生效，结果分析得到的5因子模型如图 2所示，5个因子分别记为C1、C2、C3、C4、C5.使用OpenFluor数据库提供的比对工具和传统的区域分析对球囊霉素相关土壤蛋白的平行因子模型的5个因子的成分进行识别[31]，结果表明(表 1)，其中C1、C2、C4分别为微生物来源的UVC腐殖质C1[32]，人为来源的UVA腐殖质C2[16~19]和土壤富里酸物质C4[20].通过与已经有报道的组分相比较，C3组分峰位置与土壤中广泛存在的氧化醌类相似[33]，C5组分峰位置与酪氨酸类蛋白质相似[34].
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图 2 球囊霉素相关土壤蛋白中5因子模型等高线 Fig. 2 Contour pattern of GRSP's 5 components PARAFAC model |
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表 1 球囊霉素相关土壤蛋白荧光组分成分特征1) Table 1 Fluorescent characteristics of GRSP |
图 3所示为不同采样区域球囊霉素相关土壤蛋白浓度以及使用平行因子模型所识别得到的5个因子的相对浓度比较(以scores向量为表征).人为活动显著降低了球囊霉素相关土壤蛋白浓度.不同荧光组分对总荧光强度的贡献率可以对不同的样品中不同DOM的性质进行定量描述.山区，城区和郊区土壤中氧化醌类物质(C3)和类蛋白物质(C5)的贡献率分别为5%~24.68%和0~19.72%；12.28%~29.58%和0~20.61%；13.31%~27.56%和0~13.46%，其余3个荧光组分保持稳定(如图 3).以人为活动为主要来源的腐殖质成分C3在城市内和耕地内含量高于自然样地，而类蛋白组分C5受人类活动影响显著下降.以上结果表明土壤类球囊霉素中的荧光组分较为稳定，人类活动显著提高了球囊霉素相关土壤蛋白中的人为源腐殖质成分的同时使得类蛋白物质含量减少.
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*表示与山区比较有显著性差异(P < 0.05) 图 3 不同样点的球囊霉素相关土壤蛋白浓度以及荧光组分得分比较 Fig. 3 GRSP concentration and 5 components scores in different sampling sites |
图 4所示为不同采样区域土壤样品的物理化学性质，同山区等较为接近自然状态的土壤相比较，城区和郊区土壤密度、含水率、有机质含量、全氮、全磷等指标显著下降(P < 0.05)，其他如pH值，全钾和水解性氮没有显著性影响.具体地说，有机质含量总体趋势表现为山区>城区>郊区.城区土壤有机质含量均值为21.39g ·kg-1，郊区土壤有机质含量均值为16.54g ·kg-1，山区有机质含量50.88g ·kg-1.总氮含量呈现出相似的状态.城区土壤总氮含量为0.191%，郊区土壤总氮含量0.169%，山区土壤总氮含量为0.306%.总磷含量表现出相反的趋势，城区土壤总磷0.078%，郊区土壤总磷0.069%，山区土壤总磷0.059%.
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*表示与山区比较有显著性差异(P < 0.05) 图 4 北京市不同采样区域土壤的物理化学性质 Fig. 4 Soil physicochemical property of different sampling sites in Beijing |
比较球囊霉素相关土壤蛋白浓度及其荧光特征与土壤不同理化指标的相关性发现，球囊霉素相关土壤蛋白浓度和微生物源C1组分与土壤总有机质和总氮呈现正相关性(P < 0.001)，氧化醌类物质C3组分和土壤总有机质和总氮呈现负相关关系(P < 0.001)(如图 5)，其相关系数如表 2，其余相关性不显著.以上结果表明球囊霉素相关土壤蛋白与土壤有机质、总氮浓度正相关，土壤有机质和总氮可能同时受到微生物源组分C1和人为源C3的影响.
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图 5 总氮、总有机质与球囊霉素相关土壤蛋白浓度、荧光组分C1和C3的相关关系 Fig. 5 Correlation between total nitrogen, total organic matter and GRSP concentration, C1, C3 in PRAFAC model |
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表 2 球囊霉素相关土壤蛋白荧光组分成分(C1和C2)与土壤总氮、有机质的相关系数之间的关系 Table 2 Correlation analysis between GRSP, C1, C2 and soil organic matters and total nitrogen |
3 讨论
城市是人类活动最为集中的地区，人类活动对城市化的影响表现在城市小气候、城市水文、大气循环、营养盐的输入和输出等多个方面[39, 40].但是城市化对土壤内部的碳循环和营养盐循环的作用尚不完全为人所知[41].土壤有机质是土壤碳储量计算、土壤肥力和质量评估的重要指标.一般认为，城市土壤有机质含量一般高于农业土壤和部分自然土壤[41~43].然而本研究的结果表明城区土壤和郊区土壤的土壤有机质含量没有显著性差异，同时都低于山区接近自然状态的土壤的有机质含量(如图 5).造成这种现象可能的原因是城市范围内土壤的空间异质性.按照城市功能区划分，一般来说城市内文教区土壤有机质含量高于交通区，同时交通区高于工业区和居民区[39].本次采样的样点主要位于交通区，因而有机质含量呈现出城区和郊区小于更接近自然状态的山区.
此外，自然土壤中的有机质含量随着土壤深度的增加逐渐降低，然而城市土壤正好与此相反[44]，城市表层土壤受人类扰动的作用，深层土壤的有机质往往含量更高，本研究采样主要为淋溶层土壤，随着采样深度的增加，可能有机质含量也会增加.
土壤微生物是土壤内物质循环的主要参与者.球囊霉素相关土壤蛋白作为一种广泛接受的真菌代谢产物[45]，被认为与土壤微生物活动相关，因而球囊霉素相关土壤蛋白成分可以表征土壤的健康状态.例如，Preger等[46]的研究表明持续性的耕作会导致土壤球囊霉素相关土壤蛋白流失，土壤肥力下降. Vasconcellos等[10]使用球囊霉素相关土壤蛋白指标评估大西洋沿岸森林的土壤状况，结果表明球囊霉素相关土壤蛋白含量与土壤中的碳、氮以及微生物活性相关，进一步说明了球囊霉素相关土壤蛋白在碳循环和土壤肥力恢复过程中的重要作用.然而，关于球囊霉素相关土壤蛋白不同成分目前仍然存在争议，大量研究表明球囊霉素相关土壤蛋白提取物中含有可能干扰蛋白质定量的有机物成分[14]，同时不同地区土壤的干扰有机物表现出的空间异质性导致使用球囊霉素相关土壤蛋白浓度表征土壤健康状态可能不准确.一种更为稳妥的解决方案是使用酶联免疫吸附实验作为球囊霉素相关土壤蛋白的定量手段[5, 23].然而，受限于球囊霉素相关土壤蛋白的单克隆抗体获得不易因而不具有普遍意义. EEM-PARAFAC技术使用更为广泛，并且三维荧光的检测具有方便、快速、前处理简单等优点.本研究证明EEM-PARAFAC技术分离球囊霉素相关土壤蛋白不同组分是可行的，使用球囊霉素相关土壤蛋白以及相应的荧光特征建立土壤健康状态的评价体系具有潜在的应用价值.尽管如此，Wang等[20]使用EEM-PARAFAC方法解析球囊霉素相关土壤蛋白的荧光组分，受土壤空间异质性的影响，无论从识别有机物的数量以及种类方面，该研究与本研究均有一定的差异，这表明尽管球囊霉素相关土壤蛋白及其荧光特征具有表征土壤健康状态的潜力，但是使其成为城市的评价体系还需要更多的数据以及更为稳定的模型支撑，包括建立不同土壤类型的球囊霉素相关土壤蛋白数据库，进一步增加样本量等手段.
4 结论(1) 使用三维荧光与平行因子模型联用的方法可以把球囊霉素相关土壤蛋白分解为5个独立组分，分别为微生物源UVC腐殖质类物质，UVA人为来源腐殖质类物质，微生物来源的氧化醌物质，土壤富里酸类物质和类蛋白物质.其中类蛋白质所占比率为0~20%.
(2) 不同采样区域的球囊霉素相关土壤蛋白的荧光特征分析表明，同自然状态的土壤相比较，以城市建设和耕作为代表的人类活动显著提高了土壤类球囊霉素中的人为源腐殖质类物质C3，而降低了类蛋白质物质C5，这个结果与球囊霉素相关土壤蛋白浓度受人类活动影响降低相吻合.
(3) 不同采样区的土壤物理化学指标表明人类活动造成了土壤质量的改变，表现在土壤含水率、有机质含量和总氮含量的下降.
(4) 球囊霉素相关土壤蛋白浓度和人为源腐殖质类物质C3与土壤有机质以及总氮含量显著相关，以球囊霉素相关土壤蛋白和荧光组分的强度向量为标准的指标体系，具有表征土壤健康状况的潜力，能够更好地为土地资源的管理提供科学的依据.
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