2016, Vol. 37
2. 北京市农林科学院生物技术研究中心, 北京 100097;
3. 北京市大兴区土肥工作站, 北京 102600;
4. 北京市大兴区农业技术推广站, 北京 102600
, WANG Jia-jia1,2 , HA Xue-jiao3 , QIU Meng-chao4 , GAO Min2 , QIU Tian-lei2 , WANG Xu-ming2
2. Beijing Agro-Biotechnology Research Center, Beijing Academy of Agriculture and Forestry Sciences, Beijing 100097, China;
3. Soil and Fertilizer Workstation in Daxing, Beijing 102600, China;
4. Agrotechnical Promotion Station in Daxing, Beijing 102600, China
抗生素是人类医学史上的巨大发现，除临床使用外，在预防和治疗动物传染性疾病、 促进动物生长及提高饲料转化率等方面也具有重要作用. 1950年美国食品与药品管理局(FDA)首次批准抗生素可作为饲料添加剂，抗生素因此被全面推广应用于动物养殖业[1]. 但是，养殖业和医疗行业的长期大量不规范使用抗生素，给生态环境和人类健康构成了潜在威胁[2].
有研究发现，抗生素被机体摄入后，大约有30%~90%以原药和代谢产物的形式通过粪尿排出体外[3]，最终进入生态环境并对其产生危害[4]. 抗生素在养殖业的长期滥用会诱导动物体内产生抗生素抗性基因(antibiotic resistance genes,ARGs)[5]. ARGs通常位于质粒、 转座子、 整合子等可移动遗传元件上，通过基因水平转移在菌群间迁移，引起抗生素耐药菌的产生和扩散，严重威胁人类健康.
2006年，Pruden等[6]首次将ARGs作为一种新型的环境污染物提出，有关ARGs在环境中传播和污染等的报道日益增多[7]. 近年来的研究表明，粪肥施用可导致农田土壤的ARGs种类和丰度增加[8~10]，使农田土壤成为一个巨大的ARGs储存库和传播媒介[11].
北京作为有着2 000多万常住人口的大都市，蔬菜生产对于满足首都菜篮子供应和应急保障具有重要作用. 北京地区的蔬菜生产普遍采用粪肥作为底肥，由此引起的ARGs污染问题还未见研究报道. 为了解北京地区农田土壤ARGs的污染状况和分布特征，本研究选择长期施用粪肥的蔬菜基地，对土壤ARGs进行检测分析，通过掌握北京地区农田土壤ARGs的污染状况，以期为从ARGs角度评估粪肥应用的安全性提供基础数据.
1 材料与方法 1.1 采样地点和时间选取北京地区11个蔬菜生产基地作为采样点，各采样点均连续施用粪肥(大多采用以鸡粪为主的畜禽粪便经堆积发酵后使用)5年以上，分别位于北京市的延庆、 海淀、 昌平、 顺义、 平谷、 房山、 大兴、 通州、 怀柔和密云(图 1). 以上采样点的温室每年至少种植2茬蔬菜，每年粪肥施用量为6×106~1.2×107 kg·km-2； 大田每年种植1~2茬蔬菜，粪肥用量一般不超过3×106 kg·km-2. 采样时间为2015年4~5月. 采用5点混合采样法，每个采样点采集大田和温室表层土壤(0~15 cm)各3份重复样品，放入装有冰盒的采样箱运回实验室，过筛后于-80℃保存，用于抗生素测定和DNA提取.
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图 1 采样点分布示意 Fig. 1 Schematic diagram for location of sampling sites |
土壤样品总DNA采用MO BIO Laboratories，Inc生产的The PowerSoil® DNA Isolation Kit(12888-50)进行提取. DNA提取完毕后，用微量核酸蛋白质分析仪(Nanodrop)检测含量以及纯度(A260/A280在1.8～2.0之间，表明用试剂盒提取的DNA纯度较高).
1.2.2 ARGs的PCR定性检测本研究对3种β-内酰胺类ARGs(blaCARB-4、 blaSPM-1、 blaTEM*)，1种喹诺酮类ARGs(qnrS)，3种磺胺类ARGs(sul1、 sul2、 dfrA1)，9种四环素类ARGs(tetA、 tetA/P、 tetC、 tetE、 tetL、 tetW、 tetG、 tetX、 tetY)，1种红霉素类ARGs(ermB)和Ⅰ类整合子(intI1)进行检测. 以上ARGs以及intI1的引物及退火温度见表 1.
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表 1 ARGs以及intI1检测的PCR引物 Table 1 PCR primers for detection of ARGs and intI1 |
PCR反应体系25 μL: 2×TransStartTM FastPfu PCR SuperMix 12.5 μL； Primer F和Primer R(10 μmol·L-1) 1 μL； ddH2O 8.5 μL； Variable template volume 1 μL.
PCR过程: 94℃预变性3 min； 94℃变性30 s，T(℃)退火30 s，72℃延伸30 s，循环30次； 72℃保持5 min； 4℃保温. 其中T代表不同的退火温度(表 1).
PCR产物检测: 用1%琼脂糖凝胶电泳检测，恒压110 V，5 μL的PCR原液，1 μL的6×Loading Buffer，Marker Trans2K plus. GelRedTM Nucleic Acid Gel Stain染料染色，Alphalmager HP凝胶成像分析系统进行拍照检测.
1.3 ARGs的定量PCR(qPCR)检测采用BIORAD CFX 96 Touch实时荧光定量PCR仪对ARGs进行定量检测.
1.3.1 qPCR反应体系及程序反应体系为20 μL，其中包含1 μL模板DNA，10 μL SYBR Premix Ex Taq(TaKaRa Biotechnology),引物各0.4 μL(与普通PCR所用引物相同)，反应在200 μL圆顶PCR管中进行. 反应程序为95℃预变性30 s，然后进入40个循环的扩增阶段，95℃变性5 s，退火30 s,72℃延伸30 s. 溶解曲线程序为55~95℃，每0.5℃读数，其间停留30 s. 每个样品重复3次，起始模板浓度由ct值确定. 数据采用Bio-Rad IQ5 FAS Release 软件进行处理.
1.3.2 标准曲线的制作质粒用试剂盒MiniBEST Plasmid Purification Kit Ver (TaKaRa)依照生产商说明的方法提取，提取的质粒用微量核酸蛋白质分析仪(Nanodrop)检测含量以及纯度，准备稀释标线备用. 以基因浓度的对数为横坐标，ct值为纵坐标绘制标准曲线，ct值与目的基因拷贝数之间的相关系数R2在0.991~0.999之间，线性相关良好，可用于计算各基因的拷贝数.
基因拷贝数计算参照文献[22]，按以下公式计算: 拷贝数=(质量/分子量)×6.02×1023. 按10倍稀释梯度稀释成标准曲线，根据标准曲线计算出在实时荧光定量PCR中样品的ARGs浓度.
1.4 抗生素的HPLC-MS/MS分析 1.4.1 试剂及标准溶液配制将0.1mol·L-1柠檬酸溶液和0.2mol·L-1磷酸二氢钠溶液(体积比为8∶5)混合，用NaOH溶液调pH至4，即为McIlvaine buffer.
配制磺胺嘧啶(SD)、 磺胺对甲氧嘧啶(SM)、 磺胺二甲氧嘧啶(SDM)、 磺胺二甲嘧啶(SM2)、 磺胺甲唑(SMX)、 氨苄西林(AMP)、 土霉素(OTC)、 金霉素(CTC)、 四环素(TC)、 强力霉素(DOX)、 诺氟沙星(NOR)、 环丙沙星(CIP)和恩诺沙星(ENR)共计13种抗生素的混合标准液，浓度分别为10、 50、 100、 250和500 μg·L-1，-20℃保存.
1.4.2 样品预处理称取冻干样品0.75 g至50 mL离心管，加入5 mL提取液(乙腈∶McIlvaine溶液=1∶1)，涡旋振荡1 min，超声振荡15 min(冰浴)； 8 000 r·min-1离心10 min(10℃)，上清转移至新50 mL离心管，后重复提取两次，合并上清； 在50℃水浴下氮吹至接近8 mL，涡旋30 s，10 000 r·min-1离心15 min. 吸取上清液至500 mL塑料瓶，并用超纯水稀释至约200 mL，加入0.4 g EDTA二钠，溶解已螯合阳离子.
对预处理后的溶液进行固相萃取. 将HLB小柱(Waters Oasis,美国)和SAX小柱(Agilent，美国)用5 mL甲醇和5 mL水活化； 用固相萃取配适器将SAX和HLB小柱串联，先在SAX柱内装入稀释后提取液，后安装50 mL注射器管体，加入稀释提取液，后开启真空泵，控制真空泵压力低于-50 kPa，用固相萃取口旋钮调节溶液以5 mL·min-1流速流下(1.5滴·s-1). 过滤完毕后，用10 mL超纯水洗柱子，抽气干燥10 min，加入洗脱液(甲醇∶丙酮=80∶20)10 mL，用15 mL离心管收集洗脱液； 在50℃水浴条件下氮吹洗脱液至快干，加入1 mL上样溶液(0.1甲酸水溶液∶甲醇=1∶1)，涡旋振荡1 min，超声15 min溶解，0.22 μm针头式膜过滤后备用.
1.4.3 仪器工作条件测定方法主要参考文献[23]，简述如下: 采用配置Thermo Hypersil GOLD (3 μL； 2.1 mm×100 mm)色谱柱的UltiMate 3000色谱仪(赛默飞世尔科技有限公司)对样品进行分析. 柱温: 35℃； 进样体积: 15 μL； 流速: 0.35 mL·min-1. 流动相A为0.1%甲酸(甲酸/超纯水，体积比)和5 mmol·L-1乙酸铵，流动相B为甲醇，流动相D为含0.1%甲酸的乙腈溶液. 采用的线性梯度如下: 0~4min，D从5%线性变为16%； 4~8 min，D由16%增加到40%； 8~15 min，D从40%增加到65%； 在15~20 min，D从65%增加到95%后保持5 min，然后回到初始状态，D为5%，保持5 min进行平衡.
质谱系统由Thermo LTQ XL检测器和离子源组成. 离子源为电喷雾电离ESI(+). 质谱条件具体如下: 加热温度350℃，鞘气流速35 arb(aribitrary unit，自定义单位)，辅助气流速10 arb，喷雾电压3.5 kV，离子传输管温度: 350℃，Tube Lens电压: 65 V. 检测方式: SRM.
1.4.4 方法学质量控制做空白、 空白加标(50、 250和500 μg·L-1的抗生素混合标准溶液)实验. 空白中未检出目标化合物. 采用3倍信噪比计算检出限(LOD)，10倍信噪比计算定量下限(LOQ). 13种抗生素的回收率为43.3%~99.8%，检出限为0.1~30.09 μg·kg-1，定量下限为0.71~56.06 μg·kg-1，线性相关系数R2为0.999 1~0.999 7，满足分析要求.
1.5 数据分析采用SPSS 23软件进行数据的差异显著性比较和 Spearman相关性分析.
2 结果与讨论 2.1 菜田土壤的抗生素污染特征表 2是11个蔬菜基地大田土壤和温室土壤13种抗生素的检测结果. 在所有检测的抗生素中，除了SM、 SDM和AMP未被检测到，其余抗生素均有不同程度的检出. 温室土壤中各种抗生素的检出率和含量普遍高于大田土壤，这可能与温室土壤粪肥施用量较大有关.
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表 2 菜田土壤中13种抗生素的残留量1) Table 2 Concentrations of 13 classes of antibiotics in vegetable soils |
大田土壤和温室土壤中磺胺类抗生素(SAs)和四环素类抗生素 (∑TCs) 的检出率均为100%，喹诺酮类抗生素(QNs)的检出率分别为69.23%和73.68%. 大田土壤和温室土壤中SAs检出含量分别为0.48~21.20 μg·kg-1(平均值8.02 μg·kg-1)和4.13~34.70 μg·kg-1(平均值13.41 μg·kg-1)，TCs检出含量分别为43.59~101.75 μg·kg-1(平均值73.65 μg·kg-1)和13.80～260.28 μg·kg-1(平均值103.58 μg·kg-1)，QNs的检出含量分别为ND(低于检出限)~7.17 μg·kg-1(平均值1.78 μg·kg-1)和ND~37.03 μg·kg-1(平均值7.35 μg·kg-1). 以上结果表明，北京地区菜田土壤中TCs的最高检出含量和平均含量都高于SAs和QNs. 尹春艳等[24]以及Ji等[25]的研究结果也表明， ∑TCs 是山东蔬菜土壤和上海养殖场附近农田污染最严重的抗生素，而且检出含量更高(平均浓度分别为274 μg·kg-1和6120 μg·kg-1). 这可能与TCs在畜牧养殖业中被广泛用作添加剂来预防动物生病和促进其生长有关，而且与其他抗生素相比， ∑TCs 在环境中较稳定[26, 27].
2.2 菜田土壤的ARGs污染特征 2.2.1 ARGs的PCR定性检测以17种ARGs和intI1为目标基因，对11个蔬菜基地的大田土壤和温室土壤进行检测，结果表明，大田土壤检出了13种ARGs和intI1，温室土壤检出14种ARGs和intI1(图 2). 温室土壤ARGs的检出率普遍高于大田土壤. 大田和温室土壤中磺胺抗性基因sul1、 sul2和四环素抗性基因tetL的检出率均达到100%； 未检出四环素抗性基因tetE、 tetY和β-内酰胺抗性基因 blaSPM-1. 此外，大田土壤未检出喹诺酮抗性基因qnrS，而温室土壤该基因的检出率为11%.
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图 2 北京地区菜田土壤17种ARGs和intI1的检出率 Fig. 2 Detectable rates for 17 ARGs and intI1 in vegetable soils in Beijing |
温室土壤和大田土壤均检测到了Ⅰ类整合子(intI1). 整合子是存在于细菌质粒、 染色体或转座子上的一种运动性DNA分子,具有捕获和整合ARGs的独特结构，使细菌产生耐药性，甚至多重耐药性. 因此，整合子被认为在ARGs传播过程中起到重要作用[28]. 目前，已发现的整合子主要有5种类型,其中intI1最为常见. 本研究的结果表明，温室土壤intI1的检出率比大田土壤高1.5倍，说明温室土壤中ARGs横向转移的可能性更大[29].
2.2.2 ARGs的丰度选择检出率较高的抗性基因sul2和tetL进行qPCR检测. 为避免分析方法和不同土壤的微生物背景值引起的偏差，将ARGs拷贝数与16S rRNA基因拷贝数做归一化处理[30]，得到ARGs的相对丰度(图 3). 由图 3可以看出，温室土壤中抗性基因sul2和tetL的丰度普遍高于大田土壤. 总体上看，菜田土壤中sul2和tetL的相对丰度介于10-4~10-2之间，与其他地区农田土壤的ARGs丰度相近[30, 31].
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图 3 抗性基因的相对丰度 Fig. 3 Relative abundance of the resistance genes |
11个采样点的温室土壤中，sul2的相对丰度均显著高于大田土壤(P<0.05)，其中差异最大的采样点C中，温室土壤的sul2相对丰度比大田土壤高16.5倍. 对于抗性基因tetL，采样点A、 B、 C、 D、 E、 J的温室土壤都显著高于大田土壤(P<0.05)，差异最大的采样点B中，温室土壤tetL相对丰度是大田土壤的3.6倍.
本研究中，温室土壤的ARGs和intI1检出率以及相对丰度普遍高于大田土壤，这可能与温室的粪肥施用量较大有关[8].
2.3 抗生素与ARGs的相关性抗生素滥用和抗生素环境污染是环境中细菌耐药性增加的重要原因之一，抗生素也是诱导环境中ARGs产生的重要因素. 表 3为菜田土壤中磺胺抗性基因sul2和四环素tetL的相对丰度与部分抗生素残留浓度的相关性. 表中数据显示sul2的相对丰度与抗生素SM2和DOX的含量显著正相关(P<0.05)，tetL相对丰度与检测的抗生素间无明显相关性(P>0.05).
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表 3 抗性基因与抗生素的相关性分析 Table 3 Correlation analysis between antibiotics and resistance genes |
关于环境中ARGs与抗生素残留之间的相关性，不同的研究者得到的结论不尽相同. Smith等[32]发现养殖场污水中四环素ARGs与抗生素之间的相关性不明显； Ji等[25]对猪场粪污及周边土壤的研究也得到了相似的结果. 而Tang 等[30]和McKinney等[33]发现农田土壤和养殖场粪污中四环素和磺胺ARGs与抗生素含量显著正相关. 以上相互矛盾的研究结果表明，抗生素浓度不是影响ARGs丰度的唯一因素，还可能受到环境中其他因素如重金属、 pH值及有机质含量等的影响[19].
3 结论(1) 北京地区菜田土壤普遍存在四环素、 磺胺和喹诺酮类抗生素污染，其中四环素类抗生素残留量最高，其次为磺胺类； 温室土壤的抗生素残留高于大田土壤.
(2) 温室和大田土壤磺胺类抗性基因sul1、 sul2和四环素类抗性基因tetL的检出率均为100%，温室土壤其他ARGs和intI1的检出率普遍高于大田土壤，sul2的相对丰度与磺胺二甲嘧啶和强力霉素的含量显著正相关，而tetL与抗生素含量无明显相关性.
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