2016, Vol. 37
2. 北京市农林科学院生物技术研究中心, 农业基因资源与生物技术北京市重点实验室, 北京 100097;
3. 中国农业大学生物学院, 北京 100094
2. Beijing Key Laboratory of Agricultural Genetic Resources and Biotechnology, Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China;
3. College of Biological Sciences, China Agricultural University, Beijing 100094, China
随着集约化畜禽养殖场数量不断增加、养殖规模不断扩大，养殖场作为一个重要的环境污染源逐渐引起人们关注.畜禽在养殖过程中，动物自身、其粪便以及垫料携带的微生物易于逸散至空气中形成生物气溶胶[1].这些空气微生物包含大量致病微生物，不仅直接影响动物和从业人员的健康[2]，而且可通过空气流动进行长距离传播，污染周围环境[3~5].
值得注意的是，近年来作为促生长和预防疾病的抗生素在现代集约化畜禽养殖过程中大量使用.抗生素在动物体内不能被完全吸收，据报道约有60%~90%的药物随动物粪便排出体外[6].抗生素的不规范使用导致动物体内和环境中抗生素耐药菌的产生，可能直接威胁人类健康[7~9].
目前，国内外学者已经对养殖场空气中的抗生素耐药菌展开研究[1, 10, 11]，但缺乏对不同养殖动物间耐药菌污染现状的对比，特别是对抗生素耐药菌的粒径分布及动力学粒径特点的研究仍属空白.为此，本研究对北京市上风向3个区县的22家养殖场空气中细菌和抗性菌的浓度及粒径进行调查，以期为评价畜禽养殖场对城市空气污染和人类健康的影响提供依据.
1 材料与方法 1.1 养殖场的选择选取北京密云、平谷和怀柔这3个地区的22个养殖场进行研究，具体坐标位置如图 1所示.其中，对猪(采样4次)和牛(采样4次)舍内细菌气溶胶进行采样，对蛋鸡(采样6次)和肉鸡(采样8次)的舍内外细菌气溶胶同时进行采样，采样日期在2015年8~10月之间.相应的采样信息见表 1，其中E、M、P、C分别代表蛋鸡场、肉鸡场、猪场和牛场.
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右下角是养殖场所在地点对应卫星图 图 1 22个养殖场采样地点示意 Fig. 1 Sampling sites of the 22 animal feeding operations |
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表 1 畜禽养殖场舍内外生物气溶胶采样信息1) Table 1 Sampling information from indoor and outdoor of animal feeding operations |
1.2 采样方法
生物气溶胶的采集使用FA-Ⅰ撞击式采样器(辽阳，中国).该仪器将空气中的带菌粒子按粒径大小分别捕获在各级培养皿上: Stage Ⅵ: 0.65~1.1 μm，Stage Ⅴ: 1.1~2.1 μm，Stage Ⅳ: 2.1~3.3 μm，Stage Ⅲ: 3.3~4.7 μm，Stage Ⅱ: 4.7~7.0 μm和Stage Ⅰ: >7.0 μm.采样高度1.5 m，经条件优化，细菌与抗生素耐药菌样品采集时间分别为1 min和2 min，气体流量28.3 L·min-1，每次采样前用流量计(余姚，中国)对采样泵的流量进行校正，每个采样点对细菌和抗生素耐药菌分别重复取样3次.空气温度和相对湿度用温湿度计(WD-35612，OAKTON，Germany)检测.
1.2.1 细菌气溶胶的培养本研究采用9 cm培养皿，灭菌后在无菌条件下加入约20 mL培养基.细菌采用LB营养琼脂培养基，28℃培养箱内培养2 d；采集样品在进行菌落计数时，采用Positive hole method方法对菌落数进行相应校正.
1.2.2 耐药菌气溶胶的培养将四环素和红霉素分别配成初始浓度为16 mg·mL-1和48 mg·mL-1的母液，使用时分别取适量上述抗生素母液，过滤除菌后，加入到已灭菌的LB营养琼脂培养基中，使其最终浓度分别为四环素16mg·L-1和红霉素48mg·L-1，制备成单种抗生素耐药平板.
1.3 计算方法 1.3.1 生物气溶胶的总浓度根据采样时间和气体流量，利用公式(1)计算各级生物气溶胶总浓度.
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(1) |
式中，c为细菌或耐药菌气溶胶浓度，CFU·m-3；N为各级菌落数，CFU；t为采样时间，min；F为采样时的气体流量，L·min-1.
1.3.2 耐药菌气溶胶占总细菌气溶胶的丰度
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(2) |
式中，η为耐药菌的丰度；c为耐药菌或细菌气溶胶浓度，CFU·m-3.
1.3.3 空气环境中细菌和抗性菌的动力学粒径计算动力学粒径几何平均值(dg)和几何标准偏差(σg)计算方法如下[12]:
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(3) |
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(4) |
式中，ci指在第i个粒径区间测量的细菌或耐药菌气溶胶的平均浓度，CFU·m-3；di指在第i个粒径区间的中值径，μm；S指所有粒径平均浓度的总和，CFU·m-3.
1.4 数据统计分析采用SPSS 21.0来对数据进行差异显著性和相关性分析.当P值小于0.05时，表明在95%的置信区间内具有统计学意义上的显著差异；当P值小于0.01时，表明在99%的置信区间内具有统计学意义上的显著差异.
2 结果与分析 2.1 畜禽养殖场舍内外生物气溶胶浓度 2.1.1 畜禽养殖场舍内外细菌气溶胶浓度首先，对北京3个郊区县畜禽养殖场，包括蛋鸡、肉鸡、猪和牛舍内外空气环境中细菌和抗生素耐药菌气溶胶样本进行培养和计数，结果如图 2所示.
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CBT、PBT、EBT、MBT、EOBT和MOBT分别代表牛舍内、猪舍内、蛋鸡舍内、肉鸡舍内、蛋鸡舍外和肉鸡舍外 图 2 养殖场舍内外空气中细菌气溶胶浓度 Fig. 2 Concentration of airborne bacteria from indoor and outdoor of animal feeding operations |
对4种动物舍内空气中细菌污染调查结果显示，最高浓度和最低浓度的空气细菌在猪舍和牛舍内检测到，浓度分别为4.87×104 CFU·m-3和0.85×104 CFU·m-3.蛋鸡舍内细菌的平均浓度略低于肉鸡，两种鸡舍外细菌气溶胶浓度较相应舍内浓度低一个数量级(P < 0.05).值得注意的是，所调查4家猪场舍内空气中细菌浓度范围为2.03×104~8.06×104 CFU·m-3，均高于我国《畜禽场环境质量标准》(NY/T 388-1999)中关于猪舍区生态环境质量的空气细菌限定值(1.7×104 CFU·m-3)，与李基棕等[13]对贵州地区猪舍内细菌气溶胶调查的浓度范围相似，略低于山东省夏秋两季猪舍内浓度[14].牛舍内空气中细菌气溶胶的最大浓度为1.96×104 CFU·m-3，低于先前对牛舍内需氧菌的研究结果[15].本研究对蛋鸡和肉鸡舍内细菌的平均浓度的研究结果与国外研究相一致[2].
目前，国内外对不同种类动物养殖过程中逸散生物气溶胶的比较研究少有报道[1, 17].动物舍内生物气溶胶的浓度受到多种因素的影响，如动物类型和数量、养殖方式、粪便处理方式和养殖模式等[3, 18, 19].本研究分析了细菌气溶胶的浓度与日龄、面积、数量、密度、颗粒物浓度以及温度和湿度(表 1)相关性.结果显示，4种养殖动物舍内细菌气溶胶的浓度整体上与颗粒物浓度PM10(P < 0.01)和TSP (P < 0.01)显著正相关.造成牛场内细菌气溶胶浓度较低的原因可能主要有两方面:一方面，牛场内牛的养殖密度较低；另一方面，与猪和鸡舍采用的封闭式饲养不同，牛舍采用开放式养殖方式.牛舍生物气溶胶的浓度受环境影响较大[20].牛舍内产生的生物气溶胶可以通过气体传播到周边环境，导致舍内浓度较低.
2.1.2 畜禽养殖场舍内外四环素耐药菌气溶胶浓度及丰度在本研究所调查的4种养殖动物舍内，以及蛋鸡和肉鸡舍外空气中均检测出四环素耐药菌(图 3).
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CBT、PBT、EBT、MBT、EOBT和MOBT分别代表牛舍内、猪舍内、蛋鸡舍内、肉鸡舍内、蛋鸡舍外和肉鸡舍外 图 3 养殖场舍内外四环素耐药菌气溶胶的浓度及其占总细菌浓度的丰度 Fig. 3 Concentration of airborne tetracycline resistant bacteria from indoor and outdoor of animal feeding operations and its abundance in total bacterial concentration |
整体上，猪舍和肉鸡舍内四环素耐药菌的浓度(6.98×103 CFU·m-3和6.21×103 CFU·m-3)高于牛舍和蛋鸡舍内(P < 0.01).目前，为了促进动物生长和预防疾病，抗生素在养殖业使用越发频繁，其中猪场和肉鸡场使用尤为严重[6].虽然国内外已严禁在产蛋鸡及奶牛饲料[21]中使用抗生素，但是根据以往报道[6]以及本研究组调查中发现有许多养殖户仍在继续违规使用.该现象导致了4种动物舍内空气中均有四环素耐药菌检出，而猪舍和肉鸡舍内浓度和比率均较高.其中，肉鸡舍内空气中四环素耐药菌占总细菌气溶胶的平均值高达38.69%，远远高于蛋鸡舍内空气中四环素耐药菌的平均值(11%)，这与鸡舍四环素类抗性基因检测结果相符[22].影响因素分析结果显示，4种养殖动物舍内四环素耐药菌的浓度与细菌浓度(P < 0.01)、PM10(P < 0.01)和TSP (P < 0.01)呈显著正相关，而与舍内温度(P < 0.05)和日龄(P < 0.05)负相关.四环素耐药菌浓度与日龄负相关可能与四环素在不同日龄动物的使用量有关，据报道幼年鸡和猪粪中抗生素耐药菌和多重抗性细菌要高于成年，且养猪场在养猪过程中，抗生素的使用一般在幼猪期，成年猪则很少使用[6].虽然蛋鸡和肉鸡舍外四环素耐药菌浓度较低，但其所占总细菌丰度分别达8.81%和15.89%.这说明养殖场舍内生物气溶胶，包括耐药细菌已经能够传播到舍外，对周边空气环境造成影响.
2.1.3 畜禽养殖场舍内外红霉素耐药菌气溶胶浓度及丰度红霉素耐药菌的浓度和丰度在4种动物中的整体变化趋势与总细菌和四环素耐药菌气溶胶浓度一致，但其浓度以及所占丰度均高于四环素耐药菌.
由图 4可知猪舍内红霉素耐药菌气溶胶的平均浓度最高，为1.50×104 CFU·m-3，其次是肉鸡、蛋鸡和牛.已有研究发现，鸡舍内金黄色葡萄球菌对红霉素耐药率达75.2%[23]. Heuer等[9]认为，如果一个细菌种群对一种抗生素产生耐药，就会在抗生素的选择压力下占优势，从而产生多重抗生素耐药.以往研究在鸡粪和猪粪中检测到了多重耐药菌[6].本研究发现空气中红霉素耐药菌和四环素耐药菌具有显著正相关性(P < 0.05)，对比分析图 3和图 4，推测具有红霉素耐药的细菌气溶胶，很可能同时也具有四环素耐药性.本研究结果显示，肉鸡舍内的红霉素耐药菌浓度和丰度均高于蛋鸡，蛋鸡和肉鸡舍外红霉耐药菌平均浓度和丰度分别为1.9×103 CFU·m-3、4.2×103 CFU·m-3和23.19%、36.53%，且舍内外趋势相同.进一步说明养殖场是舍外生物气溶胶污染的来源.
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CBT、PBT、EBT、MBT、EOBT和MOBT分别代表牛舍内、猪舍内、蛋鸡舍内、肉鸡舍内、蛋鸡舍外和肉鸡舍外 图 4 养殖场舍内外红霉素耐药菌气溶胶的浓度及其占总细菌浓度的丰度 Fig. 4 Concentration of airborne erythromycin resistant bacteria from indoor and outdoor of animal feeding operations and its abundance in total bacterial concentration |
动力学粒径是生物气溶胶的重要属性之一[24]，不同粒径的颗粒物可以沉降在人体呼吸道的不同位置.本研究对FA-I撞击式采样器6个粒径所收集的细菌，四环素和红霉素耐药菌的浓度和分布特点进行分析，并计算动力学粒径的几何平均值(表 2)，对细菌、四环素和红霉素耐药菌气溶胶的可能造成的危害进行初步评估.
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表 2 畜禽养殖场生物气溶胶空气动力学粒径1) Table 2 Aerodynamic diameter from indoor and outdoor of animal feeding operations |
2.2.1 畜禽养殖场舍内外细菌气溶胶粒径分布特点
由图 5可知，整体上，细菌气溶胶主要分布在中间粒径范围内，而在大粒径和小粒径范围内浓度较低.除了蛋鸡舍内之外，其他5个采样点的最高浓度值均在Stage Ⅲ检测到.这与城市环境[25]以及污水处理厂中细菌气溶胶的粒径分布特点相似，最高浓度出现在Stage Ⅳ~Ⅲ范围内[26]. 4种养殖动物舍内细菌气溶胶在6个粒径范围的分布特点存在差异.根据公式(3)可知，生物气溶胶在单位粒径上的浓度以及总浓度决定了其整体的动力学粒径几何平均值.例如，猪舍中细菌气溶胶在Stage Ⅵ~Ⅰ内单位粒径的浓度分别为2.21×104、1.58×104、3.39×104、4.79×104、3.58×104和2.90×104 CFU·m-3.其动力学粒径几何平均值(4.39 μm)高于其他养殖环境，这主要是由于在大粒径范围内细菌气溶胶的单位粒径浓度较高，而在小粒径范围内细菌气溶胶的单位粒径浓度较低造成的.
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C、P、E、M、EO和MO分别代表牛舍内、猪舍内、蛋鸡舍内、肉鸡舍内、蛋鸡舍外和肉鸡舍外 图 5 养殖场舍内外细菌气溶胶粒径分布特点 Fig. 5 Size distribution of airborne bacteria from indoor and outdoor of animal feeding operations |
整体上，四环素耐药菌气溶胶与细菌气溶胶粒径的分布特点有所差异(图 6).蛋鸡和肉鸡的最高浓度在Stage Ⅲ(3.3~4.7 μm)检测到.而猪舍和牛舍内最高浓度分别在Stage Ⅰ(>7 μm)和Stage Ⅳ(2.1~3.3 μm)，为4.49×103 CFU·m-3和2.37×102 CFU·m-3.蛋鸡和肉鸡舍外的最高浓度均分布在Stage Ⅱ(4.7~7 μm)范围内.舍内四环素耐药菌最大动力学粒径几何平均值在猪舍内检测到，为6.10 μm.造成这一现象的主要原因可能是猪舍的最高浓度分布在Stage Ⅰ(>7 μm).同样，蛋鸡和肉鸡舍外四环素耐药菌气溶胶在大粒径范围内浓度较高，导致蛋鸡和肉鸡舍外动力学粒径几何平均值较高，分别为5.68 μm和9.58 μm.
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图 6 养殖场舍内外四环素耐药细菌气溶胶粒径分布特点 Fig. 6 Size distribution of airborne tetracycline resistant bacteria from indoor and outdoor of animal feeding operations |
由图 7可知，虽然每种养殖动物细菌、红霉素和四环素耐药菌的粒径分布存在差异，但整体上所考察各养殖场舍内红霉素耐药菌气溶胶主要分布在中间粒径范围内，在大粒径和小粒径粒子范围内分布较少.最高单位粒径浓度在Stage Ⅲ检测到，蛋鸡、肉鸡、猪和牛舍内分别为4.91×103、1.01×104、1.55×104和0.66×103 CFU·m-3. Stage V范围内浓度最低，蛋鸡、肉鸡在Stage V浓度较为接近，分别为0.250×103 CFU·m-3和0.252×103 CFU·m-3.
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图 7 养殖场舍内外红霉素耐药细菌气溶胶粒径分布特点 Fig. 7 Size distribution of airborne erythromycin resistant bacteria from indoor and outdoor of animal feeding operations |
综合分析发现，不同养殖场空气环境中同种生物气溶胶的粒径分布规律有所不同，同一养殖场不同种类生物气溶胶也存在差异.畜禽养殖过程中，生物气溶胶的粒径分布受多种因素影响，如气溶胶化的方式[27]和粒子的吸湿性[28]等.除此之外，动物的活动、通风、垫料以及地板类型也会影响粒径分布[29].本研究考察了空气动力学粒径同表 1中各个参数之间的相关性，只检测到细菌生物气溶胶的动力学粒径同PM2.5显著正相关(P < 0.05).因畜禽舍内生物粒子粒径分布影响因素复杂，很难独立分析.本研究结果显示了北京地区4种动物养殖场空气环境中细菌、四环素耐药菌和红霉素耐药菌的粒径分布特点，为后续深入研究其影响因素以及危害评估提供参考.
2.2.4 生物气溶胶动力学粒径动力学粒径几何平均值通常用来判定某一生物气溶胶粒子在人体呼吸道的整体沉降位置.如，粒径dg < 10 μm可进入鼻腔；粒径dg < 7 μm可进入咽喉；粒径在3.3~4.7 μm可进入支气管；粒径在2.1~3.3 μm可进入二支气管；粒径在1.1~2.1 μm可进入末端支气管；粒径在0.65~1.1 μm可直接沉降至肺泡，从而进入血液循环.本研究调查的各养殖场舍内细菌气溶胶的空气动力学粒径dg几何平均值在3.4~4.4 μm之间(表 2)，表明这些细菌绝大部分可直接进入支气管.而四环素和红霉素耐药菌空气动力学粒径dg在不同养殖动物中的波动较大，分别是3.2~6.1 μm和3.6~7.1 μm.整体上，鸡舍外3种生物气溶胶粒子的空气动力学粒径dg高于舍内(除肉鸡场细菌气溶胶)，这说明所考察的3种生物气溶胶在传播至舍外后，空气动力学粒径的增大导致其在人体呼吸道的沉降位置上移.国外研究人员在养猪场工人的鼻腔检测到了四环素耐药基因[30]，这说明不同动力学粒径可导致耐药基因或者耐药菌沉降在呼吸道的主要位置产生差异.
3 结论本研究在2015年夏秋两季对北京周边养殖场生物气溶胶的调查.结果显示，畜禽养殖场细菌、抗生素耐药菌气溶胶的浓度分别为104 CFU·m-3和103 CFU·m-3左右.猪舍和肉鸡舍内耐药菌气溶胶浓度和丰度较高.鸡舍外部检测到四环素和红霉素耐药菌.不同养殖场空气中气溶胶的粒径分布以及动力学粒径几何平均值存在差异，导致其在人体呼吸道的沉降主体位置不同.本研究结果将为评估畜禽养殖场空气环境质量，评价生物气溶胶对人类的危害提供基础数据.
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