2016, Vol. 37
2. 中国科学院大学, 北京 100049;
3. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 桃源农业生态试验站, 长沙 410125;
4. 中国科学院亚热带农业生态研究所, 长沙农业环境观测研究站, 长沙 410125
2. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China;
3. Taoyuan Agro-ecosystem Research Station, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China;
4. Changsha Research Station for Agricultural & Environmental Monitoring, Institute of Subtropical Agriculture, Chinese Academy of Sciences, Changsha 410125, China
中国是世界上种植水稻面积最大的国家，稻田总面积高达3 400万hm2，其中亚热带区域稻田面积占全国总面积的31.4%[1]. 亚热带区域水稻秸秆资源丰富，约占全国秸秆总量的50%~60%[2]. 水稻秸秆含氮量约6.0 g·kg-1，含磷量约1.0 g·kg-1，含钾量约15 g·kg-1，含碳量400 g·kg-1，是一种具有极高营养价值的可再生资源[3]. 稻田秸秆还田既可以避免资源浪费和焚烧秸秆带来的环境污染[4]，也可以增加土壤有机质和土壤肥力[5, 6]，并改善土壤结构[7].
土壤微生物作为土壤生态系统重要的组成部分，在秸秆腐解和土壤养分循环过程中发挥重要的作用[8]. 一方面秸秆覆盖增加了土壤微生物生物量，提高微生物的活性[9]，另一方面土壤微生物生物量及活性的提高也会加快秸秆的腐解[10]. 生物多样性越高的生态系统越稳定的Elton 假说，受到大多数学者的认同，保持土壤微群落的多样性及其驱动下的生态过程多样性是农业生产赖以生存的基础.
由于土壤微生物多样性相对稳定,只有长期持续的培肥地力,才会反映出具有相对稳定的土壤微生物多样性特征组分. 目前关于长期施肥和秸秆还田对土壤微生物群落结构和多样性的研究比较多，对微生物群落功能多样性产生显著影响的研究大多是基于长期施肥定位试验[11, 12]. 普遍认为短期施肥或秸秆还田对土壤微生物的影响有限，目前的研究也相对比较少. 有研究发现旱作农业系统，连续3 a[13]、 2 a[14]或施肥1 a[15]对土壤微生物区系的影响不显著. 从短期的不显著到长期的显著，土壤微生物受施肥影响而发生演变. 亚热带双季稻系统一年两熟，水肥管理也明显区别与旱作系统，同样是连续3 a施肥，也可能会造成土壤微生物的显著差异.
目前，对土壤微生物的研究大多在DNA水平开展. 与DNA 相比，RNA 合成效率更快，可以在短时间快速响应外界环境变化[16]. 而且，在DNA 水平上检测到基因的存在并不意味着该基因得到了转录，而RNA 的存在能在很大程度上表明微生物基因处于活性状态，并驱动着重要的生物地球化学过程[17]. 短期施肥在DNA水平上对土壤微生物的影响不显著，也许在RNA水平会产生显著的差异.
因此，本研究以湖南金井不同施肥方式定位试验为平台，探索连续3 a不同施肥管理模式下，双季稻田土壤微生物在DNA水平和RNA水平的差异以及对施肥的响应，以了解双季稻田土壤微生物演变规律，以期为提高稻田土地生产力和可持续发展提供理论依据.
1 材料与方法 1.1 试验地概况土壤样品采自中国科学院亚热带农业生态研究所长沙农业环境观测研究站不同施肥方式长期定位试验站(113°19′52″E,28°33′04″N). 该站位于湖南省长沙县金井镇，属于典型的亚热带湿润季风气候，海拔100 m，年均气温17.5℃，年均降雨量1 330 m，无霜期约为300 d. 不同施肥方式长期定位试验开始于2012年早稻季，作物轮作为双季稻，一年两熟. 土壤类型为花岗岩发育的麻沙泥水稻土，试验前0~20 cm耕层土壤基本理化性质见文献[18]. 试验采取完全随机区组设计，4个处理: N0(不施氮肥)，NPK(常规施肥)，NPK+LS(3.0 t·hm-2秸秆还田，以LS表示)，NPK+HS(6.0 t·hm-2秸秆还田，以HS表示). 所用的秸秆在还田前均切短至5~7 cm长，切短的秸秆在水稻移栽前按照前述的量全部一次性翻埋于土壤耕作层. 试验处理设置和各处理施肥量见表 1. 过磷酸钙(以P2O5计)、 氯化钾(以K2O计)和硫酸锌(以ZnSO4计)以基肥一次性施入，尿素(以N计)基肥和追肥比为5∶5，追肥在水稻生长的分蘖中期、 抽穗期按3∶2的比例(追肥部分)追施. 其中秸秆还田处理的施肥量为秸秆中N、 P、 K养分输入量与化肥施用量之和，从而确保NPK、 NPK+LS和NPK+HS这3个处理的N、 P、 K养分输入一致. 试验小区病虫害防治和杂草清除及其他田间管理措施均采用常规管理模式，且各小区完全一致.
1.2 样品采集土壤样品采集于2014年9月初 (晚稻分蘖期),S型多点采集0~20 cm土壤样品. 土样在田间充分混匀，并剔除植物根、 石块等杂物后，一部分(约100 g)用锡箔纸包好后立即用液氮速冻，存放于-80℃冰箱用于分子生物学试验； 另一部分土样(约400 g)存于4℃冰箱，用于土壤理化性质测定.
1.3 土壤DNA和mRNA提取土壤样品中微生物DNA提取方法参照文献[19]，采用SDS-GITC-PEG 法. 土壤总RNA提取方法参照文献[20, 21],并作适当修改. 0.5 g新鲜土壤样品从-80℃取出后，在解冻前迅速没入提取液中；500μL CTAB提取液调整为250μL 20%SDS加250μL CTAB提取液，其他操作步骤基本不变.提取的总RNA用RNeasy MinEluteTM Cleanup Kit (Qiagen,Germany)纯化，去除5S RNA和残留的盐分. 纯化过的RNA用mRNA-ONLYTM Prokaryotic mRNA Isolation Kit (Epicentre Biotechnologies,USA)进行mRNA富集. 使用RevertAidTM First strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas) 将mRNA反转录为cDNA，具体操作参照试剂盒说明书. 在反转录过程中插入两个对照，一个不加mRNA，一个加mRNA但是不加反转录酶以检测在纯化及反转录过程中是否有DNA污染. 反转录使用引物为随机引物，PCR检测反转录是否成功. 得到的DNA和cDNA直接用于后续的分析.
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表 1 田间小区试验处理设置和各处理施肥量/kg·hm-2 Table 1 Field plot experiment establishment and fertilizer application rate/kg·hm-2 |
1.4 微生物与群落结构和基因丰度分析
T-RFLP试验: 所使用的PCR 仪器为Eppendorf-6321，采用通用引物16S rDNA (8f/1492r)[22],正向引物5′端用6-羧基二乙酸荧光素(FAM)标记. PCR反应体系、 反应程序同文献[23]. 末端FAM标记的PCR纯化后产物用MspⅠ酶切，酶切产物的T-RFLP分析由上海桑尼生物技术有限公司完成，分析仪器为 ABI Prism 3100 Genetic Analyzer. 利用PC-ORD(5.0)软件计算T-RFLP图谱的OUT个数，均匀度指数，香农多样性指数和辛普森多样性指数. 利用Canoco for windows (4.5) 软件做主成分分析(principal components analysis，PCA)和冗余分析(redundancy analysis,RDA)研究土壤细菌群落结构以及土壤环境因子对群落结构的影响.
实时定量PCR: 所用仪器为ABI 7900 (AppliedBiosystem)，引物为16S通用引物341f/515r. 质粒DNA ndeⅠ酶切后(线性化)，用T7体外反转录试剂盒(Thermo)反转录为RNA，再用DnaseⅠ(Promega)降解多余的DNA，并用RNeasy MinEluteTM Cleanup Kit Qiagen,Germany)纯化RNA. 纯化后的RNA用RevertAidTM First strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas)反转录为cDNA，10倍梯度稀释，作为cDNA标准样品-20℃保存备用. 质粒DNA，标准曲线的制备同文献[23]. DNA水平标准曲线为ct=-3.31 lg c+31.31(R2=0.996)，cDNA水平的标准曲线为ct=-3.23 lg c+41.31(R2=0.992). ct是实时定量PCR反应的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数； c是初始模板DNA或cDNA基因拷贝数. 稀释至5 ng·μL-1的NDA,mRNA稀释至10 ng·μL-1后反转录为cDNA样品作为模板进行qRT-PCR扩增.
1.5 数据分析采用SPSS 20.0 统计软件对数据进行单因素方差分析(ANOVA)，差异显著性水平通过最小显著差数法(LSD)进行检验，偏相关法分析相关关系.
2 结果与分析 2.1 不同处理对土壤基本理化性状的影响定位试验结果表明，不同处理改变了土壤中矿物质氮和微生物量碳、 氮(表 2). 与不施肥处理(N0)相比，平衡施肥(NPK)增加了水稻生育期硝态氮和铵态氮的含量. 在平衡施肥的基础上进行秸秆还田增加了土壤微生物量碳、 氮和铵态氮的含量，并且高量秸秆还田处理(NPK+HS)铵态氮含量高于低量秸秆还田处理(NPK+LS). 受试验年限的影响，不同处理对土壤pH、 SOC、 DOC和土壤含水量均没有产生显著影响.
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表 2 不同处理土壤理化性质1) Table 2 Soil biochemical properties in different treatments |
2.2 不同处理对土壤细菌群落结构的影响
从图 1可见，施肥和秸秆还田显著改变了土壤细菌群落组成(DNA水平)和转录组成(cDNA水平)结构，且不同处理中DNA水平的T-RFLP图谱与cDNA水平相差很大. 在DNA水平上，与不施肥处理(N0)相比，平衡施肥(NPK)处理增加了114 bp和210 bp t-RFs的相对丰度，分别增加了11.77%和11.79%； 引起了76、 116、 188、 224、276 bp t-RFs 的消失. 与平衡施肥(NPK)处理相比，秸秆还田平均减少了114 bp、 210 bp t-RFs的相对丰度，分别减少了12.19%和12.20%； 增加了116、 224、 404 bp t-RFs 相对丰度，分别增加了10.60%、 10.53%和4.71%； 另外，114 bp和210 bp t-RFs只在低量秸秆还田处理出现，而404 bp t-RFs只在高量秸秆还田处理出现.
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图 1 不同处理对16S rRNA基因群落组成和转录组成结构的影响 Fig. 1 Effects of fertilization and straw return on the community composition of 16S rRNA gene and gene transcripts |
从cDNA水平T-RFLP图谱(图 1)可以看出，亚热带稻田土壤转录的细菌群落主要是148 bp t-RFs，不同处理相对丰度差别不大，平均为36.98%. 某些相对丰度较小的t-RFs受施肥方式的影响较大，其中不施肥处理(N0)和平衡施肥(NPK)处理对比分析发现，126、 152、 160、 166、 168、 194 bp t-RFs只在平衡施肥(NPK)处理出现，而64、 70、 72、 100、 170、 400 bp t-RFs只在不施肥处理(N0)出现； 平衡施肥(NPK)处理和秸秆还田处理对比分析发现，118、 126、 184 bp t-RFs只在平衡施肥(NPK)处理出现，100 bp、 152 bp t-RFs只在秸秆还田处理出现； 不同秸秆还田量对比分析发现，74、 168、 260 bp t-RFs只在低量秸秆还田处理出现，而136 bp、 170 bp t-RFs只在高量秸秆还田处理出现.
PCA分析结果表明(图 2)，施肥和秸秆还田改变了16S rRNA基因群落组成和转录组成结构，但不同秸秆量之间差异不大. 在DNA水平上，平衡施肥(NPK)处理与不施肥处理(N0)和秸秆还田处理(NPK+LS,NPK+HS)与16S rRNA基因群落组成在PCA 1轴上明显分开，且后3个处理在PCA 2轴上也明显分开. 在cDNA水平上，不平衡施肥(N0)处理与施肥处理(NPK)和秸秆还田处理(NPK+LS、 NPK+HS)在PCA 1轴上明显分开，且后3个处理在PCA 2轴上也明显分开.
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图 2 不同处理16S rRNA基因群落组成和转录组成结构的PCA分析 Fig. 2 PCA analysis of the composition of 16S rRNA gene and gene transcripts |
利用T-RFLP图谱进一步分析不同处理土壤细菌多样性指数(表 3)可以看出，施肥和秸秆还田降低了土壤中存在的细菌多样性，对土壤中转录的细菌多样性没有影响. 在DNA水平上，与不施肥对照(N0)相比，施肥和秸秆还田显著降低了土壤细菌物种数量和香农多样性指数，其中物种数量秸秆还田处理最低，多样性指数平衡施肥处理最低. 在cDNA水平上，不同处理只对物种均匀度指数产生影响. 与不施肥对照(N0)相比，高量秸秆还田增加了土壤中转录的细菌物种均匀度指数，其它处理之间没有差异. 另外，无论在DNA水平或cDNA水平，不同秸秆还田量对各多样性指标均没有产生显著影响.
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表 3 不同处理土壤细菌多样性指数1) Table 3 Soil microbial diversity index based on T-RFLP profiles in different treatments |
2.3 不同处理对土壤细菌丰度的影响
从图 3可见，土壤16S rRNA基因丰度(DNA水平)平均是其转录丰度(cDNA水平) 的337倍，在DNA和cDNA水平上施肥和秸秆还田对土壤细菌数量的影响相似. 与不施肥处理(N0)相比，平衡施肥(NPK)没有改变土壤细菌的数量，在平衡施肥的基础上进行秸秆还田增加了土壤细菌的数量，但高量秸秆还田与低量秸秆还田没有显著差异.
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纵坐标单位以每g干土计 图 3 不同处理土壤16S rRNA基因丰度(DNA水平)及其转录丰度(cDNA水平) Fig. 3 Abundance of 16S rRNA gene (DNA level) and gene transcripts (cDNA level) in different treatments |
通过RDA蒙特卡洛检验表明(图 4)，在DNA水平上，土壤中存在细菌群落主要受到土壤中铵态氮含量、 pH值和土壤微生物量氮的影响； 在cDNA水平上，土壤中转录细菌群落主要受到铵态氮含量的影响. 相关分析表明，在DNA水平上，土壤存在的细菌数量与土壤铵态氮、 微生物量碳以及微生物量氮含量密切相关； 在cDNA水平上，土壤中转录的细菌数量与土壤微生物量氮和土壤有机质含量密切相关(表 4). 说明亚热带稻田土壤中铵态氮的变化是驱动土壤中存在及转录的细菌群落结构和数量的关键因子.
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图 4 不同处理16S rRNA基因群落组成和转录组成结构的RDA分析 Fig. 4 RDA analysis of the composition of 16S rRNA gene and gene transcripts in different treatments |
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表 4 不同处理土壤细菌丰度与土壤理化性质之间的关系 Table 4 Correlation analysis between microbial community profile and environmental variables in different treatments |
3 讨论
对比研究发现，cDNA和DNA水平上，不同施肥方式细菌丰度具有极高的一致性； 然而，cDNA和DNA水平上，细菌群落结构差异极大，不同处理细菌多样性的差异也只在DNA水平发现. 本研究cDNA水平上转录的细菌拷贝数只是DNA水平上存在的细菌拷贝数的0.3%，比Lee等[24]针对产甲烷功能基因mcrA和甲烷氧化功能基因pmoA研究得到的转录的与存在的基因拷贝数比率低. 但在cDNA和DNA水平上，不同施肥方式对细菌丰度的影响趋势是一致的，在平衡施肥的基础上进行秸秆还田均增加了土壤细菌的数量. 大量的研究表明，秸秆还田显著增加了土壤微生物量碳和微生物量氮的含量[25]以及土壤微生物的物种丰富度指数和优势度指数[26]，但从cDNA水平研究施肥和秸秆还田对土壤细菌丰度的影响比较少. 本研究也发现，稻田土壤中存在及转录的细菌数量均与土壤微生物量氮含量密切相关，这与前人研究结果相一致[27]. 同时，本研究结果也表明，不管在DNA水平还是cDNA水平研究施肥对土壤细菌丰度的影响均是可行并可信的.
cDNA和DNA水平上,细菌群落产生明显分异. 148 bp t-RFs在cDNA水平T-RFLP图谱中，平均相对丰度高达36.98%，但在DNA水平没有检测到. 利用网络在线服务(http://trflp.limnology.wisc.edu/index.jsp) PAT工具(The T-RFLP Phylogenetic Assignment Tool)可以得到，148 bp与喜盐芽孢杆菌(X62174，厚壁菌门)末端片段一致[28]. 可以推测，中国南方亚热带稻田土壤喜盐芽孢杆菌属(Halobacillus)细菌大量转录. Zhang等[29]研究表明，在中国亚热带区域，Ca离子通过径流大量流失. 陈同庆等[30]对6种不同土地利用Ca离子质量分数的调查研究表明，受降雨溶蚀作用的影响，稻田和积水洼地Ca离子被截留，使得水溶性钙和全钙含量均显著高于其他土地利用方式. 本课题组的研究表明，尽管在DNA水平喜盐芽孢杆菌属只有少量甚至监测不到，但cDNA水平却大量转录，证明了微生物对环境的适应性.
本研究依托的定位试验尽管只开展了3 a，但不管在DNA水平还是cDNA水平，施肥和秸秆还田均对土壤细菌的丰度和群落结构产生了显著的影响. 相比较旱地而言，稻田土壤细菌对施肥的响应更迅速. 蒙特卡洛检验表明，稻田土壤铵态氮含量是调控土壤中存在及转录的细菌群落的关键因子. 水田环境中土壤氮素以铵态氮为主要存在形态[31]，本研究也表明施肥和秸秆还田增加了稻田土壤铵态氮含量，进一步影响了细菌群落结构. 施肥和秸秆还田不仅造成了细菌群落结构的分异，同时也在DNA水平上降低了土壤中存在的细菌多样性. 尽管化肥和有机物配合施用被认为是一种有效缓解大量化肥投入带来的不利影响的农业措施[32]，但本研究表明，稻田土壤在平衡施肥的基础上秸秆还田，虽然能够增加土壤肥力，但并不能缓解施肥对土壤细菌多样性产生的不利影响. 这也与孙瑞波等[12]在旱作农田的研究结论相一致. 因此，对南方稻田土壤秸秆还田的利用方式还需要进一步地研究，以期达到农业生产效益和生态效益的并重.
4 结论(1) DNA和cDNA水平的对比研究，可以有效揭示土壤中存在以及转录的微生物对外界环境的响应，但细菌丰度和细菌群落分布对施肥的响应不同. DNA和cDNA水平上，不同施肥方式对存在或转录的细菌丰度的影响趋势是一致的； 但存在或转录的细菌群落产生明显分异，土壤中很少存在的某些种群(如喜盐芽孢杆菌属，Halobacillus)却大量转录，同时施肥和秸秆还田降低细菌多样性的现象也只在DNA水平发现. 此研究说明，不管在DNA水平还是cDNA水平，研究施肥对土壤细菌丰度的影响均是可行并可信的； 但只有在cDNA水平开展研究，才能有效发现细菌群落对环境的适应性.
(2) 尽管本研究依托的定位试验只开展了3 a，但亚热带稻田土壤存在及转录的细菌数量和群落均对施肥产生了明显的响应，此响应速度明显快过旱地农田系统. 稻田土壤中铵态氮含量是调控土壤中存在及转录的细菌群落的关键因子.
(3) 稻田土壤在平衡施肥的基础上秸秆还田，虽然能够增加土壤肥力，但并不能缓解施肥对土壤细菌多样性产生的不利影响. 因此，对南方稻田土壤秸秆还田的利用方式还需要进一步的研究，以期达到农业生产效益和生态效益的并重.
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