2016, Vol. 37
2. 中国地质科学院岩溶地质研究所, 国土资源部/广西岩溶动力学重点实验室, 桂林 541004;
3. 桂林医学院研究生院, 桂林 541004;
4. 桂林理工大学广西环境污染控制理论与技术重点实验室, 桂林 541004
, HUANG Ya-dan3 , ZHANG Ying1,2,4 , JIN Zhen-jiang1,4 , LIANG Yue-ming2 , SONG Ang2 , WANG Teng1,4 , GUO Jia-yi1,4 , LI Qiang2
2. Key Laboratory of Karst Dynamics, Ministry of Land and Resources & Guangxi, Institute of Karst Geology, Chinese Academy of Geological Sciences, Guilin 541004, China;
3. Graduate School of Guilin Medical University, Guilin 541004, China;
4. Guangxi Key Laboratory of Environmental Pollution Control Theory and Technology, Guilin University of Technology, Guilin 541004, China
土壤生态系统作为地球上最为庞大的“微生物仓库”，对推动生物地球化学循环过程具有重要的作用. 土壤微生物不但能够降解天然的有机物[1]，而且对于人工合成的外源有机物，在足够的时间下也能进化出相应的代谢途径和降解酶系统[2]. 外源有机物进入土壤生态系统后，土壤微生物群落将对输入的外源物质做出迅速响应，其群落特征(丰度、 群落结构)发生相应变化，成为指示土壤质量变化最为灵敏的指标之一[3]，因而研究土壤微生物群落特征对外源人工合成有机物的响应在土壤质量管理中具有重要的意义.
双酚A(bisphenol A，BPA)是一种典型的人工合成外源有机物，广泛分布于各种环境中. 作为重要的化工原料被广泛应用，全球年产量高达750万t. 已有动物及人体细胞实验研究结果表明双酚A具有雌激素作用[4]，能通过与雌激素受体结合影响细胞信号传导途径[5]. 因此，BPA的大量使用能够造成严重的环境污染. 目前，BPA在水体环境介质中均被频繁检出[6]. 譬如: 2012年莱州湾37个站位表层沉积物中BPA的平均含量为0.66 μg·kg-1[7]，深圳市的10条主要河流调查显示 BPA含量最高为6 042 ng·L-1[8]. 目前的污水处理厂出水及污泥中BPA检出率较高[9]，含有BPA的再生水排入河流后产生了污染，而土壤吸附也是BPA的主要去除过程[10]. 加之农田灌溉、 人类活动和农业活动的影响，导致BPA也在土壤中开始积累，Bich等发现法国农田土壤中BPA等污染物水平仅次于城市土壤[11]. Peng等[12]通过调查发现中国某区域土壤样品中BPA的含量为25.2 ng·g-1. BPA作为一种重要的内分泌干扰物，低剂量BPA即可引起生物体内分泌系统失衡，有关研究者针对BPA在土壤中的吸附[13, 14]、 分布[15]、 迁移转化[16, 17]与降解[18~20]行为开展了相应的研究，此外部分学者还利用平板培养法探讨BPA对土壤中细菌、 真菌、 放线菌三大类微生物数量的影响，结果表明随着BPA含量的增加，微生物数量减少[21].
由于平板培养法仅能培养出极少数(少于1%)的微生物[22]，获得较少的土壤微生物信息，造成土壤微生物的群落结构及功能不能被真实地反映. 随着现代分子生物学技术的发展，土壤微生物基因组总 DNA可被直接提取，并通过实时荧光定量 PCR 技术，分析复杂土壤环境中微生物数量的变化规律，进而克服传统平板计数法的不足.
解开治等[23]利用实时荧光定量PCR技术探讨不同浓度双酚A污染的稻田土壤细菌群落特征，结果表明稻田土壤细菌数量显著低于未受污染的对照. 尽管该结果为深入了解BPA对占土壤微生物总数的70%~90%细菌群落[24]的毒理作用具有重要的意义，然而作者却忽视了BPA对逆境条件适应能力最强的土壤真菌群落的影响. 由于稻作农业存在灌溉以及排水晒田的过程，解开治等仅仅探讨了好氧(排水晒田)条件下的土壤细菌群落变化特征，而忽视了厌氧(灌溉)条件下的土壤微生物群落变化特征. 而厌氧微生物在无需提供外源能量的情况下，已被还原有机物作为受氢体来完成生物化学反应，该类微生物营养需求低，耐毒性强，可降解高分子量有机物. 因此，笔者采用实时荧光定量PCR与PCR-DGGE技术相结合的方法，探讨典型环境激素污染物——BPA在不同浓度和土壤通气条件下对稻田土壤微生物群落特征的影响，以期为评价BPA 污染稻田土壤的环境质量以及指导稻作农业活动提供重要的理论依据.
1 材料与方法 1.1 供试材料供试土壤为典型的岩溶水稻土，采自桂林会仙岩溶湿地(25°06′12.9″N，110°12′7.6″E，海拔: 174 m). 受人类活动的影响，桂林会仙岩溶湿地不断被蚕食，水体受到不同程度的污染.
1.2 实验设计因水稻种植过程中分排水晒田和灌溉两个阶段，为模拟稻田土壤微生物的生存环境，实验共设有氧、 厌氧两组培养方式，每组设置5个处理，每个处理设置3个重复. 将BPA溶解于无菌水，配制成含量为0(CK)、 0.05、 0.1、 0.2、 0.4 mg·mL-1的储备液并置于4℃冰箱保存. 分别称取200 g土样于无菌培养瓶中，加入不同浓度的BPA储备液，使试样中BPA含量依次为0、 0.25、 0.50、 1.00和2.00 mg·kg-1. 有氧组为正常通风条件下培养，厌氧组在通入CO2条件下培养. 培养30 d后采集土壤样品，新鲜土样用于土壤总DNA提取和微生物量碳、 氮的分析，部分风干土样用于土壤pH值和可溶性有机碳(DOC)的测定.
具体实验设计方案和理化性质如表 1所示.
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表 1 实验设计方案及理化性质 Table 1 Experiment design scheme and physic-chemical characteristics |
1.3 测定方法 1.3.1 土壤DNA的提取和浓度测定
土壤微生物总DNA的提取采用MOBIO公司的土壤DNA快速提取试剂盒，并利用微量紫外分光光度计 (Quawell 5000，美国)测定DNA浓度和纯度.
1.3.2 荧光定量PCR采用荧光定量PCR仪(BIO RAD，CFX96TM Real-Time System，美国)进行qPCR扩增. 16S rRNA扩增体系体系(25 μL): 模板DNA(genomic DNA，5 ng·μL-1)1 μL，Green-2-Go qPCR Mastermix (Sangon Biotech，上海) 12.5 μL，去离子无菌水9.5 μL，浓度为10 μm·μL-1的正向引物和反向引物各1 μL. 16S rRNA扩增引物采用Muyzer等[25]的特异性引物对: 正向引物F338(5′-CCT ACG GGA GGC AGC AG-3′)与反向引物R518(5′-ATT ACC GCG GCT GCT GG-3′). 16S rRNA的扩增程序为: 95℃预变性3 min，95℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，39个循环，最后72℃延伸5 min. 采用10倍梯度稀释的已知拷贝数含有V3区片段的质粒做标准曲线，扩增效率90%~105%，R2>0.99.18S rRNA反应体系与16S rRNA一致，扩增引物采用May等[26]的特异性引物对: 正向引物Fungi(5′-ATT CCC CGT TAC CCG TTG-3′)与反向引物NSI(5′-GTA GTC ATA TGC TTG TCT C-3′). 18S rRNA的扩增程序为: 95℃预变性15 min，95℃变性1 min，56℃退火1 min，72℃延伸1 min，39个循环，最后72℃延伸5 min. 采用10倍梯度稀释的已知拷贝数含有18S rRNA区片段的质粒做标准曲线，扩增效率90%~105%，R 2>0.99. 每克干土中的基因拷贝数即为微生物丰度.
1.3.3 聚合酶链式反应和变性梯度凝胶电泳PCR-DGGE(1)聚合酶链式反应(PCR)
18S rRNA反应体系和扩增引物与1.3.2节中的相同. 不同处是在18S rRNA的正向引物的5′端分别添加40碱基的GC夹子(5′-CCG CCG CGC GGC GGG CGG GGC GGG GGC ACG GGG-3′)[27]. 16S rRNA反应体系与1.3.2节中相同. 扩增引物为V6区通用引物，正向引物5′端添加GC夹子: F968-GC(F-CGC CCG GGG CGC GCC CCG GGC GGG GCG GGG GCA CGG GGG GAA CGC GAA GAA CCT TAC-3′)，反向引物为: R1401 (5′-CGG TGT GTA CAA GAC CC-3′)； 扩增条件为: 94℃预变性3 min，94℃变性30 s，56℃退火30 s，72℃延伸1 min，30个循环，最后72℃延伸10 min. PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测质量.
(2)变性梯度凝胶电泳(DGGE)
所得PCR产物利用BIO RAD公司(DCodeTM Universal Mutation Detection System)制胶系统进行变性梯度凝胶电泳. 细菌PCR扩增产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度自下至上为55%~70%，在60℃、 100 V恒定电压下电泳9 h. 真菌PCR产物采用8%聚丙烯酰胺凝胶，变性剂浓度自下至上为15%~35%，在60℃、 90 V恒定电压下电泳9 h. 用银染法染色，BIO-RAD的Gel-Doc-2000凝胶影像分析系统拍照. 用BIO-RAD公司Imange lab分析软件对条带数量、 位置及亮度峰值进行分析. 多样性指数的计算方法[27]如下.
香农-维纳多样性指数：
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Margalef丰富度指数：
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均匀度指数：
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其中，
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式中，S为OTUs总数，即条带数； N为泳道中OTU的总亮度峰值； ni为第i个OTU在所有克隆中的比值.
1.4 数据处理与统计荧光定量PCR数据归一化参照文献[28]中的方法，将不同培养条件下各浓度梯度的16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数加和后分别进行归一化，计算公式为:
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式中,xi为不同BPA浓度下的基因拷贝数.
PCR-DGGE数据处理应用BIO-RAD公司Gel DocTMXRT型成像仪和Image Lab软件进行泳道分析. 所获得数据运用EXCEL和SPSS软件进行统计.
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图 1 16S rRNA和18S rRNA的基因丰度 Fig. 1 Abundances of 16S rRNA and 18S rRNA genes |
有氧条件下，随着BPA含量的增加，16S rRNA基因拷贝数呈先降后升趋势，BPA含量为0.50 mg·kg-1处出现最小值为5.715×1010 拷贝·g-1，且各含量下基因拷贝数均低于CK组. 相反，厌氧条件培养下，随着BPA含量的增加，16S rRNA基因拷贝数先升后降，且0.50 mg·kg-1含量处出现最大值为5.803×1011拷贝·g-1.
有氧条件下，随着BPA含量的增加，18S rRNA基因拷贝数总体先降后升，BPA含量为0.50 mg·kg-1处出现最小值0.723×106拷贝·g-1. 相反厌氧条件培养下，随着BPA浓度的增加，18S rRNA基因多样性指数先升后降，BPA含量为0.50 mg·kg-1处出现最大值，为3.735×106拷贝·g-1.
综合图 1可知，厌氧培养条件下，16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数的变化趋势相似，即16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数在BPA含量为0~0.50 mg·kg-1范围内均有升高，在0.50~2.00 mg·kg-1范围内有所降低，在0.50 mg·kg-1达到最大值.
将同一培养条件下不同含量间的基因拷贝数进行差异性分析，结果表明: BPA含量为0.50 mg·kg-1时，基因拷贝数与同种培养条件下的其它含量间差异性最大，且16S rRNA和18S rRNA同在有氧条件下基因拷贝数最低，而厌氧条件下基因拷贝数最高. 由此可见，BPA含量为0.50 mg·kg-1时对于细菌和真菌群落的基因丰度影响最为显著.
对同一含量下的16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数加和后进行归一化处理(表 2)，在有氧培养下，各含量下的归一化基因拷贝数均低于CK组，与前人研究成果相一致[17]； 厌氧培养下，除BPA含量为0.50 mg·kg-1处，其它各含量下的归一化基因拷贝数均低于CK组. 综合有氧和厌氧两种培养条件下基因丰度变化趋势可知，稻田土壤中BPA的输入降低了微生物群落基因丰度.
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表 2 16S rRNA和18S rRNA归一化基因拷贝数 Table 2 CNV of 16S rRNA and 18S rRNA genes |
由16S rRNA和18S rRNA总基因拷贝数呈先升后降趋势，在BPA含量为1.00 mg·kg-1时出现最大值0.266； 而有氧条件下变化趋势大致相反，先降后升，同时在含量为1.00 mg·kg-1时达到最小值0.026.
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图 2 16S rRNA和18S rRNA归一化拷贝数趋势 Fig. 2 Trend of normalized CNV of 16S rRNA and 18S rRNA genes |
由单个样本PCR-DGGE图谱(图 3)可知，16S rRNA条带多样性差异并不明显，而18S rRNA多样性差异较为明显.
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图 3 基于16S rRNA和18S rRNA 的PCR-DGGE图谱 Fig. 3 DGGE patterns of 16S rRNA and 18S rRNA PCR amplification products |
通过对单个样本PCR-DGGE条带的处理，分别得出香农-维纳指数、 丰富度指数和均匀度指数(表 3). 有氧条件下，双酚A含量对16S rRNA基因的香农维纳指数和均匀度指数均较CK组有所降低，丰富度指数呈先降后升趋势. 多样性指数总体变化幅度在-13.94%和5.36%之间； 厌氧条件下，3个多样性指数均呈升高趋势，其中丰富度指数先升后降. 多样性指数总体变化幅度在-4.19%和13.43%之间.
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表 3 基于16S rRNA和18S rRNA DGGE图谱的微生物多样性指数 Table 3 Microbial diversity indices of 16S rRNA and 18S rRNA based DGGE profile |
有氧条件培养下，随着双酚A含量的增加，18S rRNA基因的香农维纳指数、 丰富度和均匀度均呈现先降低后升高的变化趋势，最小值出现在浓度为0.50 mg·kg-1处. 3种多样性指数总体变化幅度在-35.78%和8.62%之间. 而厌氧条件培养下18S rRNA基因多样性指数与有氧培养条件相反，呈现先升后降的变化趋势，最大值出现在浓度为0.50 mg·kg-1处. 3种多样性指数总体变化幅度在3.65%和83.71%之间.
真菌群落的微生物多样性指数与其基因丰度的变化趋势一致，而细菌群落的多样性指数波动较小.
2.3 不同浓度及培养条件与微生物群落特征的双因素方差分析双因素方差分析表明，培养条件(有氧和厌氧)、 BPA含量及其交互作用对16S rRNA基因丰度影响显著(表 4)； 而对于18S rRNA基因丰度而言，只有培养条件对其影响显著. 以上结果表明，培养条件对真菌和细菌丰度的影响均差异显著，说明培养条件(有氧和厌氧)是影响BPA污染土壤中微生物丰度的主要因子.
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表 4 16S rRNA和18S rRNA基因拷贝数双因素方差分析 Table 4 Two-factor ANOVA of gene copy number of 16S rRNA and 18S rRNA genes |
3 讨论
BPA作为人工合成的环境激素之一，广泛存在于水体和土壤中，对生物健康和遗传特性产生影响[29]. 存在于土壤中的BPA对土壤微生物数量和群落结构产生一定影响[23]. 微生物作为土壤中最为敏感的生物类群，对BPA浓度和土壤通气条件变化的响应较为敏感. 土壤微生物(细菌和真菌)基因丰度结果发现： 厌氧条件下，细菌和真菌基因丰度呈先增后降的趋势且总体高于对照组，而有氧条件细菌和真菌基因丰度变化趋势与之相反且总体低于对照组. 土壤微生物基因丰度与土壤微生物量碳的分布趋势一致，初步研究表明厌氧型细菌和真菌在BPA污染的稻田土壤中受到促进，而好氧型细菌和真菌受到抑制； 厌氧微生物在BPA污染的稻田土壤中占主导地位. 结合PCR-DGGE的微生物多样性检测技术对有氧及厌氧培养条件下BPA污染土壤微生物群落特征[30]进行检测，分别对香农维纳指数、 丰富度、 均匀度指数进行计算，结果发现: 细菌群落在有氧和厌氧条件下，BPA含量变化对细菌多样性指数影响较小，而真菌群落在有氧条件下先降后升，总体低于对照； 而厌氧条件下先升后降且总体高于对照组，与该条件下真菌丰度变化趋势一致. 进一步研究表明真菌在BPA污染的稻田中更易受到土壤通气条件的影响，而厌氧型真菌在BPA污染的稻田中占主导地位.
大多数天然的或者与天然有机物相似的人工合成有机物可被微生物所代谢、 所降解[24]. 已知环境中存在多种微生物在一定条件和浓度下可代谢和降解BPA[31]，而 BPA一方面作为碳源可被微生物所利用，另一方面对微生物具有生物毒性[32]，故较高的底物浓度会抑制微生物细胞生长和代谢活动[33]，BPA浓度为0.50 mg·kg-1时，在厌氧条件下，细菌和真菌基因丰度同时达到最大且与对照组差异性显著； 而在有氧条件下，细菌和真菌基因丰度最小. 16S rRNA和18S rRNA归一化总基因拷贝数也得到类似的结果. 说明BPA浓度为0.50 mg·kg-1是影响微生物群落数量的一个临界值，厌氧微生物数量在该浓度下得到最大程度促进； 而好氧微生物数量在该浓度下受到了较强的抑制作用. 此外，有氧条件培养下细菌和真菌基因丰度显著低于厌氧培养条件，表明稻田土壤在排水晒田状态下，BPA的输入会降低微生物基因丰度.
土壤中以细菌数量最多，放线菌和真菌类次之[24]，目前已知的具有BPA降解能力的微生物以细菌占多数，凭借其庞大的基数和较高的降解效率[34, 35]使细菌群落在受到不同浓度的BPA的刺激时能够保持稳定性. 且降解BPA能力的众多细菌在一定程度上具有缓冲作用，使参与代谢BPA的功能性细菌数量在大幅度波动的情况下，细菌群落多样性指数仍趋于稳定. 由于受DGGE技术的灵敏度限制[36]，微生物群落产生的微小变化很难被检测出. 因此，室内培养条件下细菌群落多样性指数受BPA影响较小. BPA存在的稻田土壤中细菌群落特征变化评价指标的选取，微生物丰度的意义大于多样性指数. 相比于细菌群落，真菌群落抵御BPA扰动的能力较弱，添加不同浓度的BPA对其多样性指数变化影响较大，与降解BPA真菌群落较低的降解效率有关，如Chai等[37]发现，通过26种具有BPA降解力的真菌的模拟降解实验研究，发现其中11种的降解能力仅为50%以上，其中仅有4种具有相对较高的降解效率. 所以即使微小的刺激也会导致真菌多样性指数产生大幅波动. 综合18S rRNA的基因丰度结果，真菌微生物群落多样性指数在不同培养条件下的变化趋势与基因丰度的变化趋势一致，均对BPA污染土壤的微生物群落特征变化具有指示作用. 而作为土壤理化指标的pH和DOC却未发生显著变化. 结合细菌群落特征指标的选取结果，微生物群落丰度更能够反映土壤微生物群落的变化，相对于微生物群落多样性指数，更适合作为土壤微生物特性变化的评价指标.
细菌和真菌基因丰度的双因素方差分析发现，培养条件、 浓度及培养条件与浓度的交互作用对细菌丰度影响显著，表明BPA污染的稻田中土壤细菌数量受土壤通气条件和BPA浓度影响显著，对于土壤通气条件和BPA浓度变化响应较为敏感. 而只有培养条件对真菌基因丰度的影响差异显著，表明BPA污染的稻田土壤中真菌数量主要受土壤通气条件的影响. 综上所述: 水稻土壤中细菌丰度对BPA的响应较真菌敏感，真菌丰度受BPA的影响较小，耐受性较强. BPA污染的稻田土壤中，培养条件是影响土壤微生物数量的关键因子. 以上结果应用于农业耕作中，即在土壤耕作时应避免深翻、 延长淹水时间，使之最大程度处于厌氧情况，有利于微生物群落健康、 提高土壤活力，此发现与Lupwayi等[38]研究结果相吻合，即免耕土壤中的微生物多样性和生物量均高于传统耕作后的土壤[39]. 该结果对于稻田土壤健康管理具有重要的指导意义.
4 结论(1) 受BPA污染稻田土壤，厌氧条件有利于提高微生物群落数量，而有氧条件则降低微生物数量，从而指导人们在耕作BPA污染农田过程中，应该避免土壤深翻，延长淹水时间等方法来增加微生物数量，减缓BPA的毒害作用，提高土壤质量.
(2) 不同培养条件下，微生物基因丰度对BPA浓度变化敏感，且同时在浓度为0.50 mg·kg-1时达到峰值，说明0.50 mg·kg-1是BPA的一个浓度阈值，此时的微生物群落特性受到最大程度扰动； 相对于土壤pH、 DOC和微生物多样性指数而言，丰度指数更适合于作为土壤微生物特性变化的评价指标.
(3) 细菌和真菌基因丰度的双因素方差分析表明，与细菌相比，真菌丰度对BPA的响应不敏感，表明真菌对BPA的耐受性较细菌群落强，为未来筛选菌株用于治理受BPA污染土壤提供理论依据.
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