2016, Vol. 37
2. 重庆市三峡库区农业面源污染控制工程技术研究中心, 重庆 400716
2. Chongqing Engineering Research Center for Agricultural Non-point Source Pollution Control in the Three Gorges Region, Chongqing 400716, China
汞是环境中毒性最强的重金属元素之一[1]，主要以元素汞(Hg0)、 无机汞(Hg2+)和有机汞(CH3Hg+)的形式广泛存在于自然界中[2]. 汞的所有形态都具有毒性，其中以甲基汞的为最[3]. 甲基汞具有强亲脂性和极易与蛋白结合的特性，在水生环境中，容易通过食物链的富集积累和生物放大作用，进而对人类形成健康风险,特别是对孕妇、 哺乳期妇女和儿童[4].
有研究表明，汞甲基化主要是一个微生物参与的过程[5]. 众多国内外学者相继开展了大量关于微生物汞甲基化的研究，发现许多严格厌氧菌，以及部分兼性厌氧菌和好氧菌，都具有使无机汞甲基化的能力[6~9]. 然而，目前对汞生物甲基化的研究尚不够全面和深入: 其一，主要集中于δ-变形菌纲中的硫酸盐还原菌和铁还原菌等厌氧微生物； 其二，大多数试验都是在设定较高汞浓度水平下进行的，与实际环境不符[10]. 虽然对厌氧微生物的汞甲基化作用和好氧抗汞细菌的去甲基化作用进行了广泛的研究[11]，但迄今为止，对细菌在好、 厌氧条件下汞甲基化能力和作用机制研究则鲜见报道.
三峡水库消落带是库区径流的汇集地带，成为库区水体土壤间物质交流、 能量交换及各污染物迁移转化的活跃地带[12]. 三峡库区蓄水后，形成了典型的消落带环境，汞活化效应增强，甲基汞的产生增加了鱼体汞含量超标的风险. 因此三峡库区汞污染及甲基化问题引起了全国的关注.
在本项目组前期的研究中发现[13]，三峡水库消落带土壤中好氧性可培养细菌与甲基汞(MeHg)含量存在显著正相关关系，并推测在长期处于干-湿交替条件下，土壤中可能存在某些好氧微生物参与汞的甲基化. 因而本文以三峡水库消落区土壤为研究对象，从中分离、 纯化出在不同氧分压条件下具有汞甲基化能力的细菌菌株，通过对菌株汞敏感性和汞甲基化能力分析，初步探讨其在不同氧含量条件下的汞甲基化能力，以期为三峡库区水陆交错环境中微生物的汞甲基化机制提供依据.
1 材料与方法 1.1 供试土壤根据三峡水库上游水位变化情况(http://www. ctg. com. cn/inc/sqsk. php)，选取位于三峡水库腹心地带的忠县石宝寨莲花乡新政村土壤(E108°12′3″; N30°24′36″)为研究对象(表 1)，按S形随机多点混合采样法，于2013年4月采集海拔160~165 m处消落带土壤(0~20 cm)，混匀后置于自封袋中于4℃冷藏保存.
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表 1 供试土壤基本理化性质 Table 1 Basic physical and chemical properties of the tested soil |
1.2 分离纯化
称取10.0 g土样于含1.0 mg·L-1 HgCl2的LB培养基(胰蛋白胨10.0 g·L-1，酵母浸粉5.0 g·L-1，NaCl 10.0 g·L-1，琼脂15.0 g·L-1，pH 7.0)中，30℃、 100 r·min-1摇床培养48 h后，自然沉淀，取上清液转接，如此反复3次，同时检测有无甲基汞的生成. 选取有甲基汞生成的菌液稀释涂布于LB培养基上，于30℃培养48 h. 然后从平板上挑取形态不同的单菌落反复划线纯化，获得多株供试验备选菌株，于-80℃保存.
1.3 菌种鉴定 1.3.1 形态学及生理生化鉴定将所纯化菌株经LB培养基活化后，观察其菌落形态特征； 然后再挑取菌株进行革兰氏染色后于显微镜下观察菌体形态. 并参照文献[14]，对菌株进行生理生化鉴定.
细胞形态鉴定: 菌体经0.9%生理盐水清洗2次，乙醇低浓度至高浓度脱水各一次，100%乙醇脱水2次，叔丁醇低浓度至高浓度置换各一次，100%叔丁醇置换2次，样品经脱水置换后，粘于样品托上，采用Hitachi S-3400NⅡ 型扫描电子显微镜观察菌株的细胞形态.
1.3.2 16S rDNA分子生物学鉴定菌种活化后，接种于LB液体培养基(30℃,100 r·min-1)振荡培养24 h，采用TAKARA MiniBEST Bacteria Genomic DNA Extraction Kit Ver. 3.0试剂盒提取菌体的全基因组DNA，以此为模板，选用细菌通用引物(27F: 5′-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3′，1492R: 5′-TACGGTTACCTTGTTACGACTF-3′)，进行16S rDNA扩增，PCR扩增体系(25 μL)为: 模板DNA 1 μl，2×Taq MasterMix(天根生化科技有限公司)12.5 μL； 引物27F(10 μmol·L-1)1 μL,引物1492R(10 μmol·L-1)1 μL； 加灭菌超纯水定容至25 μL. PCR反应条件: 94℃ 预变性5 min，94℃ 变性30 s，50℃ 退火30 s，72℃ 延伸2 min，35个循环，72℃ 延伸10 min，PCR产物经2%琼脂糖凝胶电泳验证为单一条带，将此PCR扩增产物送由上海英潍捷基贸易有限公司测序. 测得的16S rDNA序列通过美国生物技术信息中心(NCBI)核酸数据库中的 BLAST与GenBank中的16S rDNA序列进行同源性比对，并采用MEGA6.06 软件中的Neighbor-joining法构建系统发育树.
1.4 菌株汞敏感性检测菌株汞敏感性检测采用滤纸片法[15]. 将荧光假单胞菌用无菌水配置成1×108 cfu·mL-1的细菌混悬液，将100 μL菌液在LB培养基上涂布均匀，取无菌滤纸片贴在平板表面，将10、 30、 50、 100、 150、 200 μg的汞标准液滴在滤纸片上，每个处理6个重复，以汞标准液溶剂超纯水为空白对照. 置于30℃ 好氧条件下培养. 24 h后观察抑菌情况，以十字交叉法测量抑菌圈直径.
1.5 菌株的汞甲基化能力鉴定 1.5.1 供试菌悬液的制备取保存于-80℃ 的供试菌种，接种于LB液体培养基活化(30℃,100 r·min-1)，收集对数生长后期菌悬液，离心(5000 r·min-1，5 min)、 菌体用PBS缓冲液(磷酸二氢钾0.272 g·L-1，氯化钠8.19 g·L-1，磷酸氢二钠1.42 g·L-1，氯化钾0.223 g·L-1，pH 7.4)洗涤3次后，再悬浮于PBS缓冲液中. 采用血球计数法测定菌体细胞数量.
1.5.2 菌体细胞反应体系的建立配制初始Hg2+浓度为200 ng·L-1的PBS缓冲液: ①无菌滤膜过滤后，备菌株好氧汞甲基化试验用； ②无菌滤膜过滤后，采用Hungate铜柱除氧系统对溶液进行厌氧处理，菌株厌氧汞甲基化试验备用.
按无菌操作接入菌体细胞(1.5.1节)，并控制其终浓度为1×1011 cfu·mL-1 ，在30℃±1℃条件下避光静置培养，分别于第0、 1、 2、 2.3、 2.6、 3、 4、 5和6 h取样，分析其甲基汞浓度. 试验以不接菌体的处理为对照，每个处理重复3次.
1.6 分析方法与质量控制MeHg采用蒸馏-乙基化结合 GC-CVAFS 法[16]测定，检出限为0.02 ng·L-1. 试验所使用的玻璃器皿在使用前均在硝酸(25%，体积比)溶液中浸泡24 h以上，然后经超纯水清洗后，用500℃灼烧30 min后，在洁净无汞的环境下冷却后使用. 分析过程中采用空白试验、 平行试验和标准样品的测定来进行质量控制，试验药品均为优级纯或色谱纯. 氯化甲基汞标准溶液来自Brooks Rand Ltd.(USA),加标回收率为 80%~120%，平行样变异系数＜10%.
1.7 数据分析数据采用Excel进行基本计算,使用SPSS 19.0进行显著性分析，采用Origin 8.0拟合绘制汞甲基化特征曲线.
2 结果与讨论 2.1 菌株形态及生理生化特征通过对甲基化细菌的筛选，分离纯化得到1株在有氧和厌氧条件下均能使无机汞(Hg2+)转化为甲基汞的菌株，命名为Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2. 该菌株属于革兰氏阴性菌，电镜观察其菌体呈杆状，单个或短链状排列，不形成芽孢(图 1)，长约为2 μm,宽约0.5 μm. 在LB培养基上培养24 h后，菌落扁平，表面粗糙不透明，边缘呈波浪花纹，形状不规则，易用接种针挑起，在紫外光照射下产生黄绿色荧光(图 1). XD-MeHg-B2生理生化特征表明菌株接触酶、 氧化酶、 吲哚等试验呈现阳性，能液化明胶(表 2).
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图 1 菌株XD-MeHg-B2扫描电镜图(20000×)及在普通光学和紫外光照射下的菌落形态 Fig. 1 SEM image(20000×)and colony morphology of Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2 under the general optical and UV light |
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表 2 菌株XD-MeHg-B2的生理生化特征1) Table 2 Physiological and biochemical characteristics of Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2 |
2.2 菌株16S rDNA系统发育分析
对所分离出菌株XD-MeHg-B2进行16S rDNA测序，菌株的16S rDNA序列长度为1358 bp，GenBank登录号为KU954349，通过Blast比对，选取具代表性菌株，构建系统发育树(图 2). 结果表明，XD-MeHg-B2菌株与登录号为DQ279321的假单胞菌(Pesudomonas sp. TM4_4)同源性最高,处于同一最小分枝. 结合形态学及生理生化分析，判断XD-MeHg-B2属于荧光假单胞菌属.
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图 2 基于16S rDNA 序列同源性的Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2的系统发育树 Fig. 2 Phylogenetic tree based on 16S rDNA sequence of Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2 |
抑菌圈的大小可以反映测试菌对HgCl2的敏感程度[17]，大于20 mm处于极敏感水平. 试验中随着滤纸片上汞含量的增加，抑菌圈直径显著增大: 当单个滤纸片上HgCl2含量为10 μg时，抑菌圈直径为15.7 mm； 30 μg时，抑菌圈直径为19.8 mm； 200 μg时，HgCl2对荧光假单胞菌产生的抑菌圈最大为33.7 mm(图 3). 陈宏伟[18]从污染物中分离的1株假单胞菌和徐辉[19]从长期受到汞污染的土壤中分离的两株恶臭假单胞菌进行了耐汞水平鉴定，可耐受最大Hg2+浓度分别为40 mg·L-1和70 mg·L-1，与这些耐汞菌株不同的是，该菌在大于含5 mg·L-1 HgCl2的LB液体培养基中不能生存，且对环境中的汞表现出极敏感水平. 这可能与菌株的生长环境有很大关系. 上述试验结果表明，菌株XD-MeHg-B2对环境中Hg2+的耐受性不强，不属于强抗汞菌株.
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横坐标表示单个滤纸片中HgCl2的含量 图 3 不同汞含量对Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2菌株产生的抑菌圈大小 Fig. 3 Inhibition of Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2 by different Hg concentrations as measured by the disk sensitivity procedure |
Hamdy等[15]从乔治亚州Savannah河的底泥中分离出的1株产气肠杆菌Enterobacter aerogenes，在恒定的曝气条件下，研究了甲基汞的产生及其对汞的敏感程度，同样发现对汞处于敏感水平的E. aerogenes可以产生甲基汞，并证实该菌在恒定曝气条件下产生的甲基汞高于厌氧条件. 图 4结果表明，菌株XD-MeHg-B2在有氧和厌氧条件下均具汞甲基化能力. 有氧条件下XD-MeHg-B2在含汞PBS缓冲液中迅速表现出汞甲基化能力: 孵育60 min后，溶液中MeHg浓度呈指数增高，并在160 min时达到最大，约为3.85 ng·L-1±0.33 ng·L-1. 在180 min之后，溶液MeHg浓度稍下降并趋于稳定(2.86 ng·L-1±0.53 ng·L-1). 在有氧条件下的甲基汞转化率达到1.927%，远高于其他好氧菌(表 3).
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图 4 荧光假单胞菌 (Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2)在有氧和厌氧条件下的汞甲基化能力 Fig. 4 Methylation capacity of P. fluorescens sp. XD-MeHg-B2 under aerobic and anaerobic conditions |
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表 3 有氧条件下菌株的汞甲基化能力比较1) Table 3 Comparison of strains' methylation capacity under aerobic conditions |
目前绝大多数汞微生物甲基化的研究主要在厌氧条件下进行，且MeHg在厌氧条件下更加稳定[20~22],厌氧条件下XD-MeHg-B2同样表现出汞甲基化能力，但XD-MeHg-B2甲基汞生成较好氧条件显著滞后，且汞甲基化转化率较低: 孵育120 min后，溶液MeHg浓度开始呈指数增长，在180min左右达到最大，为2.86 ng·L-1±0.73 ng·L-1，随后开始下降，并趋于稳定，平均为2.57 ng·L-1±0.83 ng·L-1左右.
众多学者在汞浓度较高的条件下，对菌株的汞甲基化能力进行了研究(表 3)，对比可知，在低汞浓度下，XD-MeHg-B2的最大甲基化率显著高于其他. 尽管国内外学者普遍认为厌氧微生物，如硫酸盐还原菌(SRB)和铁还原菌(FeRB)是导致汞甲基化的主要微生物[24~26],但早期有研究发现，大量好氧细菌如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、 产气气杆菌(Aerobacter aerogenes)、 草分枝杆菌(Mycobaeterium phlei)、 大肠杆菌(Eseherichia coli)、 巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)等在有氧纯培养条件下能够将无机汞转化为甲基汞，且大肠杆菌和产气气杆菌的汞甲基化率在有氧条件下比无氧条件下高.
荧光假单胞菌是一类广泛存在于土壤中的植物根际促生优势细菌种群，可产生铁载体等10多种有抗菌作用的次生代谢产物[27]. 荧光假单胞菌向环境中分泌铁载体，不仅给自身提供充裕的可吸收铁源,同时还可以促生其他利用同源铁载体的细菌或动植物的生长，过量分泌的铁载体结合的Fe3+会给环境中带来过高的铁氧化还原压力,这也可能与其在有氧条件下可以使汞甲基化有一定的关系.
本试验用菌株分离自三峡库区消落带土壤，消落带地区长期的全淹-半淹-落干的自然环境导致了好厌氧环境的交替，使得该菌在好厌氧条件下均可发生汞的甲基化过程，且好氧条件下甲基汞的产生量在初始显著高于厌氧. Jara-Marini等[28]和Bouchet等[29]研究发现由于好厌氧环境的交替会导致甲基化过程最为活跃，MeHg 含量很高. Canário等[30]认为这主要是由于氧化还原条件的交替变化可以提高微生物的活性. 但Delaune等[31]对比研究了沉积物在厌氧和好氧条件下 MeHg 的产生量，发现去甲基化过程在好氧条件下更容易被加强，Hollweg等[32]研究表明，汞的甲基化作用在厌氧条件下更强； 在厌氧条件下，溶解态的无机汞几乎完全能被甲基化[33]. 综上所述，好氧条件下微生物的甲基化过程有待于更深入地研究.
然而，上述这些研究都是在初始汞浓度很高的条件下进行的(大于5 mg·L-1)，而实际环境中，特别是三峡库区消落带土壤中汞含量的本底浓度较低[34]，释放到水体中的汞浓度更少[35]. 本试验中，投加的初始Hg2+是基于三峡水库实际水体环境中的汞浓度，进行适当放大，对于三峡库区自然条件下汞的潜在变化，更能体现消落带土壤中菌群汞甲基化的能力.
3 结论(1) 从典型周期性好氧-厌氧交替的三峡库区消落带土壤中分离、 筛选出1株非抗汞、 且在好氧、 厌氧条件下均具有汞甲基化能力的菌株，经形态学、 生理生化与16S rDNA分子生物学分析，鉴定该菌株为γ-变形菌纲荧光假单胞菌，并将其命名为Pseudomonas fluorescens XD-MeHg-B2，GenBank登录号为KU954349. 该菌对环境中Hg2+极敏感，且在大于含5 mg·L-1 HgCl2的LB液体培养基中不能生存.
(2) P. fluorescens XD-MeHg-B2在初始Hg2+浓度为200 ng·L-1的PBS缓冲液，好氧条件下2.6 h达到最高甲基汞水平([MeHg]=3.85 ng·L-1±0.33 ng·L-1)； 而厌氧条件下，3.5 h达到最高甲基汞水平([MeHg]=2.86 ng·L-1±0.73 ng·L-1).
(3) 本研究结果证明，受三峡水库干-湿交替环境的影响，消落带土壤表现为非严格厌氧环境，荧光假单胞菌(P. fluorescens XD-MeHg-B2)是其中具汞生物甲基化能力微生物种群之一，对消落带土壤汞的甲基化可能起到重要的作用. 本试验结果有望为深入研究消落带土壤汞生物甲基化机制、 正确评价三峡水库蓄水运行后可能带来的汞生态风险评价提供理论依据.
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