2016, Vol. 37
2. 哈尔滨工业大学市政环境工程学院, 哈尔滨 150090;
3. 四川农业大学资源学院, 成都 611130
2. School of Municipal and Environmental Engineering, Harbin Institute of Technology, Harbin 150090, China;
3. College of Resource, Sichuan Agricultural University, Chengdu 611130, China
邻苯二甲酸酯(PAEs)是一类重要的合成有机物，邻苯二甲酸二乙酯(DEP)是其中常用组分物质，因其可增加产品可塑性和柔韧性，是生产塑料和橡胶的重要增塑剂[1]，广泛用于玩具、建筑、汽车与医疗等塑料制品中[2].近年的研究表明，邻苯二甲酸酯会干扰内分泌系统、破坏免疫系统、影响儿童智力发育，且具有致癌、致畸作用[3]，受到了学术界广泛关注.美、欧等发达国家已将邻苯二甲酸酯类化合物列为优先控制污染物[4].由于PAEs并非共价聚合到塑料产品的基质中，而是与聚烯烃类塑料分子之间由氢键或范德华力连接，彼此保留各自相对独立的化学性质[5]，当环境条件适合时，PAEs类物质可由塑料中迁移到外环境而造成污染，因此在全球主要工业国的环境中已普遍检出[6].
尽管DEP可采用光化学、超声波、热解等方法进行降解[2]，但其效率极低，属难降解物质.微生物降解被认为是邻苯二甲酸酯完全矿化的主要途径且具有较高降解效率.近年来已大量开展DEP生物降解研究，包括降解菌分离、鉴定及降解特性研究，从各类环境已分离得到了许多高效降解PAEs的菌株，如节杆菌属(Arthrobacter sp.)、鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas sp.)和红球菌属(Rhodococcus sp.)的菌株[7].但目前的研究主要通过摇瓶实验对PAEs的降解能力进行考察[8, 9]，在反应器或工程化应用中的研究还鲜见报道.
生物强化是提高难降解污染物生物去除效率的可行途径[10]，有利于加快反应器启动、提高污染物降解速率、提高处理系统的抗冲击负荷能力[11, 12].本研究将分离获得的高效DEP降解菌运用到MBR反应系统，考察生物强化对DEP去除效果，利用q-PCR技术对不同运行时段反应器中邻苯二甲酸双加氧酶降解基(phtA)进行检测，探讨降解基因数量特征与系统稳定性及处理效果之间的关系.同时采用MiSeq测序分析反应器运行期间微生物群落结构的动态变化，确定反应器运行过程中的优势微生物菌群，以期为DEP污水处理的工程化应用提供一定的理论参考.
1 材料与方法 1.1 菌株及培养基采用梯度压力驯化法从制革厂污水处理系统活性污泥中分离DEP高效降解菌，分离方法参照文献[9]，经分离纯化后的菌株，对其16S rDNA进行扩增，T/A克隆后送上海生工工程有限公司测序.
基础无机盐培养基[MSM]: MgSO4 ·7H2O 0.4 g，CaCl2 ·2H2O 0.04 g，K2HPO4 1.70 g，KH2PO4 1.50 g，FeSO4 ·7H2O 0.04 g，NaNO3 0.5 g，(NH4)2SO41.0 g，FeCl3 0.15 g. LB培养基:酵母膏5 g，蛋白胨10 g，NaCl 5 g，pH 7，H2O 1 000 mL.
1.2 实验装置MBR反应器为有机玻璃材质，有效容积为2.5 L，内置PVDF材质的膜组件，孔径为0.1 μm.反应流程见图 1.
|
1.进水蠕动泵；2.出水蠕动泵；3.曝气装置；4.流量计；5.压力表；6.膜组件 图 1 MBR流程图及反应器 Fig. 1 Schematic diagram of the MBR |
实验采用MBR工艺，活性污泥采自于哈尔滨市市政污水处理厂二沉池回流污泥，接种量为0.6 L.采用人工配水，以NH4SO4为氮源，KH2PO4为磷源，KCl 5 000 mg ·L-1，微量元素添加浓度为FeSO4 ·7H2O 5 000 mg ·L-1，CuSO4 ·5H2O 100 mg ·L-1, ZnCl2 1 000 mg ·L-1，MnCl2 ·4H2O 500 mg ·L-1，CoCl2 ·6H2O 200 mg ·L-1，调节pH至7.0.基于前期实验中投菌量与降解效率的相关分析以及目前好氧生物强化相关研究[11, 18]，DEP降解菌接种量为污泥量体积7%，将对数生长期的降解菌与污泥同时投入MBR系统，以不投加DEP降解菌反应器为对照.
根据DEP降解菌特性及当前环境中PAEs浓度相关报道[2, 6]设定DEP浓度，驯化阶段，DEP为200 mg ·L-1，随后以200 mg ·L-1梯度逐渐提高浓度，最终达到800 mg ·L-1，考察反应器对不同浓度DEP的处理能力.处理过程中采用连续进水，通过继电器控制系统运行，溶解氧为4~5 mg ·L-1，运行温度为30℃, 水力停留时间为24 h.
1.4 实时荧光定量PCR (q-PCR) 1.4.1 标准质粒构建及质粒DNA的提取以DEP降解菌的基因组为模板，用引物phtF 5′-ACACSCCBCARACSCACAC-3′，phtR 5′-CTTG TCCTGCTACAGCTCTTG-3′[11]，扩增邻苯二甲酸双加氧酶降解基因(phtA)，检测目的片段后，pEASY-T5 Zero Cloning Kit载体连接，转化到Trans1-T1感受态细胞，37℃培养1 h，菌液涂板培养过夜，次日挑取白色单克隆接种于LB/Amp+培养基，在37℃，200 r ·min-1振荡培养过夜.用EasyPure小量质粒提取试剂盒(TransGen，中国)提取质粒，PCR鉴定阳性克隆，NanoDrop 2000(Thermo，美国)检测质粒的浓度和质量.根据以下公式计算出质粒的拷贝数(CN)，将已知拷贝数的质粒10倍梯度稀释用以制作标准曲线.
|
式中，NA为阿伏伽德罗常数，NA=6.02×1023；c为质粒浓度(ng ·μL-1)；n为重组质粒的碱基数，n=pEASY-T5载体长度(3 953 bp)+PCR产物长度；660为一个脱氧核苷酸的平均相对分子质量(g ·mol-1).
1.4.2 实时荧光定量PCR运行荧光定量运行平台为Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System.反应体系:模板1 μL，上下游引物各0.6 μL，FastStart Universal SYBR Green Master 10 μL (Roche，德国)，ddH2O补足20 μL.反应条件: 95℃预变性10 min，95℃变性15 s，60℃退火30 s，72℃延伸45 s，共40个循环.熔解曲线条件: 95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 15 s.标准曲线及样品均设置3个重复.每个循环的延伸阶段收集荧光信号，扩增完成后，进行熔解曲线分析.
1.5 反应器中活性污泥群落结构分析采用Illumina MiSeq对反应器不同运行时段微生物群落结构进行测定.使用PowerSoil DNA提取试剂盒(MOBIO，Carlsbad)提取污泥样品基因组DNA，NanoDrop 2000(Thermo Scientific，USA)检测DNA浓度和质量.以稀释后的基因组DNA为模板，对16S rRNA基因V4高变区进行PCR扩增，所用引物为515F (5′-GTTTCGGTGCCAGCMGCCGCG GTAA-3′)和806R (5′-GCCAATGGACTACHVGGG TWTCTAAT-3′)[13]，前引物中加有barcode序列及adaptor序列，使用高效和高保真酶进行PCR，上海维基生物科技有限公司Illumina MiSeq平台完成测序，QIIME (version 1.8.0)分析，对有效数据在97%水平上进行OTU聚类和分类学分析，利用Mothur软件对群落丰度及香农指数(Shannon)等进行计算.
1.6 分析方法混合液挥发性悬浮固体(MLVSS)的测定采用重量法. DEP含量测定采用Agilent 6890-5973N气相色谱-质谱仪，色谱柱为DB-5(30 m×250 μm×1 μm)，柱温90℃ 3 min，以15℃ ·min-1升至300℃ 7 min，运行30 min；气相色谱进样口温度为280℃, 载气为高纯氦气.
1.7 数据分析运用SPSS 21.0软件对数据进行One-Way ANONA分析，计算皮尔逊相关系数和P值，并采用LSD方法进行多重比较，利用Origin 8.0软件进行作图.
2 结果与分析 2.1 DEP降解菌的分离与鉴定经过梯度压力驯化，结合降解能力测定，获得了1株具有降解DEP能力的细菌菌株LMS13，能在pH 7.0、温度30℃条件下，4 d摇床培养，对浓度800 mg ·L-1的DEP降解率为90.7%.提取供试菌株基因组DNA，扩增16S rDNA片段，T/A克隆后测序.将序列提交到GenBank，登录号为KX156955.利用MEGA 6.0构建系统发育树(图 2).结果表明，菌株LMS13与节杆菌属(Arthrobacter humicola) JCM 15921同源性为100%，结合形态及生理生化特征，初步将LMS13鉴定为节杆菌属(Arthrobacter sp.)菌株.
|
图 2 菌株16S rDNA系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree constructed based on 16S rDNA sequences |
在反应器启动期间，强化反应器和未强化反应器进水中DEP的浓度均为200 mg ·L-1.由图 3可见，未强化反应器在运行初期对DEP去除效率低，前5 d去除率低于15%，第7 d开始上升.相反，接种DEP降解菌LMS13强化的反应器，运行3 d后，DEP去除率达到48%.随着反应器的运行，强化系统到第8 d、未强化系统到11 d达到一个相对稳定的状态，降解率分别在82.7%~84.3%和57.8%~59.4%之间，整个启动和驯化经历15 d.
|
图 3 反应器启动及污泥的驯化期间对DEP去除效果 Fig. 3 Removal rate of DEP during the startup and domestication phases |
在反应器启动和驯化结束后，通过改变进水DEP浓度，考察系统对DEP去除能力.由图 4可见，在第16 d，当DEP浓度从200 mg ·L-1增加到400 mg ·L-1时，两个反应系统对DEP的去除率都显著下降，随后逐渐上升，强化系统降解率略高于进水浓度为200 mg ·L-1时的降解率.当DEP浓度增大到800 mg ·L-1时，强化系统降解能力受到冲击，但降解率最终稳定在81%左右，这是由于降解菌(Arthrobacter sp. LMX13)是从含DEP的处理反复驯化获得，当系统DEP浓度增大时，表现出了较强的抗冲击负荷能力；而未强化系统DEP降解率迅速下降到17%，此后降解率一直低于20%.这与乔琳等[14]的结果不同，他们在研究生物强化吡啶降解时发现，添加降解菌有助于反应器的快速启动，但当吡啶浓度逐渐增大时，强化生物系统与未强化系统对吡啶去除无显著差异，分析原因认为是由于降解菌在系统中的流失所导致.
|
图 4 反应器对不同浓度DEP去除效果 Fig. 4 Removal rate of DEP in MBR under different DEP concentrations |
邻苯二甲酸双加氧酶基因(phtA)是DEP降解的关键基因[2]，每5 d采集一次污泥样品，利用q-PCR检测了MBR系统中活性污泥phtA基因数量变化，结果见图 5.从中可知，在系统运行的各阶段，强化系统中phtA基因拷贝数均大于未强化系统，在驯化阶段，系统中phtA基因数量逐渐增加.对于未强化系统，在DEP浓度为400 mg ·L-1时，phtA基因数量(以MLVSS计)最大为2.1×108 copies ·mg-1，当DEP浓度继续增大，降解基因数量下降，说明高浓度DEP对系统中phtA基因产生了抑制作用.对于强化系统，在DEP浓度增大时，phtA基因数量下降，但仍保持相对较高水平.结合图 3和图 4分析，phtA基因数量和降解率呈正相关，说明高phtA基因拷贝数是反应器中DEP降解的保证.这种关系也可以解释在第20 d、35 d以及45 d，DEP降解率下降的原因.由于单个细胞的phtA基因拷贝数是固定的，因此在实际运用中可以通过增加反应器中DEP降解功能菌数量并保证其活性以提高DEP降解效率.
|
图 5 反应器运行期间phtA基因拷贝数变化情况 Fig. 5 Changes of phtA gene copies during reactor operation |
废水处理系统对有机物的去除效果与系统中活性污泥的性能和状态有关[13]，在反应器运行期间，每5 d取一次样，对MLVSS进行了测定，考虑到污泥流失太大可能对处理效果产生影响，因此采样时不从取样口收集样品，而是直接从反应器上方采集10~15 mL污泥，结果见图 6.从中可知，两个反应系统中MLVSS变化趋势基本相同，在驯化期以及浓度为400 mg ·L-1时，MLVSS逐渐增大，但随着DEP浓度继续增大，MLVSS值下降，这可能由于高浓度DEP对降解菌群中微生物造成毒害，导致菌群生长受到限制.在强化系统中由于含有在高浓度下反复驯化的降解菌，DEP增大对MLVSS影响相对较小，也说明在活性污泥中DEP降解菌可能占有较大比例.在第60 d，DEP为800 mg ·L-1时，强化系统中MLVSS为2.2×103 mg ·L-1，而未强化系统仅为1.1×103 mg ·L-1，说明强化系统在高浓度污染负荷下降解菌群可保持较高活性，这与王金玉等[15]在研究苯胺强化降解时得出的结论一致.
|
图 6 反应器运行期间MLVSS的变化情况 Fig. 6 Changes of MLVSS during reactor operation |
结合反应器对DEP去除效果，选取在0、5、15、30、42、64 d采集的活性污泥样品，采用MiSeq对2个反应系统中的活性污泥进行测序，非强化系统和强化系统分别获得164 365条和203 097条有效16S rDNA序列数.在97%的序列相似性基础上对序列进行OTU计算，非强化系统和强化系统分别获得5 842个和6 276个OTU.基于OTU对活性污泥样本群落多样行进行计算，结果见表 1.从中可见，在驯化初期两个系统中Shannon指数相近，随着系统运行，多样性指数均呈下降趋势.随着DEP浓度逐渐增大，未经强化系统多样性指数下降迅速，当DEP浓度增大到800 mg ·L-1时，Shannon指数仅为1.31.经强化的系统，当DEP浓度增大到800 mg ·L-1，虽然多样性指数有所下降，但Shannon指数仍达3.12，这可能是由于强化系统中含有高效降解菌并在驯化初期形成了相对稳定的群落结构，说明强化系统在维持降解菌群多样性、提高降解率方面优于未经强化的系统.
|
表 1 污泥样品中细菌群落丰度和多样性指数 Table 1 Abundance and diversity of bacteria in activated sludge |
2.6.2 不同运行时段细菌群落构成
在反应器运行的不同时段采集活性污泥样本，其群落结构在门水平上分类如图 7所示.由图 7(a)可见，接种的污水处理厂二沉池活性污泥主要由变形菌门(Proteobacteria)组成，占整个系统的40%左右，其中又以β-变形纲(β-Proteobacteria)为主.其次为拟杆菌门(Bateroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)，酸杆菌门(Fusobacteria)也占有相当比例.对于未强化系统，随着驯化进行，拟杆菌门(Bateroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)以及变形菌门(Proteobacteria)中的γ-变形纲(γ-Proteobacteria)丰度逐渐降低，到驯化结束时，β-变形纲(β-Proteobacteria)丰度略有增加，浮霉菌门(Planctomycete)丰度由接种初期的5%增加到7%，放线菌门(Actinobacteria)丰度1%增加到12%.当进水中DEP浓度逐渐升高，梭杆菌门(Clostridia)、ε-变形纲(ε-Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)丰度急剧下降，当DEP浓度增大到800 mg ·L-1时，梭杆菌门(Clostridia)仅占1%，而ε-变形纲(ε-Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)从系统中消失.由图 7(b)可见，对于强化系统，其群落结构变化与未强化系统相似，但强化系统在驯化期，放线菌门(Actinobacteria)就占有较大比例，这与DEP降解菌的投入有一定关系，在驯化结束时占22%，随后保持在35%左右.当DEP浓度达到800 mg ·L-1时，对放线菌门(Actinobacteria)丰度影响较小，这是由于降解菌LMS13是经DEP反复驯化，DEP增加对其毒害相对较小，且由于在高浓度DEP作用下其它菌群消失，反而导致其相对丰度有所增加.在反应器运行期间，变形菌门中的β-变形菌纲(β-Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)为DEP降解系统中的优势菌门.
|
(a)未强化系统；(b)为强化系统 图 7 活性污泥样品在门分类水平上的细菌群落组成 Fig. 7 Bacterial composition at the phylum level from activated sludge |
活性污泥群落结构在属水平上分类如图 8所示，在系统启动初期，主要由硝化螺菌属(Nitrospira)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)、从毛单胞菌属(Clostridium)以及陶厄氏菌属(Thauera)等组成，这与城市污水处理活性泥中主要菌属类型一致[16].由图 8(a)可见，对于未强化系统，随着驯化进行，梭菌属(Clostridium)，陶厄氏菌属(Thauera)细菌在系统中所占比例逐渐下降，在驯化结束时，相对丰度分别于由8%和7%下降到1%和3%，在运行后期，当DEP浓度增大时，梭菌属(Clostridium)和Micropruina从系统中淘汰.相反，随着DEP浓度增大，系统中红环菌属(Rhodocyclus)，博得氏杆菌属(Bordetella)比例增加.由图 8(b)可知，强化系统反应器在运行初期，节杆菌属(Arthrobacter)明显高于未强化系统，这与降解菌LMS13直接加入有关，随着驯化进行，短杆菌属(Brevibacterium)、纤维菌属(Cellulomonas)、博得氏杆菌属(Bordetella)以及在未强化系统同样有增加趋势的红环菌属(Rhodocyclus)相对丰度增加，但与未强化系统不同的是梭菌属(Clostridium)，Micropruina属未从系统中消失.在两个反应系统中硝化螺菌属(Nitrospira)、亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)、不动杆菌属(Acinetobacter)以及陶厄氏菌属(Thauera)在反应器运行期间均存在，这些菌属为主要的脱氮除磷微生物[17]，反应器是否同时具有一定的脱氮除磷能力还有待研究.由以上分析可知，红环菌属(Rhodocyclus)、博得氏杆菌属(Bordetella)、节杆菌属(Arthrobacter)以及短杆菌属(Brevibacterium)为DEP处理系统中的优势菌属，可能在DEP去除过程中起着关键作用.
|
(a)未强化系统; (b)为强化系统 图 8 活性污泥样品在属分类水平上的细菌群落组成 Fig. 8 Bacterial composition at the genus level from activated sludge |
实验中采用从活性污泥中分离到的DEP降解菌用以强化DEP降解，从启动时间看，强化系统缩短了反应器启动时间，未强化系统中活性污泥由于不适应DEP，导致驯化初期出水中DEP浓度高，启动时间慢.生物强化在加速反应器的启动、提高对有机物降解能力方面已有相关报道[18, 19]，例如宋国军等[20]采用生物强化溴氨酸(BAA)降解，经过30 d驯化，运行达到稳定，进水BAA浓度为550 mg ·L-1时，HRT为11 h时，脱色率达98%，COD去除率在50%左右.但也有研究结果显示，在生物强化反应中，降解菌的投加只能加速启动时间，对有机物质去除效果不显著[14]，分析认为在污染物浓度高于纯菌驯化浓度时，强化系统的降解菌发生流失.也有研究发现生物强化作用优势仅表现在投菌初期，后期由于投加的强化菌被系统中的原生动物捕食而从系统中消失[21]，因此在进行生物强化时，如何保证外源强化菌在长期运行过程中不流失，是生物强化作用中需要解决的问题，对其调控机制还有待系统研究.尽管本次实验中DEP降解菌投入后，在系统中保持了一定数量和活性，但其控制因素还有待开展进一步实验.当前，生物强化的工程化应用研究报道还较少，仅见赵立军等[22]采用联合投菌方法，低温条件下12 d实现对哈尔滨太平污水厂生化池成功启动的报道.
在PAEs的好氧降解过程中，酯键的水解是一个共同的起始步骤，在微生物酯酶作用下，PAEs水解形成邻苯二甲酸单酯，再生成邻苯二甲酸，其中邻苯二甲酸的降解是完成整个降解过程的关键步骤[6]，而这个步骤由邻苯二甲酸双加氧酶基因phtA控制，因此，phtA是DEP最终实现矿化的关键基因.反应器中phtA基因拷贝数和降解率呈正相关，phtA的高拷贝数是DEP降解效率的保证，由于特定细胞其phtA基因拷贝数是一定的，因而可通过增加降解菌数量以提高phtA，但在实际运用过程中，过量降解菌投入是否会因竞争等因素对菌群结构产生影响从而破坏反应系统值得深入研究.
在活性污泥系统中，微生物是污染物去除的主体，系统的稳定运行依赖其中的微生物群落结构及其活性[15, 23]，认识反应系统中微生物群落结构的动态变化规律，对维持活性污泥系统的稳定运行具有重要作用.在反应器运行期间，活性污泥的群落结构发生变化，随着DEP浓度升高，活性污泥中的梭杆菌门(Clostridia)丰度急剧下降，ε-变形纲(ε-Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)从系统中消失，而β-变形纲(β-Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)丰度增加，为系统中的优势菌门.在属水平上，红环菌属(Rhodocyclus)、博得氏杆菌属(Bordetella)、节杆菌属(Arthrobacter)以及短杆菌属(Brevibacterium)存在于反应器运行的各阶段.其中博得氏杆菌属(Bordetella)菌株被广泛报道具有有机污染物去除能力[24]，短杆菌属(Brevibacterium)菌株能产生表面活性剂[25]，因此在反应系统中这些菌属可能起到了联合降解DEP的作用.
4 结论(1)采用梯度压力驯化法，从活性污泥中分离到1株DEP高效降解菌，经T/A克隆后鉴定为节杆菌属菌株(Arthrobacter sp.).将其运用到MBR系统，缩短了反应器启动时间、提高了系统的抗冲击负荷能力，对进水浓度为800 mg ·L-1的DEP，在系统运行后期平均去除率达到81%，是未经强化系统去除率的4倍.
(2)在驯化期以及在浓度为400 mg ·L-1时，MLVSS逐渐增大，但随着DEP浓度继续增大，MLVSS值下降. phtA降解基因拷贝数与DEP降解率呈正相关，phtA降解基因高拷贝数是高浓度DEP降解的保证.
(3)经过驯化，反应器中细菌多样性指数下降，在DEP作用下富集了特定的微生物菌群.在反应器运行过程中，拟杆菌门(Bateroidetes)和厚壁菌门(Firmicutes)丰度降低，ε-变形纲(ε-Proteobacteria)、绿弯菌门(Chloroflexi)逐渐从系统中消失，而β-变形纲(β-Proteobacteria)和放线菌门(Actinobacteria)成为系统中的优势菌门.红环菌属(Rhodocyclus)、博得氏杆菌属(Bordetella)、节杆菌属(Arthrobacter)为优势菌属，在DEP降解体系及反应器稳定运行中起着重要作用.
| [1] | 张静, 陈会明. 邻苯二甲酸酯类增塑剂的危害及监管现状[J]. 现代化工, 2011, 31(12) : 1–6. Zhang J, Chen H M. Hazards and supervision status of phthalate plasticize[J]. Modern Chemical Industry, 2011, 31(12) : 1–6. |
| [2] | 郭静波, 陈微, 姜丽杰, 等. 邻苯二甲酸二丁酯生物降解研究进展[J]. 应用与环境生物学报, 2014, 20(6) : 1104–1110. Guo J B, Chen W, Jiang L J, et al. Research progresses in dibutyl phthalate biodegradation[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2014, 20(6) : 1104–1110. |
| [3] | Wittassek M, Angerer J, Kolossa-Gehring M, et al. Fetal exposure to phthalates-a pilot study[J]. International Journal of Hygiene and Environmental Health, 2009, 212(5) : 492–498. DOI: 10.1016/j.ijheh.2009.04.001 |
| [4] | 金雷, 严忠雍, 施慧, 等. 邻苯二甲酸二丁酯DBP降解菌S-3的分离、鉴定及其代谢途径的初步研究[J]. 农业生物技术学报, 2014, 22(1) : 101–108. Jin L, Yan Z Y, Shi H, et al. Identification of a Dibutyl Phthalate (DBP)-degrading strain S-3 and preliminary studies on the metabolic pathway[J]. Journal of Agricultural Biotechnology, 2014, 22(1) : 101–108. |
| [5] | Gu J D, Li J, Wang Y. Biochemical pathway and degradation of phthalate ester isomers by bacteria[J]. Water Science and Technology, 2005, 52(8) : 241–248. |
| [6] | 骆祝华, 黄翔玲, 叶德赞. 环境内分泌干扰物-邻苯二甲酸酯的生物降解研究进展[J]. 应用与环境生物学报, 2008, 14(6) : 890–897. Luo Z H, Huang X L, Ye D Z. Advances in research of biodegradation of environmental endocrine disruptors-phthalate esters[J]. Chinese Journal of Applied and Environmental Biology, 2008, 14(6) : 890–897. |
| [7] | Wang J L, Zhao X, Wu W Z. Biodegradation of phthalic acid esters (PAEs) in soil bioaugmented with acclimated activated sludge[J]. Process Biochemistry, 2004, 39(12) : 1837–1841. DOI: 10.1016/j.procbio.2003.08.005 |
| [8] | 温志丹, 高大文, 李喆, 等. 邻苯二甲酸酯降解菌的分离鉴定及降解特性[J]. 哈尔滨工业大学学报, 2013, 45(12) : 38–42. Wen Z D, Gao D W, Li Z, et al. Isolation and identification of phthalate-degrading bacteria and their characteristics[J]. Journal of Harbin Institute of Technology, 2013, 45(12) : 38–42. |
| [9] | Wang Y Y, Miao B, Hou D M, et al. Biodegradation of di-n-butyl phthalate and expression of the 3, 4-phthalate dioxygenase gene in Arthrobacter sp. ZH2 strain[J]. Process Biochemistry, 2012, 47(6) : 936–940. DOI: 10.1016/j.procbio.2012.02.027 |
| [10] | Herrero M, Stuckey D C. Bioaugmentation and its application in wastewater treatment: a review[J]. Chemosphere, 2015, 140 : 119–128. DOI: 10.1016/j.chemosphere.2014.10.033 |
| [11] | 郭渊明, 刘春, 郭亚楠, 等. 不同生物反应器中基因工程菌生物强化处理阿特拉津研究[J]. 环境科学, 2011, 32(2) : 554–559. Guo Y M, Liu C, Guo Y N, et al. Bioaugmented treatment of atrazine by genetically engineered microorganism in different bioreactors[J]. Environmental Science, 2011, 32(2) : 554–559. |
| [12] | 王艳芬, 王海磊, 刘国生, 等. 序批式反应器生物强化处理苯酚废水的研究[J]. 环境污染与防治, 2008, 30(5) : 42–46. Wang Y F, Wang H L, Liu G S, et al. Bioaugmented SBR treatment of phenol wastewater[J]. Environmental Pollution and Control, 2008, 30(5) : 42–46. |
| [13] | Zhou J, Guan D W, Zhou B K, et al. Influence of 34-years of fertilization on bacterial communities in an intensively cultivated black soil in northeast China[J]. Soil Biology and Biochemistry, 2015, 90 : 42–51. DOI: 10.1016/j.soilbio.2015.07.005 |
| [14] | 乔琳, 王建龙. 利用T-RFLP解析生物强化去除吡啶过程中微生物种群动态变化[J]. 环境科学学报, 2012, 32(5) : 1025–1032. Qiao L, Wang J L. The analyses of microbial community dynamics by T-RFLP during the bioaugmented removal of pyridine in SBR[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2012, 32(5) : 1025–1032. |
| [15] | 王金玉, 李旭东, 刘庆华. 荧光定量PCR检测生物强化SBR系统中苯胺降解菌的数量变化[J]. 环境科学学报, 2014, 34(7) : 1674–1679. Wang J Y, Li X D, Liu Q H. Monitoring of the number changes of aniline-degrading bacterium in bioaugmented system by quantitative Real-time PCR[J]. Acta Scientiae Circumstantiae, 2014, 34(7) : 1674–1679. |
| [16] | 闻韵, 王晓慧, 林常青. Miseq测序分析活性污泥系统中细菌群落的动态变化[J]. 环境工程学报, 2015, 9(11) : 5225–5230. Wen Y, Wang X H, Lin C Q. Bacterial community dynamics in an activated sludge system based on Miseq sequencing[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2015, 9(11) : 5225–5230. |
| [17] | Chen Q, Ni J R, Ma T, et al. Bioaugmentation treatment of municipal wastewater with heterotrophic-aerobic nitrogen removal bacteria in a pilot-scale SBR[J]. Bioresource Technology, 2015, 183 : 25–32. DOI: 10.1016/j.biortech.2015.02.022 |
| [18] | Tahhan R A, Ammari T G, Goussous S J, et al. Enhancing the biodegradation of total petroleum hydrocarbons in oily sludge by a modified bioaugmentation strategy[J]. International Biodeterioration & Biodegradation, 2011, 65(1) : 130–134. |
| [19] | 高晨晨, 郑兴灿, 游佳, 等. 城市污水脱氮除磷系统的活性污泥菌群结构特征[J]. 中国给水排水, 2015, 31(23) : 37–42. Gao C C, Zheng X S, You J, et al. Structure characteristics of activated sludge microbial communities in nitrogen and phosphorus removal system of municipal wastewater[J]. China Water & Wastewater, 2015, 31(23) : 37–42. |
| [20] | 宋国军, 王竞, 周集体, 等. 生物强化序批式膜生物反应器处理溴氨酸废水[J]. 中国环境科学, 2008, 28(3) : 229–232. Song G J, Wang J, Zhou J T, et al. Treatment of bromoamine acid wastewater in bioaugmented sequencing batch membrane bioreactor[J]. China Environmental Science, 2008, 28(3) : 229–232. |
| [21] | Yu F B, Ali S W, Guan L B, et al. Bioaugmentation of a sequencing batch reactor with Pseudomonas putida ONBA-17, and its impact on reactor bacterial communities[J]. Journal of Hazardous Materials, 2010, 176(1-3) : 20–26. DOI: 10.1016/j.jhazmat.2009.06.006 |
| [22] | 赵立军, 马放, 赵庆建, 等. 生物强化技术在污水厂快速启动中的工程应用[J]. 哈尔滨工业大学学报, 2007, 39(12) : 1886–1889. Zhao L J, Ma F, Zhao Q J, et al. Practical application of bioaugmentation technology during rapid start-up of a sewage treatment plant[J]. Journal of Harbin Institute of Technology, 2007, 39(12) : 1886–1889. |
| [23] | 魏健, 宋永会, 赵乐. MBR处理腈纶废水的效能及微生物群落结构分析[J]. 环境科学, 2014, 35(12) : 4610–4617. Wei J, Song Y H, Zhao L. Capability and microbial community analysis of a membrane bioreactor for acrylic fiber wastewater treatment[J]. Environmental Science, 2014, 35(12) : 4610–4617. |
| [24] | 张楠, 陈波水, 杨致邦, 等. 润滑油降解菌的分离、鉴定及降解特性[J]. 环境科学研究, 2010, 23(6) : 748–753. Zhang N, Chen B S, Yang Z B, et al. Isolation, identification and degradation characteristics of bacterial strains for biodegradation of lubricating oil[J]. Research of Environmental Sciences, 2010, 23(6) : 748–753. |
| [25] | 曹文娟, 吴蔓莉, 张明辉, 等. 石油降解菌的筛选优化及其对油污土壤的修复特性[J]. 环境工程学报, 2014, 8(12) : 5493–5498. Cao W J, Wu M L, Zhang M H, et al. Isolation and optimization of petroleum degrading bacteria and their bioremediation effects on petroleum-contaminated soil[J]. Chinese Journal of Environmental Engineering, 2014, 8(12) : 5493–5498. |