2016, Vol. 37
随着城市化和工业化发展，低碳高氨氮污水排放量大幅增加.对于猪场沼液、污泥厌氧消化液以及垃圾渗滤液、焦化废水、味精废水等低COD/N废水处理，目前传统的生物硝化-反硝化脱氮工艺由于碳源不足面临脱氮效率低的窘境[1].而建立在短程硝化基础上的部分半硝化和厌氧氨氧化工艺的组合被认为是处理低COD/N废水一个突破性的成果[2~6].该工艺与传统的全程硝化-反硝化工艺相比，可节省50%的氧气和100%的外加有机碳源，且污泥产量低，具有非常好的应用前景[7~9].由于厌氧氨氧化过程以亚硝酸盐作为电子受体，将氨直接转化为氮气，因此部分亚硝化工艺[将50%~60%的氨氮氧化至亚硝酸盐氮，控制出水NO2--N/NH4+-N在(1~1.32) :1之间]作为ANAMMOX的前处理工艺受到越来越多的重视[10~12].
近年来，有许多学者展开了相关的研究.李长波等[13]采用序批式生物反应器(SBR)，以经生物流化床处理后的腈纶废水(氨氮浓度为116~181 mg ·L-1)为原水，采用低DO浓度(0.30~0.40 mg ·L-1)的策略，在pH值为7.2~7.6、温度为30~35℃，曝气时间为10 h条件下，经过27 d的连续运行，成功实现了部分半硝化系统的快速启动.在此条件下稳定运行后，平均亚硝化率可达到95%以上. Guo等[14]采用SBR反应器在进水氨氮浓度为147 mg ·L-1，DO为1.0 mg ·L-1，曝气时间为3 h，温度为30℃，pH为8.3±0.1条件下，反应器运行100 d后，部分半硝化工艺实现，稳定运行后平均亚硝化率可达到80%以上.李祥等[15]同样采用SBR反应器，以控制DO浓度的策略，将DO浓度维持在0.5~1mg ·L-1，77 d后，基本实现了部分半硝化反应器成功启动，亚硝化率在70%左右.
上述研究，一方面多采用限制DO实现部分半硝化工艺的启动运行，然而低DO环境的维持需要精准的DO浓度反馈和控制，并且DO浓度的波动会立即影响反应器出水中的NO2--N/NH4+-N比例，进而会影响整个脱氮工艺的效能.而游离氨(FA)浓度亦可作为控制亚硝化的关键因素[16].另一方面，已有的研究采用的接种污泥多为普通活性污泥，反应器运行过程中，存在污泥易流失、承受容积负荷率低等问题[17].而好氧颗粒污泥工艺凭借其良好的沉降性能、多样的微生物种群及密实的颗粒结构等优点，可以有效改善上述问题；并且好氧颗粒污泥具有独特的空间结构，其由边缘及内部存在溶解氧渗透梯度，形成好氧、缺氧或厌氧沿梯度方向分布的区域环境[18]，亚硝化菌的氧饱和系数较硝化菌低，使得颗粒污泥系统更适宜培养以亚硝化菌为主的菌群，有利于快速实现部分亚硝化.
因此，本研究采用序批式污泥反应器(SBR)，接种成熟好氧颗粒污泥(AGS)，通过逐步提高氨氮浓度策略实现部分半硝化的成功启动，同时解析部分半硝化工艺的微生物种群结构组成，以期为该工艺在实际工程中的应用提供一定的实验依据和理论基础.
1 材料与方法 1.1 实验装置与运行方式采用有机玻璃加工而成的SBR反应器(图 1).反应器高20 cm，长10 cm，有效容积为1.5 L；底部设置直径为8 cm的曝气盘，通过气泵和曝气盘为反应过程提供溶解氧，由转子流量计控制曝气量，DO浓度约为0.8 mg ·L-1.反应器每天运行两个周期，每个周期12 h，其中进水5 min，曝气360 min，沉淀5 min，排水5 min，余下时间为闲置.每周期排水量为反应器有效容积的50%.反应温度保持在30℃左右.根据进水氨氮浓度变化分为4个阶段:第一阶段Ⅰ(1~23 d)，ρ(NH4+-N)为70~85 mg ·L-1；第二阶段Ⅱ(25~89 d)，ρ(NH4+-N)为100~130 mg ·L-1；第三阶段Ⅲ(91~117 d)，ρ(NH4+-N)为160~200 mg ·L-1；第四阶段Ⅳ(119~167 d)，ρ(NH4+-N)为200~300 mg ·L-1.反应器运行过程中，根据实际情况进行排泥，使反应器内污泥龄约为20 d.
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1.进水箱；2.进水泵；3.曝气盘；4.气体流量计；5.曝气泵；6、7.pH计、DO仪探头；8.排泥箱；9.出水箱；10.出水控制阀；11.溶解氧仪；12.pH计；13.自动控制箱 图 1 SBR实验装置示意 Fig. 1 Schematic diagram of SBR |
实验用水为人工模拟废水，以葡萄糖、柠檬酸三钠为碳源，(NH4)2SO4为氮源，KH2PO4为磷源，NaHCO3提供碱度，pH约为7.8.同时，加入1 mL含Fe3+、Cu2+等离子微量元素储备液.主要配水材料见表 1；废水主要指标ρ(COD)为200~300 mg ·L-1，ρ(NH4+-N)为70~300 mg ·L-1，ρ(TN)为70~300 mg ·L-1，ρ(TP)为2~3.5 mg ·L-1.
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表 1 实验配水材料/mg ·L-1 Table 1 Composition of the simulated wastewater/mg ·L-1 |
1.3 接种污泥
接种污泥取自本课题组实验室培养成熟的好氧颗粒污泥[19]，污泥呈椭球状，黄色.粒径大约为0.6~1.5 mm，污泥浓度(MLSS)为4 000 mg ·L-1，污泥体积指数(SVI)为35 mL ·g-1.
1.4 分析项目与方法 1.4.1 水质指标分析化学需氧量(COD)、氨氮(NH4+-N)、硝态氮(NO3--N)、亚硝态氮(NO2--N)、总氮(TN)等，均采用国家标准方法测定[20]. DO采用YSI DO200型溶解氧仪测定；pH采用雷磁PHSJ-4A型pH计测量.
1.4.2 污泥样品采集及测序实验流程分别取接种颗粒污泥和部分半硝化AGS-SBR启动成功运行期末的颗粒污泥样品进行高通量测序分析.其中，Control为接种好氧颗粒污泥；HAP为反应器启动成功(第170 d)的污泥样品.首先，采用淤泥基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)，根据说明提取样品DNA，并将DNA提取物在-20℃条件下保存.然后，采用对16S rRNA基因V3、V4区域具有特异性的引物对338F: 5′-ACTCCT ACGGGAGGCAGCA-3′，806R: 5′-GGACTACHVGG GTWTCTAAT-3′，进行PCR扩增. PCR执行程序: 95℃预变性2 min，然后执行95℃变性30 s、55℃退火30 s、72℃延伸30 s，共30个循环，最后再72℃退火5 min，扩增产物保持在4℃条件下.将同一样本的PCR产物混合后用2%琼脂糖电泳检测，采用AxyPrepDNA凝胶回收试剂盒(AXYGEN公司)切胶回收PCR产物；然后，参照电泳初步定量结果，将PCR产物用QuantiFluorTM -ST蓝色荧光定量系统(Promega公司)进行检测定量，取合适的浓度进行EmPCR (平行扩增)，用Illumina MiSeq系统测序(上海美吉生物医药科技有限公司)，得到优化序列；对优化序列在97%相似度水平进行OTU聚类分析和物种分类学分析，分析样品的多样性以及群落结构[21, 22].
2 结果与讨论 2.1 启动过程中反应器脱氮性能 2.1.1 NH4+-N及TN的去除变化分析实验过程中反应器进出水NH4+-N、TN浓度及其去除率的变化情况如图 2、图 3所示.逐步提高进水氨氮浓度，同时增加有机物浓度，保证进水COD/N比为1.0~1.5之间.初始Ⅰ阶段(1~23 d)，进水NH4+-N浓度在70~85 mg ·L-1波动，由于反应器内的氨氮浓度相对较低以及接种的成熟颗粒污泥结构稳定，利于对氨氮的去除，此阶段NH4+-N平均出水浓度为4.79 mg ·L-1，平均去除率为93.9%；第Ⅱ阶段(25~89 d)，提高进水氨氮浓度在100~130 mg ·L-1，氨氮去除率呈下降趋势，氨氮平均去除率为81.73%，出水中的氨氮也有所增加，氨氮平均出水浓度为22.01 mg ·L-1；第Ⅲ阶段(91~117 d)，继续提高进水氨氮浓度在200 mg ·L-1左右，氨氮平均去除率为75.51%，出水氨氮浓度平均为41.28 mg ·L-1.结合图 4可知，此时NO2--N的积累率高达90%左右，出水NO3--N浓度低于10 mg ·L-1，结果表明通过提高氨氮浓度实现了好氧氨氧化细菌(AOB)富集，短程硝化实现.第Ⅳ阶段(117~167 d)，进水氨氮浓度提高至300 mg ·L-1左右，氨氮平均去除率为72.34%，而出水氨氮浓度平均为63.4 mg ·L-1.陈益明[23]和李东等[24]曾分别采用半碱度和降低DO浓度控制亚硝化程度来启动部分半硝化过程中，氨氮变化特征和本研究结果类似.
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图 2 启动过程NH4+-N及其去除率的变化情况 Fig. 2 Variations of NH4+-N concentration and its removal rate during the start-up process |
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图 3 启动过程TN及其去除率的变化情况 Fig. 3 Variations of TN concentration and its removal rate during the start-up process |
同时，图 3表明，反应器在第Ⅰ阶段中，对废水TN的平均去除率只有29.75%；而在第Ⅱ、Ⅲ阶段，反应器对TN的去除效率逐渐升高，第60 d开始明显升高，TN平均去除率为62.04%.结合图 4，可看出氨氮大部分转化为NO2--N，此时，出水NO2--N的积累率达到70%以上，部分半硝化工艺初步形成.第Ⅳ阶段，随着进水氨氮浓度的进一步升高，反应器对TN的去除能力略微下降，虽有波动，但对TN的平均去除率最后基本维系在60%左右，这与张子健等[25]和陈建伟等[26]的实验结果类似.进水高氨氮浓度使反应器对AOB菌的选择作用为部分半硝化创造了条件.
2.1.2 出水NO3--N、NO2--N浓度变化及NO2--N的积累率本实验过程中，反应器出水NO3--N、NO2--N浓度变化及NO2--N的积累率变化如图 4所示.第Ⅰ阶段(1~23 d)，氨氮平均去除率可达到93.90%，出水NO2--N平均浓度仅为11.54 mg ·L-1，而出水NO3--N平均浓度却达到54.19 mg ·L-1，说明此时反应器内氨氮大部分被氧化成硝态氮，即亚硝化氧化细菌(NOB)的数量在反应初期高于AOB.第Ⅱ阶段，提高进水氨氮浓度至100~130 mg ·L-1，出水NO2--N浓度逐渐上升，而NO3--N浓度逐渐下降，反应器运行到第60d时，NO3--N浓度显著降低到3.21 mg ·L-1，NO2--N浓度为32.46 mg ·L-1，NO2--N的累积率达到了79.52%.第Ⅲ阶段，进一步提高进水氨氮浓度到160~200mg ·L-1，NO2--N出水浓度不断提高，NO3--N出水浓度不断降低，NO2--N累积率平均维系在90.06%左右.由图 4可以看出，在前3个阶段，随着进水氨氮浓度的升高，亚硝化率持续上升，第60 d时，部分亚硝化现象明显，部分半硝化工艺初步形成.这与李祥等[27]利用低DO富集AOB，积累NO2--N过程相似.第Ⅳ阶段，进水氨氮浓度为200~300 mg ·L-1，NO2--N其平均累积率为81.22%，NO2--N平均出水浓度为68.97 mg ·L-1，氨氮浓度为63.40 mg ·L-1，NO2--N/NH4+-N比为1.09.本实验结果说明，自AGS-SBR反应器运行的第60 d开始到反应器运行的第170 d里，通过提高进水氨氮浓度的策略形成的部分半硝化工艺，均表现出较稳定的亚硝酸盐积累(80%以上)，同时实验结果表明，逐步提高进水氨氮浓度的策略形成的部分半硝化AGS-SBR工艺有利于保证长期稳定运行.
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图 4 启动过程NO3--N、NO2--N浓度及其积累率的变化情况 Fig. 4 Variations of NO3--N, NO2--N concentrations and their accumulation rates during the start-up process |
整个反应器运行期间，出水NO2--N/NH4+-N的比值变化情况如图 5所示.启动初期，反应器具有较高的氨氮去除率，出水氨氮浓度很低且NO2--N浓度处于不断上升过程，故NO2--N/NH4+-N值较高，高达2.56.第Ⅱ阶段初期，由于出水氨氮浓度升高，NO2--N/NH4+-N值降低，在0.85~2.09波动.结合图 2、4发现，在反应器运行的第60 d开始，随着NO2--N积累率升高和NH4+-N转化率降低，NO2--N/NH4+-N比值大部分在0.9~1.5之间波动，部分半硝化现象初步形成.有研究发现，当出水NO2--N和NH4+-N的比为1.0~1.3时，基本能满足厌氧氨氧化进水要求，即部分半硝化启动成功[28].在第Ⅲ阶段，NO2--N平均出水浓度为52.22 mg ·L-1，氨氮平均出水浓度为41.28 mg ·L-1，NO2--N/NH4+-N比值平均达到1.27左右，符合ANAMMOX反应进水要求.此时氨氮转化率平均为70%左右，亚硝化率达到76.59%，氨氮转化率虽然高于张昭等[29]报道的54%，但其亚硝化积累率相差无几.此后反应器运行的第Ⅳ阶段里，平均出水NO2--N/NH4+-N值基本稳定在1.10左右.有研究者曾采用半碱度策略，控制约50%的NH4+-N转化为NO2--N，出水NO2--N/NH4+-N比为1.0，基本能保证部分亚硝化工艺稳定维系.虽然本研究采用提高进水氨氮浓度的策略和前者不同[28, 29]，但同样可以使反应器出水NO2--N/NH4+-N比值在稳定期维系在1.1左右，满足ANAMMOX反应进水要求.
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图 5 NO2--N/NH4+-N值变化情况 Fig. 5 Variations of NO2--N/NH4+-N with time |
为明确部分半硝化AGS-SBR中微生物菌群结构组成，采用高通量测序技术对接种污泥和部分半硝化AGS-SBR启动成功运行期末的污泥样品进行测序分析.其中，Control为接种好氧颗粒污泥；HAP为反应器启动成功(第170d)的污泥样品. 图 6为污泥样品微生物菌群的相对丰度(门水平).接种时期污泥样品中主要菌群为: Candidate-division-TM7(相对丰度为69.24%)、变形菌门(Proteobacteria)(24.88%)、放线菌门(Actinobacteria)(1.33%)、疣微菌门(Verrucomicrobia)(1.13%)、厚壁菌门(Firmicutes)(0.42%)；启动成功污泥样品中主要菌门有: Candidate-division-TM7(68.63%)、变形菌门(Proteobacteria)(13.56%)、拟杆菌门(Bacteroidetes)(9.18%)、厚壁菌门(Firmicutes)(3.64%)、绿弯菌门(Chloroflexi)(2.26%)、绿菌门(Chlorobi)(1.17%).同时在两个样品中Candidate-division-TM7菌群所占比重最大，其次是变形菌门(Proteobacteria).
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图 6 污泥样品微生物菌群的相对丰度(门水平) Fig. 6 Relative abundance of bacterial community of sludge samples at phylum level |
图 7为污泥样品微生物菌群组成及其相对丰度(属水平).接种污泥样品中的主要优势菌属有: Candidate_division-TM7-norank (69.24%)、Ottowia(4.83%)、NKB5_norank (3.38%)、紫细菌属(Rhodobacter) 3.14%、德沃斯氏菌属(Devosia) 2.97%、未分类生丝微菌(Hyphomicrobiaceae-unclassifieds) 2.43%、黄杆菌(Flavobacterium) 1.5%、Pseudoxanthomonas (1.39%)、申氏杆菌属(Shinella) 1.35%；而部分半硝化AGS-SBR启动成功运行期末的主要优势菌属有: Candidate-division-TM7-norank(68.63%)、Saprospiraceae-uncultured(8.26%)、索氏菌属Thauera(4.63%)、Denitratisoma(3.16%)、Anaerolineaceae-uncultured(1.63%)和Anaerovorax(1.39%).从污泥主要种群和丰富度来看，接种污泥和部分半硝化污泥样品中共有的优势菌属是Candidate_division_TM7-norank，在反应器内始终占主导地位；但是，随着进水氨氮浓度的提高，部分半硝化工艺的形成，反应器系统内其他菌群结构组成则发生了较大的改变，如接种污泥的黄杆菌属、Devosia、申氏杆菌属的含量逐渐下降并最终被淘洗出系统，说明其不适应在高氨氮浓度环境中存在；随着部分半硝化工艺的形成，Saprospiraceae-uncultured、Thauera、Denitratisoma、Anaerolineaceae-uncultured、Anaerovorax成为新的主导菌群.
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图 7 启动过程中污泥微生物菌属分布 Fig. 7 Genus distribution of sludge during the startup phase |
取反应器接种以及启动成功时期的颗粒污泥样品，基于16S rRNA的多样性分析，与氨氧化菌(AOB)、亚硝酸氧化菌(NOB)、反硝化菌和厌氧氨氧化菌有关的菌群如表 2所示.
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表 2 与AOB、NOB、反硝化菌和厌氧氨氧化菌相关的群菌群(属水平) Table 2 Relative abundance of AOB, NOB, denitrifies and ANAMMOXbacteria at genus level |
亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)是革兰氏阴性自养好氧菌，是SHARON-ANAMMOX反应器处理系统中最常见的菌群之一[30].本研究中，从表 2中可以看出，接种污泥样品中几乎不含亚硝化单胞菌属(Nitrosomonas)，而成功启动时其丰度达到0.652%，说明逐步提高氨氮的进水方式有利于AOB菌的富集，这与Amann等[31]研究结果基本相似. AOB菌群的明显富集，和AGS-SBR反应器运行性能基本吻合，即在反应器运行后期，氨氮主要转化为NO2--N.
在接种污泥中，Comamonadaceae和Flavobacterium具有较高的丰度(分别为5.712%和1.497%).有研究发现，Comamonadaceae和Flavobacterium具有较好的反硝化脱氮效率[32]，因此，使AGS-SBR反应器运行初期，系统对氨氮、TN去除就表现出较高的去除率；但是，随着进水氨氮浓度的提高，直至部分半硝化工艺形成后，二者丰度明显降低.实验结果表明，高氨氮浓度的环境可能不利于Comamonadaceae和Flavobacterium的有效富集.
与此同时，一些能够适应低碳高氨氮环境的脱氮菌群丰度明显增多，如Denitratisoma、Thauera和Bacillus. Denitratisoma是红环菌科的一个新属，是一类新型的具有好氧反硝化能力的菌群，能直接将亚硝态氮转化为气态氮；索氏菌属(Thauera)是一类自养反硝化菌，能利用H2作为电子受体还原硝态氮[33]，而本实验结果中，其在部分半硝化系统中的丰度明显增加(4.61%)，成为主导脱氮菌群，将反应器内NO3--N还原为气态氮，导致反应器运行后期，对TN的去除效率一直保持较高的水平(去除率基本在60%).
Kumar等[34]研究发现，芽孢杆菌属(Bacillus)适应性较强，在各种条件下均有较好的反硝化效率.同时，研究也发现部分半硝化AGS-SBR反应器内有厌氧氨氧化菌Candidatus的存在.因此本研究发现部分半硝化工艺启动成功时反应器中存在自养反硝化、短程脱氮、厌氧氨氧化等多种脱氮途径是一个复杂的混合系统，使本研究中部分半硝AGS-SBR工艺的TN去除率达到了62.04%，缓解了后续工艺上的脱氮压力.综上，高氨氮浓度对部分半硝化工艺的启动运行起至关重要的作用，随着氨氮浓度的提高，系统内菌群结构发生了较大的变化，微观上体现了部分半硝化工艺的启动过程以及成功实现.
3 结论(1)在序批式污泥反应器(SBR)中，接种好氧颗粒污泥，处理低COD/N废水，在pH 7.5~8.5，温度为30℃，DO约为0.8 mg ·L-1的条件下，通过逐步提高进水氨氮浓度策略，60 d后部分半硝化工艺初步启动成功.反应器成功运行期间，氨氮、TN平均去除率分别为72.34%和60%，氨氮平均出水浓度为63.40 mg ·L-1，NO2--N平均出水浓度为68.97 mg ·L-1，NO2--N平均积累率为81.22%，NO2--N/NH4+-N比为1.1左右.
(2)高通量测序结果表明，和接种污泥相比，部分半硝化AGS-SBR工艺系统内微生物菌群结构发生了明显变化.部分半硝化工艺反应器中主要优势菌群(门水平)有: Candidate-division-TM7、变形菌门(Proteobacteria)、拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、绿弯菌门(Chloroflexi)、绿菌门(Chlorobi)；(属水平)主要有: Candidate-division-TM7-norank、Saprospiraceae-uncultured、Thauera、Denitratisoma、Anaerolineaceae-uncultured和Anaerovorax.
(3)部分半硝化AGS-SBR系统中，与脱氮功能相关的菌群为: Nitrosomonas、Denitratisoma、Thauera和Bacillus等.
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