2016, Vol. 37
膜过滤处理工艺因其出水浊度低、处理效率高等优势在污水处理中有着广泛应用[1].但膜污染成为限制其长久运行的主要问题，其中膜表面生物膜形成导致的生物污染占据重要原因[2].目前膜污染防治的方法主要有: ①膜表面改性等物理法[3]；②利用强酸、强碱、氧化剂进行清洗等化学法[4, 5]；③酶干扰及群体感应抑制法等生物法[6].物理法和化学法换膜成本高、风险大，且易造成抗性菌株的产生及新的环境与健康危害[7].生物法的出现为从根本上防止及控制生物淤积提供了一条可能的途径，由于其环境友好，安全性高及可持续性等优势在近年来迅速崛起，成为近期膜污染研究的热点[8].
群体感应淬灭法是指通过抑制细菌之间的信号交流(群体感应，quorum sensing，QS)来控制细菌生物膜形成的方法[9].在群体感应调控的生物膜形成过程中，AHL类自诱导物(N-酰基高丝氨酸环内酯，N-acyl homoserine lactone，AHLs)是一种非常重要的信号分子.近年来，基于群体感应淬灭理论(quorum quenching，QQ)控制膜污染的生物法受到广泛关注[9, 10]. Oh等[11]尝试将能分解AHLs的重组大肠杆菌封装入中空纤维膜的微孔中，有效控制了生物淤积. Kim等[12]从MBR活性污泥及膜表面泥饼层中分离出红球属菌(Rhodococcus sp. BH4)，通过制成细胞包埋珠有效验证了其群体感应淬灭效应.
然而，目前应用于膜污染防治的群体感应淬灭菌只有为数几株且分解信号分子AHLs的种类有限，在不同污水环境中，对膜污染的防治效果仍处于探索阶段[13~15].更多用于膜污染防治的群体感应淬灭菌仍待进一步分离[16].本研究从实际污水处理厂活性污泥中分离纯化出1株群体淬灭功能菌株蜡样芽孢杆菌HG10，该种菌在土壤、生活污水和垃圾渗滤液等环境中均有发现且已被证实具有群体感应淬灭功能[17~19].但目前关于该菌在防止膜污染方面的研究尚未见报道；基于此，本实验通过对菌株HG10进行包埋固定，验证其群体感应淬灭功能在控制生物膜形成方面的可行性及效果，以期为该种菌在膜污染防治中应用提供数据参考和理论依据.
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 样品来源用于菌株分离的活性污泥样取自深圳某污水处理厂.
1.1.2 LB培养基蛋白胨10 g、酵母膏粉5 g、氯化钠5 g、葡萄糖1 g；蒸馏水1 000 mL，121℃灭菌15 min，保存备用.固体培养基加琼脂1.5%. 1/2 LB培养基的各成分含量为上述0.5倍.
1.1.3 试剂及菌株N-乙酰高丝氨酸环内酯(C6-HSL)和N-癸酰高丝氨酸环内酯(C10-HSL)均购于Cayman Chemical (USA)；PCR反应所用Premix Taq混合酶购于TaKaRa (Japan)；包埋菌株所用载体为海藻酸钠(aladdin，AR)；实验所用微滤膜为Millipore微孔过滤膜(GVWP04700，0.22 μm，47 mm)；报告菌Chromobacterium violaceum CV026和Chromobacterium violaceum VIR07为实验室保存；人工配置污水配方如表 1[20].
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表 1 合成污水配方 Table 1 Components of synthetic wastewater |
1.2 菌株分离纯化
采用基本培养基法定向分离具有QQ功能的细菌[13]，配置C6-HSL (2.5 mmol ·L-1)为唯一碳源的基本培养基，将污泥2 μL接种于100 μL基本培养基中，恒温振荡(700 r ·min-1，30℃)培养3 d后，取1 μL接种到新的C6-HSL为唯一碳源的基本培养基中，将连续3次富集培养后的菌液涂布于LB琼脂培养基30℃恒温培养，于培养24 h、48 h时挑取不同形态单菌落进行分离纯化.对所有分离菌落进行QQ功能检测.
1.3 分离菌株QQ和QS功能检测使用报告菌CV026对分离菌株进行QQ功能检测:滴加的样品中含有C6-HSL时，含有报告株CV026的LB培养基上呈现紫色反应[21].将分离菌株于1/2 LB培养基前培养12 h后，取菌液以1 :100体积比转接到新的1/2 LB培养基中(其中含有浓度为10 μmol ·L-1的C6-HSL溶液)；在30℃，170 r ·min-1条件下培养8、10、12、24 h时，取菌液500 μL并离心(13 500 r ·min-1, 5 min)，上清液经0.22 μm滤膜过滤后-20℃冻存；将无菌滤纸片放置于含有CV026的LB平板上，在滤纸片上滴加冻存滤液20 μL后，将LB平板恒温30℃培养24 h，观察滤纸周围显色反应.
分离细菌的QS功能检测，使用CV026和VIR07为报告菌，分别对短链类AHLs (C4-C8)和长链类AHLs (C10-C16)进行验证[21].将分离纯化的QQ菌株菌落与报告菌CV026和VIR07以“T”型划线的方式接种于同一LB平板，恒温(30℃)培养24 h后观察报告菌显色反应. 10 μL的C6-HSL和C10-HSL (10 μmol ·L-1)分别被划线在指示菌平板上，作为对照.
1.4 QQ菌株16S rRNA基因序列测定使用通用引物27F (5′-AGAGTTTGATCCTGG CTCAG-3′)和1492R (5′-GGCTACCTTGTTACGAC TT-3′)进行目的基因片段扩增.扩增条件: 94℃预变性3 min，94℃变性1 min，54℃退火30 s，72℃延伸1.5 min，35次循环，最后72℃延伸10 min.将PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳后由华大公司进行基因测序，测定序列通过GenBank数据库比对鉴定.
1.5 菌株固定化及QQ功能验证菌株HG10与质量-体积浓度为4%的海藻酸钠溶液(SA)按100 mg ·mL-1比例混匀后，滴加到质量-体积浓度为3%的CaCl2溶液中，4℃交联后低温保存.制备无细菌包埋的空海藻酸钠珠(Vacant-beads)为对照组，以探究包埋珠对群体感应信号分子的物理吸附作用.
配置C6-HSL浓度为10 μmol ·L-1的LB培养基20 mL，设置3组实验:加入8颗海藻酸钠细菌包埋珠(SA-HG10)的培养基，加入8颗无细菌包埋的空海藻酸钠珠的培养基(Vacant-beads)，不加任何包埋珠的培养基作为空白对照(Control). 3组实验在70 r ·min-1，30℃条件下振荡培养，分别于15、17、19、21、24、26、34、54 h进行取样，并依据1.2节群体淬灭检测所述方法，测量紫色圆直径，根据公式(1)计算投加不同包埋珠的C6-HSL浓度随时间的变化情况[20, 22].
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(1) |
式中，c为C6-HSL浓度(μmol ·L-1)；x为显紫色圆直径(mm).
1.6 生物膜生长鉴定将PVDF材质微滤膜片放入锥形瓶中，依次加入49 mL合成污水，1 mL实验室驯化良好的活性污泥(MLSS=10 g ·L-1)，1.4节实验结果证明无细菌包埋的海藻酸钠珠对C6-HSL的降解能力与空白对照组无显著差异可忽略不计(2.2节)，故本节设置两组实验:不加包埋珠的锥形瓶作为对照组(A)，投加15颗SA-HG10的锥形瓶作为实验组(B).在70 r ·min-1恒温(30℃)条件下培养，每24 h进行人工配置污水更换，以提供反应系中微生物生长所需营养成分.经过一个生物膜生长周期8 d后，取出微滤膜片，进行膜通量和生物膜EPS测量.
膜通量测定采用超滤杯(UFSC05001，Amicon，USA)自行搭建(图 1)，氮气提供稳定正压15 kPa±1 kPa，膜片置于超滤杯膜固定装置内，采用超纯水(MilliQ water)作为过滤用水，过滤体积为50 mL，使用量筒和秒表分别记录过滤水量和所需时间.
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图 1 膜通量测定装置示意 Fig. 1 Schematic of membrane flux test apparatus |
膜表面生物膜中EPS的提取，采用热提取法[23]:将反应后膜片剪碎于15 mL 0.9% NaCl溶液中，超声10 min，150 r ·min-1摇匀10 min，超声5 min，80℃水浴30 min，取出碎膜片后，12 000 r ·min-1离心20 min，取上清液测定EPS含量，EPS总量用多糖与蛋白质之和表征.多糖和蛋白质分别采用苯酚-硫酸法和考马斯亮蓝法进行测定[24].
2 结果与讨论 2.1 QQ功能菌株分离及鉴定结果本研究共分离18株优势菌，对分离菌株全部进行群体感应淬灭功能验证，得到5株具有群体淬灭功能的细菌. 图 2为培养24 h时5株细菌的QQ功能检验，菌株HG10、A51、B1和B72培养24 h时，其上清液在滤纸周围无显紫色反应，表明菌株在24 h内可将C6-HSL完全分解；而菌株C48在培养24 h后，其上清液在滤纸片周围出现部分紫色，表明C48在培养24 h时能分解部分C6-HSL，群体淬灭功能较弱. 5种分离菌的16S rRNA基因鉴定结果如表 2所示.
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培养时间: 24 h, C6-HSL溶液(10 μmol ·L-1)和超纯水分别为阳性对照和阴性对照 图 2 分离5种细菌的群体淬灭功能验证 Fig. 2 Bio agar assay for quorum quenching of each strain |
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表 2 已分离群体感应淬灭菌株 Table 2 Lists of isolated quorum quenching bacterial strains |
在天然环境中存在同时具有QS和QQ功能的细菌[25]，对分离菌株的QS功能进行检测.结果如图 3，同属于Burkholderia sp.属的B72和C48自身可产生信号分子AHLs，其中菌株B72自身可生产短链类信号分子，C48可同时生产短链类和长链类信号分子.排除这两株可自身生成AHLs的细菌，并结合之前QQ功能的检验，从余下3种菌株HG10、B1和B51中选取分解C6-HSL能力最强的HG10作为微生物固定包埋的实验菌种.
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C6-HSL和C10-HSL作为标准样品 图 3 分离细菌的群体感应功能检测 Fig. 3 Bio agar assay for quorum sensing of each strain |
微生物在固定化包埋过程中，海藻酸钠溶液浓度、交联时间及交联剂浓度等包埋条件均会影响固定化微生物性能，导致包埋菌活性降低[27]. 图 4为投放SA-HG10和空海藻酸钠珠(Vacant-beads)的LB培养基中，C6-HSL浓度随时间的变化曲线.含有菌株HG10的海藻酸钠包埋珠在培养17、19和21 h时，对溶液中C6-HSL的降解率分别为85%、96%和99%，表现出极强的群体感应淬灭功能；投放空海藻酸钠珠(Vacant-beads)的一组C6-HSL减少量仅为20%~26%，这可能是由于空海藻酸钠珠的物理吸附作用造成[12]. Khan等[14]在对甲基状芽孢杆菌研究中得出类似结果:在培养时间为16~23 h内，甲基状芽孢杆菌对信号分子C12-HSL的降解率可达到90%~96%.本研究中，用海藻酸钠固定的菌株HG10在24 h对信号分子C6-HSL降解率达到99%以上，具有极强的群体淬灭功能.
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图 4 细菌包埋珠(SA-HG10)、无细菌空海藻酸钠珠(Vacant-beads)对C6-HSL降解能力检测 Fig. 4 Comparison of QQ activity of beads with strain HG10, vacant beads and control |
于锥形瓶中取出培养8 d后的过滤膜片，微滤膜片表观外貌如图 5所示.未投加包埋珠的对照组A膜表面观察到明显的鞭毛状絮体[15]，已形成成熟生物膜.实验组B滤膜表面微生物絮体附着量较少，表明投加SA-HG10细菌包埋珠对滤膜表面微生物的附着生长产生了抑制作用，进而控制膜污染的加剧.
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A组和B组分别为未投加包埋珠和投加细菌包埋珠SA-HG10的测试滤膜，下同 图 5 不同实验条件下过滤膜片对比 Fig. 5 Comparison of membrane filters under different test conditions |
图 6为不同反应体系中微滤膜过滤液体积随时间的变化曲线，相比于新膜片过滤50 mL超纯水需要90 s时间，实验组B需要653 s，未投加任何包埋珠的对照组A则需更长时间(1 070 s)，膜过滤渗透性能开始下降，已出现明显膜污染.通过公式(2)计算不同反应体系内过滤膜通量.
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(2) |
式中，LMH为膜通量[L ·(m2 ·h)-1]，V50为过滤液体积(50 mL)，A为膜有效过滤面积(13.4 cm2)，t为过滤时间(s).
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图 6 不同反应体系膜过滤性能比较 Fig. 6 Comparison of membrane flux of different fouled membranes |
得出B组膜通量为181.29 L ·(m2 ·h)-1，比对照组A的110.64 L ·(m2 ·h)-1高出63.9%，表明通过群体感应淬灭机制有效提高了膜通量. Monzon等[28]提出，环境中微生物细菌高密度聚集并通过群体感应机制形成生物膜.本研究中，群体感应淬灭菌株HG10通过抑制上述过程的发生，使膜表面微生物的附着减少，膜污染程度显著减缓.
2.3.3 EPS含量变化大量研究表明，生物膜中胞外聚合物(EPS)是引起膜污染的主要污染物[23, 29].微生物分泌而形成的胞外聚合物中，多糖和蛋白质的含量可以占到其主要成分的60%~70%[30]，对过滤膜表面生物膜中EPS进行提取，并测定其多糖和蛋白质含量，结果如图 7所示.对照组(A)膜表面多糖和蛋白质含量分别为11.43 μg ·cm-2和37.07 μg ·cm-2，而含有蜡样芽孢杆菌包埋珠的实验组(B)滤膜片上生物膜中多糖和蛋白质含量分别为8.09 μg ·cm-2和19.32 μg ·cm-2，较对照组A分别减少了29%和48%.蛋白质含量的大量减少很可能是造成生物膜形成减少的主要原因:蛋白质属疏水性物质，Le-Clech等[31]研究发现较多的疏水性物质将会加强微生物絮体在膜表面的附着，同时提出相对于多糖，蛋白质更易导致微生物絮体的疏水性. B组疏水性蛋白质含量较多糖减少更多，导致膜表面疏水性物质的大量减少，进而导致生物膜附着量的减少；B组胞外聚合物EPS较对照组A组减少了43%；Jiang等[32]将海藻酸钠包埋群体淬灭酶运用在膜生物反应器中，也发现膜组件表面EPS较对照组相比减少了大约50%，表明在本实验中，群体感应淬灭技术对膜污染的减缓很可能是由于减少了生物膜中EPS含量而造成.
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图 7 无细菌包埋珠的对照组(A组)和含有细菌包埋珠的实验组(B组)过滤膜表面多糖和蛋白质含量 Fig. 7 PS and PN concentrations on the surface of membrane filter in control group (A) and experiment group (B) |
(1)从实际运行的污水处理厂活性污泥中分离出1株新型群体感应淬灭菌HG10，初步鉴定为蜡样芽孢杆菌Bacillus cereus.
(2) HG10制成的包埋珠(SA-HG10)对群体感应信号分子C6-HSL具有99%的降解能力；其投加到模拟废水过滤系统中，提高了63.9%的膜通量，改善了膜过滤性能，为该菌在实际工程应用中节省能耗和成本提供了理论基础.
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